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Dra. Lúcia Martins Teixeira Instituto de Microbiologia UFRJ Enterococcus identificação e susceptibilidade a antimicrobianos (e outros gêneros de cocos catalase negativos - relacionados) índice Enterococcus Gênero Enterococcus Enterococcus: habitat Enterococcus : patogenicidade Infecções Enterocócicas Riscos de aquisição de infecção enterocócica Isolamento de enterococos identificação de enterococos e bactérias relacionadas Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos Key tests Estudos Taxonômicos em Enterococcus e Gêneros Relacionados Resistência de Enterococcus a Antimicrobianos Enterococcus Emergência de novos perfis e mecanismos de Resistência a Antimicrobianos Resistência a Níveis Elevados Antimicrobial resistance among enterococci causing hospital infections Resistência a Glicopeptídeos em Enterococcus Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos continua índice Métodos de tipagem Métodos de triagem Interpretação de testes Novos antimicrobianos para o tratamento de infecções por VRE Isolamento de VRE a partir da Microbiota Intestinal Estudos epidemiológicos nas infecções enterocócicas Métodos de tipagem de enterococos Ocorrência de resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos entre enterococos de origem clínica humana Resistência à Vancomicina em Enterococos no Brasil Emergências Cocos Gram-Positivos Intrinsicamente Resistentes a Vancomicina Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos Infecções por Microrganismos Characteristics of patients with urinary tract infections caused by Leuconostoc pseudomesenteroides Clinical sources and diagnosis and/or infections associated with 72 Pediococcus isolates O gênero inclui bactérias anteriormente classificadas como Streptococcus do grupo D Enterococcus sp. em cultura de sangue Streptococcus faecalis Streptococcus faecium Gênero Enterococcus (1984) Enterococcus 1899,Thiercelin: diplococos Gram +, de origem intestinal 1906, Andrewes & Holder: Streptococcus faecalis 1919, Orla-Jensen: Streptococcus faecium 1933, Lancefield: classificação sorológica estreptococos 1937, Sherman: piogênicos, láticos, enterococos e viridans 1970, Kalina:proposta da criação do gênero Enterococcus 1984, Schleifer & Kilpper-Balz: criação do gênero Enterococcus através de estudo de DNA 1984- ......: inclusão de várias espécies no gênero Histórico Enterococcus E. faecalis Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. faecium Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. avium Collins et al. 1984 E. casseliflavus Collins et al. 1984 E. durans Collins et al. 1984 E. gallinarum Collins et al. 1984 E. malodoratus Collins et al. 1984 E. hirae Farrow & Collins 1985 E. mundtii Farrow, Collins & Jones 1986 Gênero Enterococcus E. faecalis* Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. faecium* Schleifer & Kilpper-Bälz 1984 E. avium* Collins et al. 1984 E. casseliflavus* Collins et al. 1984 E. durans* Collins et al. 1984 E. gallinarum* Collins et al. 1984 E. malodoratus Collins et al. 1984 E. hirae* Farrow & Collins 1985 E. mundtii* Farrow, Collins & Jones 1986 E. raffinosus* Collins et al. 1989 E. solitarius Collins et al. 1989 E. pseudoavium Collins et al. 1989 E. cecorum Williams et al. 1989 E. columbae Devriese et al. 1990 E. saccharolyticus Rodrigues & Collins 1990 E. seriolicida Kusuda et al. 1991 E. dispar Collins et al. 1991 E. sulfureus Martinez-Murcia & Collins 1991 E. flavescens Pompei et al. 1992 E. asini de Vaux et al. 1998 E. haemoperoxiidus Svec et al. 2001 E. moraviensis Svec et al. 2001 E. villorum Vancanneyt et al. 2001 E. porcinus Teixeira et al. 2001 E. ratti Teixeira et al. 2001 E. gilvus Tyrrell et al. 2002 E. pallens Tyrrell et al. 2002 E. phoeniculicola Law-Brown & Meyers, 2002 E. canis De Graef et al. 2002 3 Novas Espécies ........ Carvalho et al. 2004 Gênero Enterococcus Trato gastrintestinal Trato geniturinário Cavidade oral Solo, água, vegetais e alimentos Sobrevive em ambientes contaminados Enterococcus resistente: habitat Enterococcus oportunista : patogenicidade E. faecalis : 80-90% das infecções em seres humanos E. faecium : segundo (5-10%), exceto em caso de surtos Infecções do trato urinário (15%) Infecções de feridas Bacteremias (7%) [Endocardites (15-20 %)] Infecções pélvicas, intra-abdominais PATÓGENO HOSPITALAR OPORTUNISTA EMERGENTE Obs: Aparece no ambiente hospitalar: 1960 Origem Endógena Exógena Aquisição/ Transmissão Comunitária Hospitalar Infecções Enterocócicas FATORES/MECANISMOS DE VIRULÊNCIA Aderência (hemaglutininas; substância de agregação) Citolisinas (hemolisina/bacteriocina) Invasão (substância de agregação; translocação intestinal) Lise dependente do complemento Resistência à lise pelos neutrófilos Resistência a antimicrobianos Enterococcus: patogenicidade Fatores relacionados com o microrganismo Distribuição ubiquitária fontes endógena exógena (comunitária e hospitalar) Marcadores importantes - resistência a phs e temperaturas variados - capacidade de adquirir resistência aos antimicrobianos - resistência a níveis elevados de: aminoglicosídeos, b-lactâmicos, glicopeptídeos Emergência de novos padrões de resistência - vantagens seletivas : - sobrevivência - disseminação Favorecimento da patogenicidade Riscos de aquisição de infecção enterocócica Fatores relacionados com o hospedeiro doença de base grave hospitalização prolongada (uti; unidades renais, oncológicas) cirurgia (cardiovascular, abdominal) cateterização (urinária, venosa) terapia antimicrobiana prolongada : Cefalosporinas Aminoglicosídeos Fluoro-quinolonas Glicopeptídeos Fatores Relacionados com o Ambiente Hospitalar transmissibilidade pressão seletiva pelo uso de antimicrobianos Riscos de aquisição de infecção enterocócica Isolamento de enterococos Seleção do espécime clínico Coleta Transporte Semeadura: Meios Simples Meios Enriquecidos Meios Seletivo-Indicadores identificação de enterococos e bactérias relacionadas gênero van gás pyr lap be nacl cresc. a: hem 10oc 45oc Cadeias Streptococcus S - - + - - V V - a/b/n Enterococcus S/R - + + + + + + V a/b/n Vagococcus S - + + + + + (-) V a/n Lactococcus S - + + + V + (-) - a/n Leuconostoc R + - - V V + V - a/n Weissella R + - - V + V V - a/n Abiotrophia S - + + - - - - - a Globicatella S - + - - + - - - a Agrupados e Tetrades Pediococcus R - - + + V - + - a Tetragenococcus S - - + + + - + - a Aerococcus S - + - V + - + - a Gemella S - + V - - - - - a/n Helcococcus S - + - + + - - - n Alloiococcus S - + + - + - - - n Dolosigranulum S - + + - + - - - n Facklamia S - + + - + - - - n Ignavigranum S - + + - + - - - a Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos Moti- lidade Identificação de enterococos Métodos convencionais Identificação presuntiva Observação da morfologia colonial e padrão de hemólise Características morfotintoriais Avaliação fisiológica preliminar: - Catalase - BE - NaCl 6,5% - LAP - PYR - Vanco Caracterização fisiológica Testes convencionais (bioquímicos e sorológicos) Sistemas rápidos (API 20S, Rapid Strep) Sistemas automatizados (VITEK, MicroScan) Pesquisa de pgmento Motilidade Características fenotípicas de enterococcus e gêneros relacionados Espécies MAN SOR ARG ARA SBL RAF TEL MOT PIG SAC PIR MGP Grupo I E. E. avium avium + + + + - + + - - - + + - - - - - + - + + + + + E. E. malodoratus malodoratus + + - - + + + - - + + - - + - - - + - + + - + - E. E. raffinosus raffinosus + + + + - + + - + + + - - + - - - + - + + + + + E. E. pseudoavium pseudoavium + + - - + + + - - + - - - - - - - + - + + + + + E. E. saccharolyticus saccharolyticus + + + + - - + - - + + - + - - - - + - + - + - + Grupo II E. faecalis E. faecalis +* - +* - +* - + +* - + - + - - + - - +* - +* + - + - L. L. garvieae garvieae + - + - + - - + - - - - - - - - - v - v - - - - E. faecium E. faecium +* - +* - + + v + + v v - v - - - - +* - +* - - - - E. casseliflavus E. casseliflavus + - + - +* + v + -* +* + -* +* +* + +* + v + v + E. E. mundtii mundtii + - + - + + v + + v + - + - - - + + + + - - - - E. E. gallinarum gallinarum + - + - +* + - +* + - + - + - +* +* - + - + - + - + Características fenotípicas de enterococcus e gêneros relacionados Key tests, including methyl a -D- glucopyranoside and efrotomycin tests, for the identification of the group II enterococcal species Perfis de proteínas totais Sondas p/ genes específicos. Ex. Enterococcus GenProbe PCR para: D-alanil-D-alanina ligase (E. faecalis e E. faecium) vanC-1 (E. gallinarum) vanC-2/3 (E. casseliflavus, “E. flavescens”) (ITS-PCR) entre 16S e 23S rRNA Sequenciamento dos genes 16S Hibridização de DNA Identificação de enterococos Métodos moleculares Caracterização Fenotípica Convencional Análise dos Perfis de Proteínas (SDS-PAGE) Hibridização DNA/DNA Seqüenciamento do genes 16S rRNA Estudos Taxonômicos em Enterococcus e Gêneros Relacionados Resistência Intrínseca Aminoglicosídeos (níveis baixos) b-lactâmicos (valores de CIM relativamente elevados) Lincosaminas (níveis baixos) Trimetoprim-Sulfametoxazol (somente “in vivo”) Vancomicina (E. casseliflavus, E. gallinarum) Resistência adquirida (plasmídeos e transposons) Aminoglicosídeos (níveis elevados) Estreptomicina: ribossômica / adenil-transferase Gentamicina: acetil-transferase + fosfo-transferase b-lactâmicos (alteração das PBPs; produção de b-lactamases; tolerância) Glicopeptídeos ( VanA, VanB, VanD, VanE) Fluoroquinolonas Lincosaminas (níveis elevados) Macrolídeos Rifampicina Tetraciclinas Resistência de Enterococcus a Antimicrobianos Resistência a Níveis Elevados de Aminoglicosídeos Resistência a Níveis Elevados de b-Lactâmicos Resistência a Glicopeptídeos Enterococcus Emergência de novos perfis e mecanismos de Resistência a Antimicrobianos CMIs > 2000 µg/ml : resistência ao sinergismo Mecanismos de resistência: (plasmídios/transposons): Enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAS) AAC(6’)-Ie + APH(2’’)-Ia AAC(6’)-Ii APH(2’’)-Ib ; APH(2’’)-Ic ; APH(2’’)-Id APH(3’)-IIIa ANT(3’)-Ia ; ANT(4’)-Ia ; ANT(6’)-Ia Alteração do sítio alvo (Resistência ribossômica/estreptomicina) Resistência a Níveis Elevados de Aminoglicosídeos Resistência a Níveis Elevados de b-lactâmicos 1981, 1o relato de amostra produtora de b-lactamase Gene tem localização plasmidial (associado a HLR-GE) Amostras resistentes à penicilina (E. faecium) têm sido relatadas há décadas (CMIs 8-64 µg/ml) Amostras resistentes a níveis mais elevados têm sido relatadas com mais freqüência atualmente Modificação das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) Produção de b-lactamase Vancomycin-resistant enterococci Non-Intensive Care Unit Patients Intensive Care Unit Patients Antimicrobial resistance among enterococci causing hospital infections Source: National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System 0 5 10 15 20 25 30 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Percent Resistance Fenótipo Van A Van B Van C CMI (mg/ml): Vancomicina 64 - >1000 4 - >1000 2-32 Teicoplanina 16 - 512 0,5 - 1 0,5-1 Expressão Induzida Induzida Constitutiva Localização Plasmídeos Cromossomo Cromossomo dos genes Cromossomo Plasmídeos Genótipo vanA vanB vanC Produtos D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser Espécies E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecalis E. faecalis E. casseliflavus E. avium E. durans E. mundtii E. casseliflavusE. gallinarum Resistência a Glicopeptídeos em Enterococcus Resistência a Glicopeptídeos em Enterococcus Importância da Aderência a Padronização Execução, Controle de Qualidade Interpretação Importância de Manutenção Constante de Atualização no Tema Importância de Avaliação Crítica dos Resultados TSA para Enterococcus Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos Interpretação dos resultados Gentamicina e Estreptomicina: > 1 colônia / cresc. em caldo = resistente O sinergismo obtido entre gentamicina ou estreptomicina e antimicrobianos de ação na parede (ampicilina, penicilina e glicopeptídeos) não ocorrerá. Vancomicina: >1 colônia = resistência presuntiva Realizar testes de motilidade e pigmento para distinguir espécies com resistência adquirida (VanA e VanB) daqueles com resistência intrínseca a níveis intermediários de vancomcina (E. gallinarum, E. casseliflavus) Métodos de triagem Métodos de triagem Meio de cultura BHI Agar ou caldo suplementado com: 500 µg /ml de Gentamicina (agar ou caldo) 2000 µg /ml (agar) / 1000 µg/ml (caldo) de Estreptomicina 6 µg /ml de Vancomicina (agar) Inóculo Suspensão a partir de um crescimento de 18-24h com turvação padrão 0.5 McFarland (108 UFC/ml) “Spot” de 10 ml na superfície do agar = 106 UFC/ml (genta e estrepto) “Spot” de 1-10 ml na superfície do agar = 106 UFC/ml (vanco) Incubação 24h, 35oC, ar ambiente (Genta e Vanco) 24-48h, 35oC, ar ambiente (Estreptomicina) Métodos de Triagem para a Detecção de Resistência a Níveis Elevados de Aminoglicosídeos (HLR-A) em enterococos Métodos de triagem para a detecção de resistência a vancomicina em enterococos Parâmetro Triagem em Agar Difusão (disco) Meio BHI agar MHA Antimicrobianol (Concentração) 6 µg/ml 30 µg/ml Inóculo 105 - 106 CFU/spot 0.5 McFarland Incubação (h) 24 24 Leitura > 1 colônia > 17mm = susceptível (Interpretação) 15-16mm = intermediário < 14mm = resistente Interpretação de testes de susceptibilidade para Enterococcus (métodos de difusão e de diluição: NCCLS, 2004; M100-S14) Diâmetro(mm) CIM (g/ml) Grupo Antimicrobianos S I R S R A Ampicilina (10 g) 17 - 16 8 16 A Penicilina (10 U) 15 - 14 8 16 B Vancomicina (30 g) 17 15-16 14 4 32 Inv Teicoplanina (30 g ) 14 11-13 10 8 32 C Eritromicina (15 g) 23 14-22 13 0.5 8 C Estreptomicina (300 g ) 10 7 - 9 6 C Gentamicina (120 g ) 10 7 - 9 6 C Tetraciclina (30 g ) 19 15-18 14 4 16 U Ciprofloxacina (5 g) 21 16-20 15 1 4 Grupos de Agentes Antimicrobianos que devem ser considerados em testes de rotina para Enterococcus * * * Agência Nacional de Vigilância Sanitária Apoio: Grupos de Agentes Antimicrobianos que devem ser considerados em testes de rotina de Enterococcus e Staphylococcus Grupo Enterococcus Staphylococcus A Penicilina Oxacilina Ampicilina Penicilina B Vancomicina Azitromicina Quinipristina/Dalfopristina Claritomicina Linezolide Eritromicina Clindamicina Linezolide Sulfa-Trimetoprim Vancomicina C Gentamicina (HLR) Cloranfenicol Streptomicina (HLR) Ciprofloxacina Levofloxacim Ofloxacim Cloranfenicol Galifloxacim Eritromicina Quinopristina/Dalfopristina Tetraciclina Gentamicina Rifamicina Rifampicina Tetraciclina U Ciprofloxacina Lomefloxacim Levofloxacim Norfloxacim Norfloxacim Nitrofurantoina Nitrofurantoina Sulfa-Trimetoprim Tetraciclina Trimetoprim Quinupristin-Dalfopristin Associação de estreptogramina B + estreptogramina A (30:70). Tratamento de infecções por E. faecium Van R Aprovado em Dez/1999 Linezolid oxazolidinona Aprovado em Abr/2000 Resistência tem sido documentada em amostras de origem humana e animal Novos antimicrobianos para o tratamento de infecções por VRE Isolamento de VRE a partir da Microbiota Intestinal Estudos epidemiológicos nas infecções enterocócicas Aumento dos casos de infecção enterocócica Isolamento de amostras com padrões de resistência incomuns Atipia fenotípica (ex: E. Faecium, raf +, sbl + ou man -, sac -) surto ? Identificação a nível de espécie de todas as amostras Triagem da resistência origem ? Tipagem molecular Clone único ? multiclonal ? Métodos de tipagem de enterococos Biotipagem Resistotipagem Bacteriocinotipagem Fagotipagem Sorotipagem Fenotípicos Análise dos Perfís de Proteínas Tot. Análise do Polim. Eletr. de Isoenz. Genotípicos Análise dos Perfís Plasmidiais Análise do DNA cromossômico PFGE Ribotipagem Reação da Polimerase em Cadeia AP-PCR, RAPD-PCR, Rep-PCR, ITS-PCR, etc ..... Sequenciamento MLST Métodos convencionais Métodos moleculares Ocorrência de resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos entre enterococos de origem clínica humana Stern et al., 1994 : 39% Merquior et al., 1997 : 55% Carvalho,1998 : 50% Mendonça, 1998: 43% Paula, 2000: 38,5% Mondino et al, 2003: 52,2% % 0 10 20 30 40 50 60 Presente estudo Stern et al., 1994 Carvalho, 1998 Merquior et al.,1997 Mendonça, 1998 Paula, 2000 Resistência à Vancomicina em Enterococos no Brasil 1996 - Curitiba E. faecium vanD4 Hemocultura de criança ( F ) portadora de anemia aplásica submetida a transplante de medula. MICs: Vanco = 256 µg/ml Teico = 4 µg/ml HLR-Ge/St Adulto ( F ) com meningite 1997 - São Paulo E. faecium vanA VRE tornou-se endêmico no hospital Amostras de VRE passaram a ser detectadas em outros hospitais de São Paulo Emergência de VRE Rio de Janeiro Janeiro 2000 HU-PE / UERJ. Septicemia Paciente (M 50 anos) com doença maligna hematológica e falência renal VRE isolado de: Sangue, fezes, pele e ulcera de decúbito do paciente índice Fezes de outro paciente na mesma unidade (1/8 - 12,5%) Fontes ambientais (utensílio para banho: 1/16- 6,2%) Caracterização: Enterococcus faecalis vanA; HLR-Ge MICs: Vanco > 256 µg/ml; Teico = 92 µg/ml Maio 2000 Hospital São Lucas / PUC Disseminação inter-hospitalar Enterococcus faecalis vanA MICs: Vanco = 1024 µg/ml; Teico = 256 µg /ml Perfis de PFGE relacionados entre si e a clones previamente encontrados Emergência de VRE Rio Grande do Sul Ocorrências Recentes de VRE Rio de Janeiro Rio de Janeiro: HU-PE / UERJ - Enterococcus gallinarum vanA Hospital da rede publica - E. faecalis Hospital da rede privada - E. faecium vanA Hospitais das redes publica e privada - E. faecium vanA Niterói: HU-AP / UFF - Enterococcus faecalis vanA Hospital da rede privada - E. faecium Cocos Gram-Positivos Intrinsicamente Resistentes a Vancomicina : Patógenos Emergentes Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Características Fenotípicas de Cocos Gram-Positivos Catalase-Negativos Gênero VAN GÁS PYR LAP BE NaCl Cresc. a: MOT HEM 10oC 45oC Cadeias Streptococcus S - - + - - V V - a/b/n Enterococcus S/R - + + + + + + V a/b/n Vagococcus S - + + + + + (-) V a/n Lactococcus S - + + + V + (-) - a/n Leuconostoc R + - - V V + V - a/n Pediococcus R - - + + V - + - a Infecções por Microrganismos do Gênero Leuconostoc em Pacientes Residentes Rio de Janeiro Sexo, idade paciente Espécimen clínico Doença subjacente Fatores de risco Espécie identificada L. Uso de cefalo 3a M, 32a pseudomesenteroides Sangue Hospitalar SIDA geração, SFT cateter IV F, 51a L. pseudomesenteroides Cateter Hospitalar Artrite Cateter IV F, 50a L. lactis Sangue Comunitária - Prótese válvula cardiaca F, 76a L. citreum Sangue Hospitalar Insuficiência Uso de vanco renal e cateter IV L. M, 58a pseudomesenteroides Sangue Hospitalar Insuficiência Uso de vanco renal e cateter IV Aquisição Characteristics of patients with urinary tract infections caused by Leuconostoc pseudomesenteroides Patient no. Age (yr), sex Underlying conditions Associated symptoms Concn of organism in urine CFU/ml Clinical outcome Previous therapy 1 16,M 2 29, M 3 14, F 4 18, F 5 37, F Hydrocephalus and prolonged hospital stay Asthma, alcoholism and drug addiction Renal transplantation and prolonged hospital stay Endometriosis and prolonged hospital stay Not determined Vanco and cephalosp None Vanco and trimeth-sulfamet Vanco and cephalosp None Fever Dysuria and fever Dysuria Dysuria and fever Dysuria and fever 5 x 105 5 x 105 3 x 105 4 x 105 4 x 105 Death Recovery Recovery Recovery Recovery Clinical sources and diagnosis and/or infections associated with 72 Pediococcus isolates Blood 28 Stool 8 Peritoneal fluid 4 Abscess 3 Urine 3 Wound 2 Catheter Bone 1 CFS 1 Liver biopsy 1 Vaginal secretion 1 Unknown 2 Total 54 Congestive heart failure (1) endocarditis (1), septicemia (5), peritonitis (1), peptic ulcer (1), Hickman line infection (1), bone marrow transplant (1), cellulitis (1), unknown (16) Diarrhea (7), Unknown (1) Rectal carcinoma (1), fistula (1), colitis (1), peritonitis (1) Rectal carcinoma (1), Crohn’s disease (2) UTI (1), unknown (2) Entritis (1), unknown (1) Bone cyst Unknown Liver transplant Vaginitis Clinical isolates Strains associated with different clinical conditions P. acidilactici P. pentosaceus No. Condition(s) (no. of strains) No. Condition(s) (no. of strains) 4 Coronary artery disease (1) septicemia (1), unknown (2) 3 Diarrhea 1 Peritonitis 2 Unknown 2 Pneumoniae (1), unknown (1) 3 Abdominal surgery (1), coronary artery disease (1), unknown (1) 1 Bone infection 2 18 * * FLUXOGRAMA BGN Oxidase - Lac + Lac - E.coli Enterobacter Klebsiella Kluyvera Citrobacter Shigella Salmonella Serratia Proteus Providencia Morganella Ágar Mac Conkey IAL IAL Cit. Simmons Cit. Simmons + Enterobacter Klebsiella Kluyvera Citrobacter - E.coli VP + Salmonella Serratia Proteus/Prov.(V) - Shigella Morganella +
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