Sintese (5)

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Síntese de RNA : Transcrição
Objetivos:
Discutir as etapas da transcrição em procariotos e eucariotos;
Estabelecer as diferenças existentes entre estes processos.
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Tipos de RNA
mRNA (1 a 5%)  molde para síntese protéica;
tRNA (10-15%)  transporte de aminoácidos;
rRNA (80%)  compõe os ribossomos;
snRNA  pequenos RNAs nucleares com funções estruturais e catalíticas;
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Aspectos Gerais da Transcrição
A transcrição espelha o estado fisiológico da célula;
Iniciada (promotor) e terminada (terminador) em pontos específicos do DNA;
A célula deve controlar quando e quanto de RNA deve ser sintetizado;
É o principal ponto de controle da expressão gênica;
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 Transcrição 
Apenas uma das fitas do DNA é usado como molde num determinado gene;
O RNA é complementar a fita de DNA molde (fita anti-senso);
Segue as mesmas regras de pareamento da replicação exceto pela pareamento da Uracila (U) com a Adenina (A);
A seqüência do RNA é idêntica a fita de DNA codificador (fita senso);
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 Transcrição 
Por convenção d seqüência de nt. de um gene é representada apenas pela fita de DNA codificadora ou senso (5’3’)
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RNAP de E. coli
RNAP única;
Componentes:
Núcleo da enzima (três subunidades: ,  e ’; 2’);
Subunidade sigma ()  adicionado ao núcleo forma a holoenzima (plenamente funcional);
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Reconhecimento do promotor e início da transcrição
O núcleo da RNAP (2’) tem afinidade pelo DNA;
A adição do fator  permite ao complexo reconhecer e ligar-se firmemente ao promotor; 
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 RNA-polimerase (RNAP)
Reconhecem e se ligam a seq. específicas de DNA;
Separam (denaturam) a hélice dupla do DNA, expondo os nt. a serem copiados;
Mantêm as fitas de DNA separadas na região de síntese;
Mantêm estável o híbrido de DNA:RNA na região de síntese;
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 RNA-polimerase (RNAP)
Renaturam o DNA na região imediatamente posterior à síntese;
Sozinhas ou com auxílio de proteínas específicas, terminam a síntese do RNA.
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 RNA-polimerase (RNAP)
Catalisam a reação do grupamento 3’OH de um ribonucleotídeo com o grupamento fosfato do carbono 5’ do ribonucleotídeo trifosfatado a ser incorporado;
Não necessitam de primers para iniciar a reação;
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 RNA-polimerase (RNAP) 
1° nt. da seqüência de DNA copiado para o RNA é chamado de sítio de início da transcrição (demarcado como sítio +1);
Nt. antes deste sítio (5’ou upstrean) recebem sinal negativo; 
Nt. após este sítio (3’ou downstrean) recebem sinal positivo; (fig. 1)
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Processo de transcrição em procariotos
Quatro etapas:
Reconhecimento de seq. específicas de DNA (promotor);
Formação do complexo de iniciação (abertura da dupla hélice do DNA);
Alongamento do RNA;
Terminação. 
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Promotor
Seq. específica do DNA onde a RNAP se liga iniciando a transcrição;
Demarcam onde estão as regiões transcritas;
Seqüências consenso;
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Promotor
O primeiro nt. a ser transcrito(+1) geralmente é uma purina (A ou G);
Duas seq. são altamente conservadas (fator 70):
Uma na região –10 (TATAAT)TATA box;
Outra na região –35 (TTGACA);
As regiões –10 e –35 são separadas por 17 a 19 nt.
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Promotor
Promotores fracos:
Diferem um pouco na seq. consenso (TATA box);
Promotores fortes:
Seq. muito parecidas com a consenso;
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Funcionalidade dos promotores
Deleção das regiões –10 e/ou –35 bloqueia totalmente a transcrição;
Alterações em nt. individuais nestas regiões alteram a eficiência da transcrição;
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Início da transcrição
Diferentes grupos de promotores:
 diferentes fatores ;
 diferentes seq. consenso; 
 maioria dos genes utiliza o fator 70;
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Início da transcrição
Reconhecimento do promotor pela holoenzima:
Complexo de iniciação fechado;
Abertura do complexo de iniciação(região –10);
A enzima adiciona até 9 nt na cadéia de RNA sem se deslocar;
O fator  impede o deslocamento (iniciação abortiva)
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Início da transcrição
Após o desligamento do fator  a RNAP se desloca e prossegue na transcrição;
O promotor fica livre para que novas RNAP se liguem;
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Alongamento da Cadeia
Alteração conformacional na RNAP;
Na região de contato da RNAP com o DNA 18 pb estão desnaturados (abertos);
A fita molde de DNA pareia nesta região com a fita de RNA (hélice tipo A);
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Alongamento da Cadeia
Funções da RNAP:
Abrir a hélice dupla, a frente, na direção da transcrição;
Manter a hélice aberta e a estabilidade do DNA e RNA;
Reconhecer se o rbnt. é o correto de acordo com o molde de DNA;
Catalisar a incorporação do rbnt. a cadeia de RNA;
Iniciar a liberação da cadeia de RNA sintetizada;
Refazer o pareamento do DNA em sua região anterior.
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Término da transcrição
Terminação rho independente (90%);
Terminação rho dependente
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Terminação rho independente
90% dos genes em E. coli;
Seqüência definida no gene sinaliza o final da transcrição;
Seq. invertida e repetida seguida de uma seq. de As na fita molde (Us no RNA);
Forma estrutura em alça (grampo de terminação)pausa;
Pareamento U:A logo em seguida desestabiliza o híbrido DNA:RNA, liberando o RNA;
É auxiliado pela proteína NusA;
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Terminação rho dependente
Não há formação de estruturas específicas no RNA;
As seq. sinalizadoras da terminação estão espalhadas por cerca de 100 pb;
Sem a proteína rho estas seqüências são inativas;
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Proteína rho 
Tem atividade de ATPase e liga-se ao DNA;
Separa híbridos DNA:RNA (helicase);
Liga-se ao RNA nascente e move-se em direção a bolha de replicação (em pausa);
Desestabiliza o complexo de transcrição;
Acoplamento da transcrição e tradução em procariotos;
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Transcrição em Eucariotos
Segue as mesmas etapas da transcrição em procariotos (Iniciação, Alongamento e Terminação);
Complexo e diversificado;
Tecido-específico;
Separação espacial entre a transcrição e tradução.
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Transcrição em Eucariotos
As RNAP de eucariotos sempre necessitam de fatores de transcrição (FT);
Os FTs reconhecem e se ligam a seq. do promotor formando o complexo no qual a RNAP se liga;
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Transcrição em Eucariotos
Seq. reguladoras em eucariotos:
Elementos promotores (upstream);
Elementos reforçadores (enhancers).
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RNAP I
Pré – rRNA (rRNAs 18S; 5,8S e 28S);
80% dos RNAs da célula;
Promotor com 2 domínios:
-45 a +20 (núcleo do promotor);
-180 a -107 (elemento controlador upstream – UCE);
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RNAP II
hnRNAs (mRNAs não processados);
Promotor:
Sítio de início da transcrição (C/T)2CA(C/G)5;
TATA box – região de 8 pb rica em AT (-25) onde se liga o fator geral de transcrição TFIID;
CAAT box – seq. GGNCAATCT (-75) onde se liga o fator de transcrição (CTF);
GC box – região rica em GC (-90) onde se liga o fator SP1;
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RNAP II
TFIID (TBP+10 fatores) se liga ao TATA box;
Alterações na dupla hélice induzidas pela TFIID levam a ligação de uma série ordenada de outros fatores de transcrição e da RNAPII;
Esse complexo é responsável pelo nível basal de transcrição, a ligação de outro complexo protéico (mediador) permite a regulação dos níveis de transcrição.
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RNAP III
rRNA 5S, tRNAs, snRNA U6(splicing) e rRNA 7S (10%);
Dois tipos de promotores
Semelhante ao da RNAPII;
Elementos reguladores internos (rRNA 5S e tRNAs);
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Promotores de tRNA
Duas regiões:
Região A (+8 a + 19) com consenso T(A/G)GCAG(T/C)GG;
Região B
(+52 a +97) com consenso GGTTCGATCC
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Terminação
As 3 RNAP nucleares terminam a transcrição em seq. ricas em T;
RNAPIII  seq. terminadoras semelhantes aos dos terminadores rho independentes de procariotos;
RNAPII  seq. difusas 
			  RNA é clivado antes do termino da transcrição na região do sinal de poliadenilação