MICROBIOLOGIA - Manual de laboratório

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Olga Martins Marques (ProfaUNICAP - DQ) 
Alexandra Amorim Salgueiro (Profa UNICAP -DQ) 
Maria Alice Gomes de Andrade Lima (ProfaUFPE-DEQ) 
Maria de Los Angeles Peres Palha (Profa UFPE - DEQ) 
 Sonia Ma Souza Cavalcante de Albuquerque (Profa UFPE -DEQ) 
 
 
 
 
 
 
 
Recife - Pernambuco 
 
1998 
 
 
2
 
 
Apresentação 
 
 
 
 
 A inexistência de um texto de práticas de Microbiologia 
Geral adaptado às nossas condições do nosso laboratório, e destinado 
aos cursos superiores de Engenharia Química, Química Industrial e 
outros, nos motivaram à realização deste manual. Os experimentos 
foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos 
no programa referentes à primeira unidade do curso e podem ser 
facilmente efetuados em laboratórios de recursos limitados. 
 Cada experimento, poderá ser efetuado por um grupo de 
dois ou mais alunos. Muitas vezes o experimento pode ser dividido 
entre vários grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o 
experimento numa determinada condição. Neste caso, o instrutor dever 
fazer uma discussão a posteiori e global do problema apresentado. 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA N°°°° 1 
OBJETIVOS: 
• Discriminar as funções e/ou aplicações 
• Limpar 
• Acondicionar 
 
 
1. FUNÇÕES E/OU APLICAÇÕES DO MATERIAL DO 
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
 
1.1. Material Permanente 
 
a. Autoclave - câmara de vapor com parede dupla, equipada com 
dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor 
saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e pressão 
por quaisquer períodos de tempo. O autoclave é um equipamento 
indispensável ao laboratório de microbiologia na esterilização de 
meios de cultura, água, suspensões etc.(ver modo de operação) 
 
 
b. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco 
toda vidraria convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 
a 200o C por 1-2 horas. 
 
c. Refrigerador - utilizado na conservação de culturas de 
microrganimos sob baixa temperatura, diminuindo o tempo de 
geração 
 
d. Estufa bacteriológica - favorece o crescimento de microrganismos 
pela incubação na temperatura adequada. 
 
Incubação = manutenção do meio semeado em determinadas 
condições para promover o desenvolvimento dos microrganismos. 
e. Mesa agitadora (rumbeira) - favorece o crescimento de 
microrganismos aeróbios, pela dissolução do oxigênio no meio, 
através da agitação da mesa, em movimentos rotatórios. 
 
f . Cabine de fluxo laminar - câmara asséptica, dotada de exaustor e 
lâmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos 
 
g. Fermentador - equipamento onde ocorrem as fermentações, podendo 
ser dotado de sistemas de agitação, aeração, refrigeração. 
 
 
 
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1.2. Vidraria 
 
a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de 
microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de 
culturas puras de microrganismos. 
 
b. Placa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos devido à 
grande superfície de crescimento que apresenta, possibilitando o 
aparecimento de colônias separadas. 
 
Colônia = aglomerado de células em meio sólido, geralmente 
originadas de uma única célula progenitora. 
c. Pipeta - para diluir preparações diversas e inocular culturas líquidas 
Inocular = inserir , introduzir 
Inóculo (ou semente) = concentração de células suficientes para 
cultivar uma de meio com bom rendimento 
d. Pipeta Pasteur - é um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada 
para transportar pequenos volumes de líquido 
 
e. Alça de Drigalsky - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa, 
dobrada em ângulo reto e depois em 45°C na chama. É utilizada para 
espalhar microrganismos em meio de cultura sólido. 
 
f . Balão de fundo chato- utilizado geralmente para guardar meios de 
cultura. 
 
g. Erlenmeyer - utilizado para propagação celular de microrganismos 
em meio líquido sob agitação em mesa agitadora. 
 
h. Fernbach - idem 
 
i . Lâmina - para examinar microrganismos ao microscópios 
 
Lâmina Escavada - possui uma ou duas depressões possibilitando 
observar a mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de 
l íquido (Ensaio em gota pendente) 
 
j. Lamínula - utilizada para recobrir preparações microscópicas “in 
vivo 
 
1.3.Materiais utilizados em titulações, destilações, 
preparações de solução e de meios de cultura - Bequer, bastão 
de vidro, bureta, funil, proveta, balão volumétrico, condensador dentre 
outros. 
 
 
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1.4. Diversos 
 
a.Lápis dermatográfico - utilizado para escrever em superfície de 
vidro 
b.Algodão bruto (ou cardado)- serve para proteger o material 
esterilizado, do contato com o ar ambiente. 
c.Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em três formas 
(círculo, ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma 
liga níquel-cromo, sendo utilizado em inoculação de microrganismos. 
2. DESINFECÇÃO 
 
a. Desinfecção do ar: 
 
 - através da vaporização de uma solução de hipoclorito de sódio a 
1%; 
 
 - pelo uso de lâmpadas de luz ultravioleta. 
 
 - pode ser feita periodicamente com a vaporização de uma 
solução de formalina (formol a 40%), no entanto, esta solução não se 
pode usar para a desinfecção de ambientes ocupados; 
 
 
b. Desinfecção da bancada: 
 
 Antes da realização de um determinado trabalho de 
microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma solução detergente 
seguida de uma solução alcoólica a 70%. 
 
c. Desinfecção da vidraria: 
 
 - vidraria contaminada - deverá ser inicialmente esterilizada em 
autoclave para que toda flora presente seja destruída e, em seguida 
lavada com uma solução detergente ou sabão neutro; 
 
 - vidraria sem contaminação - idem ao anterior, porém sem 
necessidade de autoclavação. 
 
Observação: não é costume se utilizar solução sulfocrômica na lavagem 
dos materiais do laboratório de microbiologia, uma vez que esta solução 
contém cromo que é um metal que pode intoxicar as células vivas e 
também por ser de difícil remoção no material 
 
 
 
 
 
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3. ACONDICIONAMENTO 
 
a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geralmente formando 
conjunto de 3 unidades. A quantidade depende da necessidade do 
trabalho. 
 
b. Pipetas - obtura-se as boquilhas com mecha de algodão (1cm) para 
filtrar o ar soprado e para proteger o operador durante a manipulação; 
em seguida são enroladas uma a uma com papel, anotando a capacidade 
de cada uma. 
 
c. Tubos de ensaio, balões de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs - 
são preparados introduzindo-se um tampão de algodão cardado na boca 
do recipiente. Esse tampão deve ser feito, enrolando o algodão no 
sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto 
é, não deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo. 
 
d. Lâminas - mergulhadas em solução alcoólica, ficam aptas a serem 
utilizadas a qualquer momento, evitando paralelamente que sejam 
arranhadas. 
 
ATENÇÃO: Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia 
antes de ser preparada para esterilização deverá estar limpa e seca. 
 
 
ESTERILIZAÇÃO EM AUTOCLAVE 
 
Operação: l igar o aparelho à rede elétrica. Após a colocação do 
material dentro do autoclave, a tampa é fechada e a torneira de remoção 
de ar ou vapor é deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o 
ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca 
de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de então a pressão 
internamente irá aumentar e chegar à pressão de esterilização usada, que 
é de 15 lb/pol2 , ou 1atm, ou 1 kgf/cm2 , correspondendo a uma 
temperatura de 1210C. O tempo deexposição do material no interior 
deste equipamento irá depender do volume de líquido a ser 
esterilizado. Para pequenos volumes, até 3 litros, podem ser 
esterilizados durante 20 a 30 minutos a uma pressão de 15 lb/pol2 . Com 
relação a maiores volumes, será necessário, uma exposição mais 
prolongada. Quando a temperatura requerida para a esterilização é 
alcançada, deve-se começar a contar o tempo, usando um relógio de 
laboratório (com alarme). Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da 
corrente elétrica e mantém-se a autoclave e a torneira de ar e vapor 
fechados, até o manômetro voltar ao ponto zero, pois quando a pressão 
da autoclave é aliviada rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e 
frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampões sejam 
arremessados para fora dos mesmos. 
 
 
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 Concluída a esterilização, abre-se a torneira de vapor; em seguida 
a tampa do autoclave é levantada. 
PRÁTICA N°°°° 2 
OBJETIVOS: 
• Trabalhar assepticamente 
• Cultivar microrganimos 
•••• Diferenciar macroscopicamente fungos, leveduras, bactérias 
INTRODUÇÃO 
 
 O homem no seu meio ambiente convive com inúmeras formas de 
vida. Os microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos 
benefícios como pelos malefícios que proporcionam ao homem, sendo 
encontrados na natureza em abundância e variedade de formas. Para que 
os mesmos sejam cultivados artificialmente é necessário conhecer suas 
exigências nutricionais e suas condições físicas de crescimento, 
trabalhar com material esterilizado e obdecer às normas de prática 
asséptica. 
 Dependendo da finalidade da operação, os microrganimos podem 
ser cultivados em: lâminas, placas, tubos, balões, fernbach ou 
recipientes de maior capacidade. O cultivo em lâmina é utilizado 
quando se deseja acompanhar microscopicamente o crescimento e 
reprodução de um microrganismo. Emprega-se o cultivo em placas 
quando se quer isolar espécies microbianas distintas, devido à extensa 
área de superfície que apresenta. Porém, devido à pequena quantidade 
de meio em exposição ao ar, com frequência ocorre ressecamento e/ou 
aparecimento de contaminações. 
 Cultivando os microrganismos em tubos, há facilidade de 
manipulação das culturas, além da vantagem de economizar meio e 
espaço físico. Para se obter grandes volumes de cultura, o 
microrganismo é cultivado inicialmente em balões, fernbach, para 
depois ser transferido para recipiente maior, cuja capacidade é função 
da necessidade do trabalho. 
 
NORMAS DE PRÁTICA ASSÉPTICA 
 
1. Não trabalhar em corrente de ar, nem ambiente agitado pelo acúmulo 
de pessoas; 
2. Não falar nem respirar em frente ao recipiente aberto contendo 
material de estudo; 
 
 
8
3. Abrir o recipiente inclinado junto à chama, onde o ar está rarefeito de 
formas vivas; 
4. Retirar o tampão de algodão com o dedo mínimo e a palma da mão 
sem tocar na boca do recipiente e sem encostar o tampão em lugar 
algum; 
5. Flambar a boca do recipiente sempre que for iniciar uma inoculação, 
para que uma corrente de ar quente seja formada de dentro para fora; 
6. Introduzir o mais rápido possível a alça ou pipeta sem tocar nas 
paredes do recipiente; 
7. Ao terminar a inoculação, flambar a boca do recipiente e ajustar o 
tampão, conservando o material ao abrigo da poeira e umidade. 
 
 
PROCEDIMENTO PRÁTICO 
• Limpar a bancada; 
• Marcar todo material (placa e tubos), especificando o tipo de meio e 
a fonte da inoculação; 
• Fundir dois meios de cultura diferentes (por exemplo AN e CZ); 
• Distribuir os meios em placas de Petri e tubos (inclinar); 
• Esperar solidificar; 
• Fazer inoculações nas superfícies dos meios distribuídos em placas;- 
Incubar na temperatura ambiente por 2 a 5 dias, não esquecendo de 
guardar placas sem inocular, uma de cada meio utilizado para 
controle da esterilização e da eficácia da técnica utilizada. 
 
FONTES: água poluída, fermento de padaria, ar, garganta, mãos, 
cabelo, suor etc. 
DIFERENCIAÇÃO MACROSCÓPICA DOS MICRORGANISMOS 
 
 Os microrganimos crescem e reproduzem quando cultivados e 
inoculados adequadamente. Podemos fazer avaliação dos grupos aos 
quais eles pertencem, por observações das características das colônias 
nos meios em que eles foram cultivados. O crescimento em meio líquido 
pode ser evidenciado pela turvação, pela formação de pequena massa de 
célula que flotam (velo) ou por sedimentação das células. Em placas de 
Petri estuda-se o crescimento dos microrganismos em meio sólido, 
observando-se o aparecimento de colônias cujos aspectos macroscópicos 
auxiliam na diferenciação de grupos microbianos. 
 
I) Descrição de colônias em placas de Petri: 
 
 
 
 
9
 Após o período de incubação preestabelecido as colônias de 
microrganismos cultivados em placas de Petri podem ser descritas de 
acordo com os seguintes critérios: 
a. forma: 
 
 
 
circular rizoide irregular filamentosa 
 
b. quanto à dimensão 
 puntiforme com menos de 1 mm de diâmetro 
 
c. cromogênese 
 
 -cor do pigmento 
 -pigmento solúvel ou insolúvel no meio 
 
 
 
d. superfície 
 
 plana ,elevada, convexa, lisa, rugosa, seca, brilhante, translúcida, 
opaca, pregueada, pulverulenta 
 
II) Descrição da cultura em caldo nutriente 
 
 O crescimento em caldo de cultura pode apresentar-se sob 
diferentes formas. 
 
a. turbidez: mais ou menos acentuada 
 
b. forma da película: uma massa de células que flutua à superfície do 
caldo 
 
 
 
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c. sedimento: depósito de células no fundo do tubo. 
 
 
 
Observação:. 
. As colônias de fungos são geralmente grandes e filamentosas, algumas 
vezes ocupam toda a placa onde estão cultivadas. 
. As colônias de leveduras são pequenas e leitosas, enquanto as de 
bactérias são menores e brilhantes sendo algumas tão pequenas que se 
denominam puntiformes. 
 
 
PRÁTICA N°°°° 3 
 
OBJETIVOS: 
 
 • Distinguir os diversos componentes de um microscópio ótico 
composto 
 • Focalizar “in vivo”: células de leveduras em suspensão, 
microrganismos (algas, protozoários e bactérias móveis em água) 
 
 
COMPONENTES DE UM MICROSCÓPIO ÓTICO COMPOSTO 
 
I - PARTE MECÂNICA: 
 
1. Base ou pé - dispositivo de tamanho e peso suficiente para assegurar 
o equilíbrio estável do instrumento, evitando trepidações; 
 
2.Corpo, braço ou coluna - haste destinada a sustentar o tubo 
microscópico e conter os mecanismos de movimento; alguns apresentam 
articulação, facilitando a observação do pesquisador; 
 
3.Tubo ou canhão microscópico - cilindro oco que serve de suporte 
para os dois sistemas de lentes (oculares e objetivas); 
 
4. Revólver - peça giratória onde ficam fixadas as lentes objetivas, 
permitindo que cada lente possa ser colocada em foco ( uma de cada 
vez), 
isto é, em coincidência com o eixo ótico; 
 
5. Platina - plataforma horizontal com uma abertura circular no centro 
por onde passam os raios luminosos. Existem platinas móveis; 
 
6. Pinça ou presilhas - alças flexíveis e ajustáveis, situadas na platina. 
São utilizadas para fixar a lâmina; 
 
 
 
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7. “Charriot”- dispositivo facultativo que permite a movimentação da 
lâmina em dois sentidos: horizontal e vertical, pela manipulação de dois 
parafusos; 
8. Sistema de cremalheira - peça munida de dentes, controlada pelos 
parafusos macrométrico e micrométrico; 
 
a) Macrométrico - ocasiona diferentes aproximações entre a objetiva e a 
preparação, variando a distância vertical de vários centímetros. Serve 
para trazer o objeto ao foco aproximado; 
 
b) Micrométrico - permite mínimos deslocamentos verticais da ordem 
de centésimos de milímetros, sendo utilizado na focalização final; 
 
Observação: Nos microscópios mais modernosexiste um único 
parafuso que oferece o controle destes dois movimentos. 
 
 
 
II - PARTE ÓTICA 
 
1. Fonte luminosa: 
 
1.1. Natural - luz solar 
1.2. Artificial - lâmpada 
1.2.1. Direta - quando a lâmpada está fixada no eixo ótico 
1.2.2. Indireta - quando se utiliza fonte luminosa anexa ao 
microscópio. 
 
2. Espelho - girando em torno de um eixo, é utilizado para refletir os 
raios luminosos; pode ser côncavo ou plano, aumentando ou diminuindo 
a intensidade da luz, respectivamente; 
 
3. Diafrágma - controla a extensão angular do feixe luminoso, 
reduzindo o ângulo do cone de luz, de modo que não exceda o diâmetro 
da objetiva após atravessar o objeto; 
 
4. Condensador - conjunto de lentes convergentes que projeta sobre a 
preparação o feixe de luz em forma de um amplo cone; por 
deslocamentos verticais diminui ou concentra a luz no objeto; 
 
5. Lentes objetivas - são as lentes que ficam próximas ao objeto, 
formando na parte superior do tubo microscópico uma imagem invertida 
e ampliada do objeto. Podem ser: a) a seco - quando o meio entre o 
objeto e a lente é o ar, podendo ser de pequeno, médio ou grande 
aumento; b) de imersão - quando a lente fica mergulhada numa camada 
de líquido; 
 
6. Sistema de lentes oculares - apresenta um conjunto de lentes: lente 
de campo (corretora) que corrige a esfericidade da imagem e a lente 
 
 
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ampliadora que atua em conjunto com o observador como uma simples 
lente de aumento, aumentando a imagem formada pela objetiva. 
 
 
MANIPULAÇÃO DO MICROSCÓPIO 
 
1. Instalação do aparelho 
 
 Retirar o microscópio da caixa ou armário pelo braço e colocá-lo 
na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir ligar a fonte 
luminosa e dispor a objetiva no revólver e regular a altura do banco, de 
maneira a permitir um trabalho confortável. 
 
 
2. Iluminação de campo 
 
 Se a luz utilizada é uma luz natural, usar a face plana do espelho, 
caso contrário, a face côncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir 
completamente a superfície do espelho e este deve estar centrado de 
maneira que o cone luminoso refletido atravesse completamente o 
condensador (que deve estar completamente levantado, com o diafragma 
aberto) bem como a abertura da platina, de tal sorte que o campo do 
microscópio (isto é, o espaço da platina visualizado com a ocular) fique 
totalmente iluminado. 
 
3. Adaptação da preparação 
 
 Colocar a lâmina contendo a preparação sobre a platina e prendê-
la, depois, com o auxílio do Charriot, deslocar o conjunto de tal forma 
que a preparação contida na lâmina, fique sobre a abertura da platina, 
perfeitamente iluminada pelo cone luminoso. 
 
4. Escolha da objetiva 
 
a) preparações a fresco (“In vivo”): trabalhar apenas com objetivas a 
seco, começando pela de menor aumento; 
 
b) preparações coradas (“In vitro”): 
 
- focalizar inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento; 
 
- girar o revólver de maneira que nenhuma das objetivas fiquem em uso; 
 
- colocar sobre a preparação uma pequena gota de óleo de imersão; 
 
- colocar no eixo ótico a objetiva de maior aumento (imersão) 
 
5. Iluminação da preparação 
 
 
 
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 Para as preparações coradas que dão imagens por absorção, usar o 
máximo de iluminação com o condensador completamente elevado e o 
diafragma totalmente aberto. Para as preparações a fresco, que dão 
imagens por refração, iluminar menos a fim de que o fenômeno seja 
mais perceptível. Começar descendo o condensador, a uns dois terços da 
sua abertura, depois olhando pela ocular, regular o cone luminoso, 
fechando aos poucos o diafrágma. 
 
 
6. Focalização 
 
 É a operação que consiste em trazer o objeto para o foco da 
objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, será vista pelo 
obsevador. A focalização consta das seguintes etapas: 
 
a) girar o revólver colocando a objetiva de menor aumento no eixo 
ótico; 
 
b) ajustar a iluminação de campo; 
 
c) centralizar a preparação; 
 
d) aproximar ao máximo a preparação, da objetiva de menor aumento, 
por meio do mecanismo de movimento. Durante este trabalho deverá ser 
observado a aproximação diretamente com a vista, não devendo ser 
utilizado a ocular; 
 
e) observando então pela ocular, imprimir movimento moderado de 
afastamento entre a preparação e a objetiva, até que seja distinguida a 
imagem do objeto; 
 
f) movimentar o micrométrico para focalização final; 
 
g) regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais 
nitidez; 
 
h) para trocar de objetiva basta o revólver e em seguida ajustar o foco 
imprimindo movimentos lentos no micrométrico; 
 
i) ao término da observação, girar o revólver até a menor objetiva e 
apagar a luz. Retirar a lâmina e colocar num recipiente com detergente. 
 
OBSERVAÇÃO: Quando o microscópio é binocular deve-se ajustar a 
distância inter-ocular de tal forma que o observador visualize um só 
campo de luz. Trabalhando com microscópio monocular, procurar 
manter ambos os olhos abertos, a fim de evitar fadiga. 
 
 
 
 
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7. Causas de erro na observação 
a) Obscuridade total do campo - má centralização do aparelho de 
iluminação 
b) Obscuridade parcial - revólver mal centrado, verificar se o ponto em 
que há resistência não foi atingido ou foi ultrapassado. 
c) Falta de nitidez da imagem 
- preparação invertida ou com sujos; 
- ocular suja - verificar se rodando-a, o sujo acompanha o movimento; 
limpar a objetiva; 
- objetiva suja ou com arranhão - limpar com mistura xilol-éter; 
- aparelho de iluminação - falta de centralização, poeiras depositadas ou 
objetos estranhos interpostos na marcha dos raios; 
d) Dificuldade subjetiva 
 Corpúsculos de forma diversas que parecem deslocar-se no 
campo. Com alguma prática, verifica-se que eles são independentes da 
preparação, e provêm do observador; repousar um pouco e repetir a 
operação; 
e) Movimento Brauniano 
 Quando os microrganismos deslocam-se num só sentido devido à 
correntes líquidas formadas por evaporação da água durante a 
observação nas preparações “In vivo”. Salientando que o movimento 
dos microrganismos é aleatório. 
8. Conservação dos microscópios 
 O aparelho deve estar sempre protegido, seja com capa plástica, 
seja com caixa própria e guardado em ambiente provido de luz artificial 
para evitar o crescimento de fungos. A cada utilização o pó do 
microscópio deverá ser removido com um pano limpo. 
 Evitar a ação de vapores ácidos e contato com reativos; só 
manuseá-lo com mãos limpas; só observar preparações limpas e ter o 
cuidado de não deixar escorrer nada sobre a platina ao adaptar a 
preparação. Se isto ocorrer, limpar imediatamente, se necessário com 
água destilada, enxugando a seguir. 
 As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e 
internamente, por um técnico, só quando necessário. 
 
 
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 A objetiva de imersão é limpa com papel de filtro ou algodão 
umedecido com uma mistura de xilol e éter na proporção de 1:1, que 
deve ser imediatamente removido com papel ou algodão limpo. 
 A permanencia de xilol sobre a lente causa desvitrificação da 
mesma. 
 Nunca deixe ficar óleo na lente pois ali resinifica e depois para 
limpar, exige excesso de dissolvente, podendo este penetrar no sistema, 
dissolvendo o bálsamo que liga as diversas partes. 
 As objetivas a seco são limpas com um linho macio e 
ocasionalmente, com papel umedecido com água destilada. 
 A parte interior das objetivas não deve ser limpa usualmente e 
quando é feito deverá ser praticada por pessoa habilitada. Deve-se 
remover a objetiva e passar suavemente um pincel macio ou uma bucha 
de pano macio na extremidade de uma haste. Não se deve assoprar para 
evitar a umidade. Esta operação deverá ser feita com muito cuidadopara não descentralizar as objetivas. 
 As lentes do aparelho de iluminação são limpas como as demais, 
com frequência pois delas depende a boa iluminação fornecida. 
 A parte mecânica é limpa e polida com uma flanela e a 
cremalheira com óleo detergente fino. 
 Para uma boa conservação do microscópio o operador deverá 
seguir uma rotina diária que vai desde uma simples remoção do pó até 
uma lubrificação mensal de todas as partes móveis com um óleo fluido. 
A cada trimestre o aparelho deve ser enviado a um técnico especializado 
para uma inspeção rigorosa, limpeza e lubrificação geral. 
 
 
PRÁTICA N°°°° 4 
OBJETIVOS: 
 • Realizar coloração simples 
 • Observar microrganismos diferentes sob objetiva de imersão 
 • Diferenciar leveduras de bactérias considerando o tamanho celular 
 
 
 
16
OBSERVAÇÕES “IN VITRO” 
 Os microrganismos são usualmente transparentes, tornando difícil 
o estudo de detalhes morfológicos quando são examinados em seu 
estado natural, assim torna-se necessário a utilização de técnicas de 
coloração. 
 As observações microscópicas “in vitro” são realizadas com o 
microrganismo previamente fixado ã lâmina. Nestas condições as 
células microbianas são observadas mortas. 
 Após a fixação, submete-se a preparação à etapa de coloração 
pela adição de soluções adequadas em função da técnica de coloração 
desejada. 
 As técnicas de coloração não só facilitam a visibilidade das 
células microbianas, como também, propiciam a visualização de 
determinadas estruturas celulares em função de afinidades específicas 
com determinados corantes, e facilitam identificação de micorganismos 
devido a comportamento diferentes frente à ação de soluções 
diferenciadoras. 
 A menos que algum aspecto morfológico específico, dependente 
de idade da cultura, deva ser demonstrado, o microbiologista deve usar 
sempre cultura nova nas observações microscópicas. As células com o 
tempo de cultivo, modificam o metabolismo, alterando a afinidade com 
muitos corantes. Excluindo os organismos que têm um tempo de geração 
especialmente grande, uma cultura com 24 horas de cultivo dará sempre 
bons resultados. 
 
 
SUBSTÂNCIAS CORANTES 
 
 Segundo Langeron, corantes são substâncias coradas que gozam 
da propriedade de transmitir cor a outros corpos. 
 Muitas são as substâncias corantes empregadas na rotina diária 
dos laboratórios, a maioria derivados da anilina, podendo ser 
classificados em naturais e artificiais. Entre os naturais destacam-se: o 
carmim, a hematoxilina. Os artificiais são agrupados em função dos 
grupos químicos presentes e da afinidade com estruturas celulares, 
podendo ser: 
 
a) Básicos ou nucleares: violeta de genciana, cristal violeta, verde de 
malaquita, azul de metileno, fucsina básica, azul de toluidina, verde de 
metila etc. 
 
b) Ácidos ou citoplasmáticos: eosina, fluoresceína, fucsina ácida, 
orange G, vermelho congo, ácido picrico etc 
 
c) Neutros: eosinato de azul de metileno e de azul AZUR, giensa etc. 
 
 
PREPARAÇÃO E FIXAÇÃO DE ESFREGAÇO 
 
 
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 Em processos de coloração de rotina, uma boa observação 
microscópica depende tanto da preparação do esfregaço como de sua 
fixação à lâmina. 
 
TÉCNICA 
 
. Flambar a alça de platina (“em círculo”) ao rubro, deixar esfriar, 
conservando-a próxima à chama; 
 
. Depositar com o auxílio da alça, gotas da suspensão microbiana na 
lâmina, se for o caso, suspender a amostra da cultura na própria lâmina; 
 
. Espalhar bem o material na lâmina, empregando movimentos 
rotacionais na alça de platina ( do centro para a periferia), a fim de se 
obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme; 
 
. Secar a fina película do material (esfregaço) ao ar ou pela passagem 
na chama do bico de Bunsen; 
 
. Fixar o esfregaço, passando o dorso da lâmina três vezes ou mais na 
chama, a fim de que o material fique bem aderido à lâmina; 
 
. Deixar a preparação esfriar ao ar e corar. 
 
 
 A fixação do esfregaço com água pode formar aerossóis 
(partículas projetadas durante a fervura de líquidos); evita-se 
introduzindo a lâmina no cone azul da chama (parte redutora, a mais 
quente), permanecendo alguns instantes a fim de secar o material. 
 
 A preparação e fixação do esfregaço requer cuidados evitando-se 
tratamentos bruscos, para que as células da amostra a serem observadas 
não fiquem aglomeradas dificultando a observação, como também não 
tenham seus arranjos característicos destruídos. 
 
 
COLORAÇÃO SIMPLES 
 
 Denomina-se de coloração simples à coloração em que se adiciona 
qualquer solução corante ao esfregaço fixado durante um determinado 
tempo (30s a 3 min) em função do corante utilizado. Depois lava-se a 
lâmina em água corrente, seca-se e observa-se usando a objetiva de 
imersão. 
 Essa coloração tem a finalidade de nos dá uma visão da forma, do 
tamanho e dos arranjos das células, bem como de outros detalhes 
estruturais. 
 
 
 
 
18
TÉCNICA 
 
1. Preparar e fixar o esfregaço; 
2. Cobrir com algumas gotas de uma solução corante (azul de metileno, 
cristal violeta, fucsina, safranina); 
3. Deixar o corante agir por 60s; 
4. Lavar em água corrente; 
5. Secar cuidadosamente na chama ou com papel absorvente; 
6. Observar com a objetiva de imersão (não esquecer de colocar 1 gota 
de óleo de imersão antes de adaptar a referida objetiva no eixo ótico). 
 
 
Obsevação: Não se deve facilitar com os papéis absorventes usados, 
especialmente se os microrganismos em estudo forem patógenos. 
 
 
 
PRÁTICA N°°°° 5 
OBJETIVOS: 
• Realizar coloração Diferencial de Gram 
• Observar ao microscópio sob imersão as preparações 
″in vitro″ 
• Diferenciar as formas de bactérias (cocos, bacilos) e arranjos 
celulares ( em cadeia, tétrades, cúbicos, em cachos). 
COLORAÇÕES DIFERENCIAIS 
 As colorações diferenciais distinguem grupos de microrganismos 
entre si, devido à diferenças químicas existentes entre as células 
microbianas. 
 Nesta técnica de coloração utiliza-se inicialmente soluções de 
corantes e mordentes; numa segunda etapa um agente diferenciador; 
para finalmente realizar outra coloração que contrasta com a primeira. 
COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM 
 Em 1884, CHRISTIAN GRAM descobriu um método de 
coloração, baseado no fato de que, quando certas bactérias são coradas 
pelo cristal de violeta e depois tratadas pelo iodo (solução iodo-
iodetada, dita lugol),forma-se um composto de coloração escura entre o 
iodo e o corante, o qual é fortemente removido pelo tratamento 
subseqüente com álcool (diferenciador). São as bactérias Gram 
positivas, as que tomam o corante de Gram (cristal violeta). Outras 
bactérias, ditas Gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo 
álcool. Assim sendo, se após a ação do álcool, fizermos uma coloração 
de fundo pela safranina ou pela fucsina básica, as bactérias Gram 
negativas aparecerão vermelhas. 
 
 
19
MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM 
 As bactérias Gram positivas e Gram negativas interagem com o 
corante cristal violeta devido à ligações irônicas entre os grupos básicos 
dos corantes e grupos ácidos dos constituintes celulares. O iodo em 
solução penetra nos dois tipos de células e forma um precipitado com o 
corante. O agente descorante (álcool etílico ou acetona) nas células 
Gram negativas passa facilmente através da membrana celular 
dissolvendo o complexo corante-iodo, deixando a célula incolor. Nas 
células Gram positivas o álcool penetra com dificuldade e a dissolução 
do complexo é lenta. A maior parte do complexo corante-iodo 
permanece na célula que retém assim a sua coloração. Pela adição do 
contra-corante (safranina ou fucsina básica) as células Gram positivas 
permanecem violetas enquanto as Gram negativa interagem com o 
mesmo, ficando vermelhas. 
 As diferençasquímicas entre os constituintes da parede celular 
das bactérias são responsáveis pela retenção ou não do cristal violeta. 
 Todas as células desprovidas de parede celular (certos 
protozoários), bem como as células artificialmente despojadas de parede 
celular (mesmo que sejam Gram positivas), comportam-se como Gram 
negativas. 
 As bactérias Gram negativas contêm uma concentração elevada de 
lipídeos, e suas paredes são também mais delgadas com relação às 
bactérias Gram positivas. O descoramento extrai os lipídeos 
aumentando a porosidade ou permeabilidade da parede favorecendo a 
retirada do complexo cristal violeta-iodo. 
 As paredes celulares das bactérias Gram. positivas em virtude de 
sua composição diferente (menos conteúdo lipídico, presença de ácido 
teicóico, maior quantidade de peptoglicano (mucocomplexo) cujos 
aminoácidos encontram-se mais intercruzados, deixando a parede mais 
compacta), tornam-se desidratadas durante o tratamento com o 
descorante; a porosidade diminui, a permeabilidade se reduz e o 
complexo cristal violeta-iodo não é extraído. 
 O método de Gram é dentre os processos de coloração para 
bactérias, o mais importante. 
 Todas as leveduras quando submetidas a esta coloração 
comportam-se como Gram positivas, enquanto os fungos filamentosos e 
para os protozoários, geralmente não se aplica esta técnica por não ser 
conveniente. 
REGRAS GERAIS DA COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM 
1°°°° - Os cocos, são geralmente Gram-positivos, com exceção dos 
pertencentes ao gênero Neisseria (Gonococos , Meningococos). 
2°°°° - Os bacilos, são geralmente Gram-negativos, excetuando-se os 
pertencentes aos gêneros: Corynebacterium (bacilo diftérico); Bacillus 
 
 
20
(B. subtilis ), B. antracis (do carbúnculo) e Clostridium (bacilo do 
tétano 
Cl . tetani; Cl. botulinum (do botulismo). 
TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM 
1. Preparar um esfregaço; 
2. Depois de frio cobrir o esfregaço com solução de cristal de violeta 
(1 minuto); 
3. Cobrir com solução de lugol (mordente) - 1 minuto; 
4. Lavar em água corrente; 
5. Descorar pelo álcool absoluto (evitar o descoramento deficiente ou 
em excesso; 
6. Lavar em água corrente; 
7. Contrastar, rapidamente com safranina (30 segundos); 
8. Lavar em água corrente; 
9. Secar com papel fino; 
10.Examinar com objetiva de imersão. 
 
AMOSTRAS: 
 
•••• Bacillus subtilis 
•••• Escherichia coli 
•••• Aerobacter aerogenes 
•••• Staphylococcus aureus 
•••• Sarcina lutea 
•••• Micrococcus 
 
PRÁTICA N°°°° 6 
OBJETIVOS: 
• Realizar coloração Especial de esporos 
• Observar ao microscópio sob imersão as preparações coradas 
 
 
COLORAÇÃO DE ESPOROS 
 
 Os esporos são células de resistência, não sendo característica 
predominante de todos os microrganismos. Algumas bactérias são 
capazes de formar esporos, como por exemplo: bactérias do gênero 
Bacillus e Clostridium. 
 
TÉCNICA 
 
1. Preparar o esfregaço e fixar; 
2. Cobrir o esfregaço com papel de filtro; 
 
 
21
3. Adicionar o corante verde malaquita; 
4. Aquecer até emissão de vapores; 
5. Repetir as operações 3 e 4 por 3 minutos; 
6. Lavar em água corrente; 
7. Adicionar safranina (0,5 a 1 minuto); 
8. Lavar em água corrente; 
9. Secar e observar em imersão 
 
RESULTADO: Os esporos coram-se em verde e o resto da célula em 
vermelho. 
 
PRÁTICA N°°°° 7 
OBJETIVOS: 
• Preparar meios de cultura de usos em práticas microbiológicas 
• Distribuir convenientemente, esterilizar em autoclave 
 
PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA 
 
 Meios de cultura são associações de substâncias que permitem o 
cultivo dos microrganismos fora do seu meio natural. 
 Nas preparações dos meios de cultura todos os nutrientes devem 
ser dissolvidos em água para que possam ser absorvidos pelas células 
microbianas. 
 Nos laboratórios geralmente utiliza-se água destilada no preparo 
destes meios, no entanto nas unidades industriais costuma-se utilizar 
água de rios ou poços. A água deve ter boa origem e composição 
química constante; quando necessário, deve ser devidamente tratada. 
 Como constituintes básicos dos meios de cultura, além da água, 
pode-se especificar: as fontes de carbono, as fontes de nitrogênio, os 
sais. Em meios de cultura solidificados, além destes componentes deve-
se introduzir agar, gelatina ou sílica gel com a função específica de 
solificar esses meios. 
 
NORMAS DE PREPARAÇÃO 
 
•••• Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de 
cultura podem ser pesados separadamente, ou consecutivamente num 
único recipiente (Béquer). Para quantidades inferiores a 1g utiliza-se 
uma balança analítica (semi-analítica). 
 O agar-agar geralmente é pesado separadamente, sendo o valor da 
pesagem em função da quantidade do meio a ser distribuído nos 
recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante em pó para 
cada litro de solução nutriente. 
 
•••• Solubilização dos componentes: adicionar os nutrientes previamente 
pesados a um Béquer contendo água destilada em quantidade suficiente 
 
 
22
para dissolvê-los. Os extratos de carne e de leveduras podem ser 
aquecidos ligeiramente para facilitar a solubilização. Deve-se evitar o 
uso de fogo direto e prolongado para não haver queima do material e 
consequente escurecimento do meio. 
 O agar não é solúvel a frio, devendo se necessário ser 
solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente. 
 
 
 
•••• Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao máximo os meio 
líquidos, antes de acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar 
na menor temperatura em que não haja solidificação. 
 São empregadas para ajuste do pH soluções de hidróxido de 
sódio ou ácido clorídrico a 0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos 
casos pode-se verificar o pH através do uso de um papel de tornassol. 
 Em meios solidificados, o pH ácido só deverá ser ajustado depois 
da esterilização para evitar a hidrólize do agar quando em temperatura 
elevada. Neste caso o pH ácido é ajustado com uma solução estéril de 
ácido lático. 
 
•••• Clarificação: em alguns casos há necessidade de clarificação dos 
meios que durante o preparo tornam-se turvos. A clarifição pode ser 
feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo, 
aquecendo em seguida até ebulição e filtrando-se em gase ou algodão 
hidrófilo. 
 
•••• Distribuição, esterilização e conservação: os meios de cultura 
depois de preparados são distribuídos em recipientes adequados (tubos, 
balões, Erlenmeyeres), especificando o respectivo nome ou sigla e a 
data do preparo dos mesmos. Terminada a distribuição, os tubos, balões 
ou Erlenmeyers são arrolhados com algodão ou tampas metálicas 
especiais, acondicionados em cestas e levados à esterilização em 
autoclave. A temperatura e o tempo de exposição neste equipamento 
depende da composição e da quantidade de meio de cultura recipiente 
(vide esterilização). 
 Após a esterilização, os meios são resfriados espera-se 72 horas 
antes de usá-los ou estocá-los em geladeira, a fim de que se possa 
detectar algum tipo de contaminação, ou falha de esterilização. 
 
 
 
 
COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA 
 
 
AGAR NUTRITIVO 
 
Extrato de carne... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g 
Peptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
 
 
23
Agar... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0g 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml 
pH = 6,8 - 7,0 
 
 
 
BATATA GLICOSE AGAR - BGA 
 
Batatas descascadas e cortadas em fatias . . . . . 300g 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml 
 
As batatas devem ser manuseadas com o mínimo de exposição ao ar. 
Aquecer em 500ml de água até completamente cozidas. Filtrar através 
de gase, completar o volume para 1000ml e adicionar: 
 
Agar .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0g 
Glicose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0g 
 
pH = 6,8 - 7,0 
 
CZAPECK (CZ) 
 
NaNO3 (nitrato de sódio).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g 
K2HPO4 (fosfato monoácido de potássio).. . . . . 1,0g 
MgSO4 (sulfato de magnésio).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5g 
KCl (cloreto de potássio).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5g 
FeSO4 (sulfato ferroso)... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,01g 
Sacarose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,0g 
Agar... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0g 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000ml 
pH = 6,6 
 
CALDO GLICOSADO 
 
Extrato de carne... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g 
Peptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
Glicose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10,0g 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000ml 
pH = 6,8 - 7,0 
 
CALDO LACTOSADO 
 
Peptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
Extrato de carne... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g 
Lactose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000ml 
pH = 6,8 - 7,0 
 
GODOY 
 
 
24
 
Peptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0g 
Caldo-de-cana... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500g 
Agar... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15g 
 
 Juntar ao caldo-de-cana uma clara de ovo batida. Aquecer até 
fervura, filtrar completando o volume até 1000ml. Juntar a peptona e o 
agar. 
 
 
 
 
GLICOSE LEVEDURA (GL) 
 
Peptona .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0g 
Extrato de carne... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g 
NaCl... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
Extrato de levedura... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0g 
Glicose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0g 
Agar... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12-15g 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mL 
pH 6,9 -7,1 
 
 
EMB 
 
Peptona .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0g 
Lactose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
Sacarose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
K2HPO4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0g 
Agar... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12-15g 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000mL 
 
 
 Dividir em balões de 250 mL, 100mL e 200mL de meio. 
Esterilizar a 120o C por 20 minutos. 
 
 Quando for distribuir em placas para uso, fundir e adicionar 
para cada 100 mL de meio, 1mL de solução estéril de eosina (4%) e 
1mL de solução estéril de azul de metileno (0,65%). As placas podem 
ser guardadas por uma semana em refrigerador. 
 
 
GLICOSE AGAR (GA) 
 
Extrato de carne .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g 
Peptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 
Glicose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 
Agar... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0g 
 
 
25
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml 
pH = 6,8 - 7,0 
 
SORO DE LARANJA 
 
Triptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0g 
Extrato de leveduras... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g 
Glicose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0g 
Fosfato dipotássico... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0g 
Soro de laranja... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200,0ml 
Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .800,0ml 
 
 Preparar o soro de laranja aquecendo 1 litro do suco recém-
extraído, a aproximadamente 93°C. Adicionar 30g de diatomácea e 
misturar. Filtrar com sucção através de um funil de Buchner usando 
papel de filtro grosseiro recoberto com o auxílio de filtração. Refiltrar 
os primeiros mililitros. Ajustar o pH a 5,5 , distribuir em recipientes 
adequados. 
 
 
PRÁTICA N°°°° 8 
OBJETIVOS: 
• Isolar bactérias, fungos filamentosos e leveduras de ambientes 
diversos 
• Identificar morfologicamente as espécies isoladas 
 
 
 Os microrganismos em seus ambientes naturais (água, solo, ar 
etc) existem como uma população mista. Para que possamos estudar 
uma determinada espécie de microrganismo nas suas características 
morfológicas e bioquímicas individuais é necessário separá-la das 
diversas espécies contidas nessa população , obtendo uma cultura pura e 
é formada por microrganismso derivados de uma única célula original. 
 
 O isolamento de microrganismos requer técnicas adequadas de 
inoculação destes microrganismos em meios de cultura adequados que 
possibilitem o seu rápido crescimento, livre de contaminações. 
 Para o cultivo, em condições laboratoriais, de microrganismos é 
necessário o conhecimento de suas exigências nutritivas e das condições 
físicas requeridas. Extensas pesquisas determinaram exigências 
nutritivas de muitas espécies de microrganismos e esta informação 
resultou no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa 
da grande variedade das necessidades nutritivas dos microrganismos há, 
também, grandes diferenças na composição dos meios utilizados. Do 
mesmo modo, existem amplas variações no que se refere ao ambiente 
físico que favorece seu crescimento. Alguns microrganismos, por 
 
 
26
exemplo crescem abaixo de 0°C; outros exigem temperatura acima de 
45°C e podem desenvolver-se até mesmo a 70°C. certas bactérias 
necessitam do oxigênio atmosférico; outras são indiferentes ou inibidas 
pelo oxigênio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÉTODO DE ISOLAMENTODE CULTURAS PURAS 
 
 
•••• Técnica de sementeira em superfície e de esgotamento do inóculo: 
 
 
 - Com o uso de uma alça de platina, coloca-se uma porção de 
espécime na superfície de um meio de cultura com ágar. 
 
 - Espalhar a amostra de lado a lado, na superfície da placa , 
tracando linhas de acordo com as figuras 1 e 2 , de modo que as 
bactérias individuais se separem umas das outras. 
 
 - Incubar as placas na temperatura adequada 
 
 - Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas 
 
 - Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e 
anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, 
consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel 
etc. 
 
 - Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da 
colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à 
temperatura e tempo adequados. 
 
 - Examinar as características do microganismo através de 
observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações 
específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso. 
 
 
 
 •••• Técnica da placa derramada (pour-plate): O princípio da técnica é 
o da diluição do material em tubos de agar liquefeito. 
 
 - Transfere-se uma alça de platina da suspensão original para o 
tubo A (agar fundido). O tubo é rolado entre as mãos, permitindo a 
 
 
27
mistura completa do inóculo com o meio. Transferências similares são 
efetuadas do tubo A para o B e, deste, para o C. 
 
 - Os conteúdos de cada tubo são derramados em placas separada 
 
 - Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequados 
 
 - Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas 
 
 
 - Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e 
anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, 
consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel 
etc. 
 
 - Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da 
colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à 
temperatura e tempo adequados. 
 
 - Examinar as características do microganismo através de 
observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações 
específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso. 
 
 
•••• Técnica das diluições sucessivas: se o microrganismo suspeito, 
numa população mista, está presente em número maior do que outros 
germes, pode ser obtido em cultura pura por meio de uma série de 
diluições em meios apropriados. 
 
 - Transfere-se 1ml ou 1g do material a ser examinado para um 
Erlenmeyer A contendo 99ml de água estéril. Homogeniza-se 
permitindo a mistura completa do inóculo com a água. A partir daí, 
transfere-se 1ml para um tubo B com 9ml de água estéril, agita-se e 
repete a operação para os tubos restantes (C, D, E). Obtém-se assim 
uma série de diluições decimais. 
 
 - De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e 
resfriado a 45oC; 
 
 - Incubar as placas na temperatura e período de tempo 
adequados; 
 
 - Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas. 
 
 Maiores detalhes sobre esta técnica estão no esquema apresentado 
na figura 2. 
 
 
28
 
 
FIGURA 2 - Esquema de diluição da técnica das diluições sucessivas. 
 
 Visando facilitar o entendimento e treinar o alunos nas técnicas 
de isolamento acima referidas, foram selecionadas de algumas técnicas 
sobre bactérias, bolores e leveduras. Estas técnicas deveram ser 
realizadas em grupo de três alunos e realizadas num período de 1 a 2 
semanas. 
 
 
 
29
 ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO 
 
 
MATERIAL 
 
Amostra de terra seca 
Erlenmeyer com 99 ml de água estéril 
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 
1 balão com meio de Czapeck (CZ) 
Placas de Petri esterilizadas 
Tubos de ensaio com meio Cz 
Placa com meio AVP 
 
 
TÉCNICA 
 
 
1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que 
contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos 
microrganismos existentes. 
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos 
tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e 
transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente 
sendo realizada uma série de diluições 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 ,10 -5 ,10 -
6
. 
 De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de 
CZ fundido e resfriado a 45oC. 
 
 
 
Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em 
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e 
 
 
30
incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias. 
2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas 
de Streptomyces: pequenas, secas, de cores variadas. Na 
escolha da colônia devem ser anotados aspectos 
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, 
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir 
com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e 
para uma placa com meio de CZ e para uma placa com AVP, 
fazendo nesta última uma estria no centro com auxílio de uma 
alça em L. Incubar. 
 
3o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura. Testar a atividade 
anti-microbiana da cepa utilizando a placa de AVP que 
apresenta uma estria central; inocular diferentes germes 
(bactérias, leveduras) fazendo estrias perpendiculares à estria 
central, começando a 30 mm da estria central e terminando 
junto à mesma. Fazer placas testemunhas inoculando apenas as 
estrias de microrganismos-testes. Incubar as placas a 30o ou 
37oC dependendo da temperatura dos microrganismos-testes. 
 
4o DIA - Observar se houver inibição e medir (o halo correspondente) a 
distância em milímetros do crescimento do microrganismo-
teste até a estria de Streptomyces. 
 
 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
 
31
ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO 
 
 
MATERIAL 
 
Amostra de terra seca 
1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril 
1 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo glicosado 
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 
1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN) 
Placas de Petri esterilizadas 
Tubos de ensaio com meio AN 
 
TÉCNICA 
 
 
1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeyer que 
contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos 
microrganismos existentes. 
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um tubo 
de caldo glicosado. Imergir o tubo em água fervente pelo 
espaço de tempo de 5 minutos. Resfriar e transferir 1 ml do 
caldo para um tubo com 9ml de água estéril, agitar para 
homogenizar e repetir a operação para mais 3 tubos. Obtém-se 
assim uma série de diluições decimais 10 -4 ,10 -5 ,10 -6 . De cada 
diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, 
depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN 
fundido e resfriado a 45oC. 
 
 
Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em 
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e 
incubar à temperatura ambiente durante 48 horas. 
 
 
32
2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas 
de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de 
superfície rugosa. Na encolha da colônia devem ser anotados 
aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, 
bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. 
Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo 
com AN e incubar à temperatura ambiente. 
 
3o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazerlâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma 
coloração de Gram e uma de esporos. 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
 
33
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE ÁGUA 
 
 
MATERIAL 
 
Amostra de água poluída 
1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril 
4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 
1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN) 
Placas de Petri esterilizadas 
Tubos de ensaio com meio AN 
 
 
TÉCNICA 
 
1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que 
contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos 
microrganismos existentes. 
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos 
tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e 
transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente 
sendo realizada uma série de diluições 10 -3 , 10 -4 ,10 -5 ,10 -6 . 
De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra 
de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio 
de AN fundido e resfriado a 45oC. 
 
 
 
 
 
Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em 
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e 
incubar à temperatura ambiente durante 48 horas. 
 
 
34
2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas 
de bactérias. Na escolha da colônia devem ser anotados 
aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, 
bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. 
Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo 
com AN e incubar à temperatura ambiente. 
 
3o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer 
lâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma 
coloração de Gram e uma de esporos. 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
 
35
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COLIFORMES 
 
 
MATERIAL 
 
Amostra de água de banheiro, ou pedaço de queijo coalho ou carne de 
sol; 
Tubos com meio de verde-brilhante-lactose-bile (VB) 
Tubos de ensaio contendo caldo lactosado 
1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN) 
Placas de Petri com meios diferenciais (EMB ou Endo ouTTC) 
Tubos de ensaio com meio AN 
 
 
TÉCNICA 
 
1o DIA - Inocular o tubo de Verde-brilhante com o material a ser 
pesquisado, incubar a 35oC por 48 horas. 
 
2o DIA - Inocular o tubo fermentado em placas de Petri com meio 
diferencial seguindo um dos esquemas abaixo. 
 
 
 
Incubar à 35o C durante 48 horas. 
 
 
36
3o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas 
de coliformes. Na escolha da colônia devem ser anotados 
aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, 
bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. 
Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo 
com AN e para um tubo com caldo lactosado (CL) incubar à 
35oC. 
 
4o DIA - Observar se o tubo de caldo lactosado fermentou e então se o 
tubo tiver dado resultado positivo (presença de bolha de ar) 
prosseguir a análise com o tubo de cultura com o meio de 
agar-nutritivo (AN). Realizar uma coloração de Gram e uma de 
esporos. Anotar os resultados e comparar com a literatura. 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
 
37
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTE 
 (Lactobacillus e Streptococcus) 
 
MATERIAL 
Uma amostra de Iogurte natural 
Placa de Petri com meio de Agar-glicose-levedura (GL) 
Tubos de ensaio com meio de leite desengordurado 
Tubos de ensaio com meio de Agar-glicose-levedura (GL) 
 
 
TÉCNICA 
 
 
1o DIA - Fundir e resfriar o meio de cultura; em seguida distribuir em 
placas de Petri. Quando o meio solidificar fazer estrias com o 
material pesquisado na superfície de cada uma das placas. 
Cada aluno deverá realizar a técnica de esgotamento utilizando 
apenas uma placa, segundo o desenho abaixo: 
 
ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir da 
gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas 
placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo: 
 
 
 
38
Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em 
repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e 
incubar em condições anaeróbicas ou sob tensão de CO2 (por 
exemplo, utilizando uma lata cuidadosamente no fundo da lata 
e a seguir fechar bem, por um período de 48 a 72 horas. 
 
2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias 
distintas. 
Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos 
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, 
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir 
com alça de platina parte da colônia para um tubo com meio 
de GL e para um tubo com meio de leite (o qual pode conter 
um corante indicador). Incubar. 
 
3o DIA - Observar o se há coagulação no tubo com meio de leite. 
Verificar se há crescimento no tubo de GL e realizar uma 
coloração de Gram. Incubar. Comparar com os dados obtidos 
na prática com os fornecidos pela literatura. 
 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
39
 ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO 
 
MATERIAL 
Uma amostra de terra seca 
Um Erlenmeyer com 99 ml de água estéril 
4 tubos com 9 ml de água estéril 
Um balão com meio de Czapeck (CZ) fundido 
8 placas de Petri estéreis 
4 tubos e quatro placas com meio de Czapeck 
 
 
TÉCNICA 
 
 
1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que 
contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos 
microrganismos existentes. 
Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um dos 
tubos de água estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e 
transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente 
sendo realizada uma série de diluições 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 ,10 -5 ,10 -
6
. 
 
 De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 
1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de 
CZ fundido e resfriado a 45oC. 
 
Agitar para homogenizar e incubar à temperatura ambiente 
durante 5 a 7 dias. 
2o DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e 
 
 
40
escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de 
cores variadas. 
Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos 
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, 
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir 
com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e 
para uma placa com meio de CZ. Incubar. 
 
3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir 
da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara 
úmida. Incubar 
 
4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de 
hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o 
gênero do fungo em estudo 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
41
ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO 
 
MATERIAL 
Uma amostra de pão, queijo, fruta ou outro material mofado 
Placa de Petri com meio de Czapeck (CZ) e Batata-glicose-agar (BGA) 
Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA 
 
1o DIA - Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida acidificar 
com ácido lático a pH 3,5. Distribuir em placas de Petri. 
Esperar solidificar. Com o auxílio de uma alça em agulha 
incubar material mofado no centro de cada um dos meios 
contidos em placas. Incubar à temperatura ambiente durante 5 
dias. 
 
2o DIA -( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e 
escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de 
cores variadas. 
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos 
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, 
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir 
com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e 
para uma placa com meio de CZ. Incubar. 
 
3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir 
da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara 
úmida. Incubar 
 
4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de 
hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o 
gênero do fungo em estudo 
 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
42
ISOLAMENTO DE FUNGOS DO AÇÚCAR CRISTAL 
 
MATERIAL 
Açúcar cristal 
Erlenmeyer com 99 ml de água estéril 
Balão com batata-glicose-agar (BGA) acidificado a pH 3,5 
Balão com meio de Czapeck (CZ) 
Placas de Petri estéreis 
Tubos de ensaio com BGA e CZ 
 
TÉCNICA 
 
1o DIA - Pesar 11g de açúcar e transferir para o Erlenmeyer com água 
estéril, agitando bem para dissolver. 
Transferir porções de 1 e 2 ml para placas de Petri. 
Os meios de cultura CZ e BGA devem ser fundidos, refriados 
a 45oC e em seguida acidificados com ácido lático a pH 3,5. 
 
Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar para 
solidificar (2 a 3minutos) e incubar à temperatura ambiente 
durante 5 a 7 dias. 
 
 
 
2o DIA - (5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e 
escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, 
de cores variadas. 
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos 
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, 
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir 
com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e 
para uma placa com meio de CZ. Incubar. 
 
3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir 
da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara 
úmida. Incubar 
 
 
43
4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de 
hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o 
gênero do fungo em estudo. 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
44
ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FRUTA 
 
MATERIAL 
Fruta (uva, maçã, abacaxi, mamão, cajá etc.) 
Erlenmeyer com 50 ml de caldo glicosado (CG) 
Meio de glicose-agar (GA) 
Ácido lático 
Placas de Petri estéreis 
Tubos de ensaio estéreis 
Tubos de ensaio para fermentação com caldo glicosado 
 
 
TÉCNICA 
 
1o DIA - Acidificar o caldo glicosado com ácido lático a pH 3,5. 
Cortar a fruta com casca e macerar com ajuda de uma faca. 
Tranferir para o Erlenmeyer com o meio acidificado, agitar e 
incubar à temperatura ambiente, durante 48 a 72 horas. 
 
2o DIA - Adicionar o meios de cultura às placas. Deixar esfriar em 
repouso para solidificar. Com uma alça de platina, depositar 
uma gota do caldo na superfície do meio contido na placa de 
Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo o esquema 
abaixo: 
 
 
 
 
 
ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir 
da gota depositada na primeira placa e continuando em mais 
duas placas do mesmo meio, segundo o esquema a 
seguir:
 
 
45
 
Incubar à temperatura ambiente por 48 horas. 
 
3o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias 
típicas de leveduras. 
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos 
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, 
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir 
com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e 
para um tubo com meio de CG. Incubar. 
 
4o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e 
observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma 
observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os 
aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais 
como: tipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), 
presença de grânulos, de vacúolos. 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
I
 
 
46
ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO-DE-CANA 
 
MATERIAL 
Caldo de cana fermentado (24horas) 
Meio de glicose-agar (GA) 
4 Placas de Petri estéreis 
Tubos de ensaio estéreis 
Tubos de ensaio para fermentação com caldo glicosado 
 
 
TÉCNICA 
 
 
 1o DIA - Adicionar o meios de cultura às placas. Deixar esfriar em 
repouso para solidificar. Com uma alça de platina, depositar 
uma gota do caldo na superfície do meio contido na placa de 
Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo um dos 
esquemas abaixo: 
 
 
 
Incubar à temperatura ambiente por 48 horas. 
 
 
 
 
47
2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias 
típicas de leveduras. 
Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos 
macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, 
consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir 
com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e 
para um tubo com meio de CG. Incubar. 
 
3o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e 
observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma 
observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os 
aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais 
como: tipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), 
presença de grânulos, de vacúolos. 
 
 
OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega 
do relatório e do tubo de cultura isolada. 
 
 
48
PRÁTICA N°°°° 9 
OBJETIVOS: 
 
• Determinar a densidade celular por turbidimetria 
• Obter o número de células por contagem em placa 
• Confeccionar uma curva de calibração de uma espécie microbiana 
 
 
 Um cultivo de bactérias ou leveduras em meio líquido, atua como 
uma suspensão coloidal, refletindo ou pondo obstáculos a passagem da 
luz através do mesmo. Até certo ponto, a luz que foi absorvida ou 
refletida é proporcional a concentração de células presentes na 
suspensão. A turvação que apresenta um tubo de ensaio contendo uma 
cultura em crescimento, é provocada pela absorção e reflexão da luz. 
Portanto, ao se medir a percentagem de absorção da luz (turbidimetria) 
ou a reflexão da luz (nefelometria) se pode estimar a concentração de 
células presentes. Ficaremos restritos ao primeiro caso. 
 Para as medidas turbidiméricas da massa celular, podem ser 
utilizados instrumentos como um espectrofotômetro ou fotocolorímetro. 
 Na turbidimetria, a capacidade do cultivo para deter a luz, se 
expressa como percentagem de luz transmitida, sendo esta percentagem 
inversamente proporcional à concentração de células. A percentagem da 
transmitância (T) é igual a I/I0 , sendo I0 , a intensidade da luz incidente 
e I, a intensidade da luz transmitida. 
 Para verificar a relação direta proporcional entre a concentração 
de células e a absorbância da luz (Densidade Ótica, DO = log I0 /I), 
vamos medir a turbidez de várias diluições (Figura 3) de uma suspensão 
de uma cultura de E.coli e proceder a contagem em placa destas 
diluições. 
 
 
Material 
 
- Microrganismos: 
 
 Escherichia coli (bactéria) 
 Saccharomyces cerevisiae (levedura) 
 
- Meios de cultura: 
 
 Caldo lactosado 
 Caldo glicosado 
 
- Equipamentos: 
 
 Agitador magnético 
 Espectrofotômetro 
 
 
49
- Diversos: 
 
 Tubos ou cubetas para o espectrofotômetro 
 Pipetas de 5ml esterilizadasMétodos 
 
- Fazer a diluição das culturas, conforme mostra a figura 3. 
 
- Calibrar o espectrofotômetro, utilizando luz com comprimento de onda 
variando entre 500 e 600nm. Colocar no aparelho um tubo contendo 5ml 
de meio de caldo lactosado ou caldo glicosado estéril. Com este tubo 
(“branco”) o espectrofotômetro é ajustado para D.O. igual a zero, ou 
transmitância igual a 100%; 
 
- retirar o “branco” do aparelho e colocar o tubo da cultura. Fazer a 
leitura da D.O. e anotar o resultado. Imediatamente proceder a 
contagem em placa, da cultura no tubo que foi feita a leitura no 
espectrofotômetro. 
 
- repetir o mesmo procedimento para os demais tubos da cultura diluída, 
ajustando sempre o espectrofotômetro contra o “branco”, a cada leitura, 
e agitando bastante o tubo com a cultura; 
 
- para a contagem em placa, dos tubos contendo a cultura de E.coli e S. 
cerevisiae fazer diluições até 1x10 -7 e plaquear em duplicata 1ml das 
diluições de 1x 10 -4 a 1x10 -7 . 
 
 
 
FIGURA 3 . Diluição da cultura para leitura no espectrofotômetro 
 
 
 
 
 
50
 
Resultados 
 
 Anotar na tabela, os resultados das leituras das densidades óticas 
e das correspondentes contagens em placas. 
 
 Após obter o número de células por contagem em placa, das 
diluições, relacionar num gráfico, os valores da D.O. das diversas 
diluições na ordenada, contra os números de microrganismos 
correspondentes que se determinou. Assim, obtemos uma curva de 
calibração para o referido microrganismo nas condições do 
experimento. 
 
 Diluições da cultura 
(ml) 
 Densidade Ótica 
 (D.O) 
 Concentração celular 
(células/ml) 
 
1/2 
 
1/4 
1/8 
1/16 
1/32 
1/64 
 
PRÁTICA N°°°° 10 
OBJETIVOS: 
• Obter a concentração de células de leveduras pelo uso de câmara 
de contagem (câmara de Neubauer) 
 
 
 
 A contagem direta por microscópio, é a mais rápida, e é levada a 
efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura. 
Esta enumeração é feita com o auxílio de lâminas espessas, conhecidas 
como câmaras de contagem. As mais comuns são as de Petroff-Hausser, 
Neubauer e as de Helber. estas câmaras apresentam uma área reticulada, 
com pequenos quadrados de superfície conhecida. Fazendo parte do 
conjunto, existe uma lamínula que recobre os pequenos quadrados, de 
modo que a altura destes à lamínula é conhecida. 
 
 No nosso experimento, as leveduras serão contadas numa câmara 
de Neubauer, que apresenta uma área dividida em quadrados com 
1/400mm2 ; a câmara é coberta com uma lamínula, deixando uma altura 
de 1/10mm, i.é., de cada quadrado à lamínula. Assim sendo o volume 
que fica acima de cada quadrado é de 1/4000 mm3 . 
 
 
 
51
 Esta contagem inclui organismos viáveis e mortos, sendo 
denominada de contagem total de células. 
 
 Este método de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um 
resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de não se ter 
a distinção entre células vivas e mortas. 
 
 
Material 
 
 - Microrganismo: 
 Cultura de Saccharomyces cervisiae 
 
 - Reagentes: 
 Solução salina fisiológica (0,85% NaCl) 
 
 -Equipamentos: 
 
 Microscópio ótico comum 
 Câmara de contagem de Neubauer 
 Bico de Bunsen 
 
 - Diversos: 
 Pipeta Pasteur 
 
 
Métodos 
 
 -Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da 
suspensão da cultura de levedura sobre a área reticulada da câmara; 
 -colocar a lamínula sobre a gota. Alternativamente, pode-se 
colocar primeiro a lamínula, e deixar-se que a suspensão do 
microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ação capilar sob a 
lamínula; 
 - esperar cerca de dez minutos, até que o material sedimente; 
 - usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de 10 
quadrados dispostos em “X” (ver figura 2). 
 
Resultados 
 
 - Calcular o número de leveduras/mL, contidas em uma suspensão 
utiliza-se a seguinte fórmula 
 
 Concentração Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluição 
 
 onde n= número de células dos quadrados 
 
 
 
 
 
52
Exemplo: 
 
 n = 232 
 
 diluição 1:100 
 
 Concentração celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 108 células/mL 
 
 
 
PRÁTICA 11 
 
OBJETIVO: Determinar uma curva de calibração para a determinação 
da concentração da levedura Saccharomyces cerevisiae a partir do 
fermento prensado. 
 
INTRODUÇÃO: 
 
 A partir do conhecimento do teor de matéria seca em fermento 
prensado comercial é possível preparar uma suspensão padrão de 
leveduras, de determinada concentração, com bastante confiabilidade. 
Através de uma série de diluições convenientes dessa suspensão padrão 
são obtidas novas suspensões de concentrações conhecidas. Finalmente, 
a turbidez provocada no meio pelas diferentes suspensões de leveduras 
é medida através de um instrumento adequado e os valores obtidos são 
relacionados com as respectivas concentrações por intermédio de uma 
expressão matemática. 
 
 As diluições adequadas são obtidas através de tentativas de forma 
a abranger um intervalo de concentrações que atenda as seguintes 
condições: 
 
1a .) Deve haver uma correlação linear entre a concentração e o 
logaritmo da trasmitância e; 
 
2a) Os valores das transmitâncias obtidas devem estar situadas na região 
de maior sensibilidade na escala do instrumento utilizado. 
 
 
TÉCNICA: 
 
1. Em um copo de Béquer de 50ml pesar, em balança semi-analítica, 2g 
de fermento prensado, anotando o valor exato. Diluir em um pouco de 
água e transferir, analiticamente, para um balão de 1000ml. 
Completar o volume e homogeneizar; 
 
 
 
53
2. A partir da concentração da suspensão padrão escolher os valores 
para as concentrações, de forma a cobrir uma determinada faixa de 
concentrações; 
 
3. Realizar uma série de diluições com um conjunto de pipetas e balões 
volumétricos adequados. Utilizar como sugestão os valores da tabela 
abaixo. 
 
Suspensão 
número 
Conc. da 
diluição, 
X (g/l) 
Fator de 
diluição 
Modo de 
preparo 
(ml da susp. 
padrão) 
1 0,1 20x 25 até 500 
2 0,2 10x 25 até 250 
3 0,3 6,67x 15 até 100 
4 0,4 5x 20 até 100 
5 0,5 4x 50 até 200 
6 0,6 3,33x 15 até 50 
7 0,8 2,5x 20 até 50 
8 1,2 1,67x 15 até 25 
 
4. Homogeneizar cada suspensão e transferir para um tubo de 
espectrofotômetro previamente ajustado ao comprimento de onda de 
610 nm. 
 
5. Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbância para 
cada concentração. O espectrofotômetro é calibrado antes de cada 
leitura, com um “branco” de água destilada. 
 
6. Construir um gráfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da 
concentração X (g/l) e no eixo das abssissas os valores da 
absorbância (D.O). 
 
7. Fazer uma regressão linear com o auxílio de um programa de 
computador ou utilizando o método dos mínimos quadrados. 
 
8. Calcular o coeficiente de correlação, r, e determinar o intervalo de 
concentrações, X1 → X2 , no qual a expressão é válida. 
 
Observação: A curva de calibração obtida pelos pontos descritos é 
válida apenas para o fermento prensado utilizado na sua confecção. 
 
 
PRÁTICA 12 
 
OBJETIVOS: 
 
• Avaliar o crescimento de um microrganismo em diferentes meios de 
cultivo; 
 
 
54
• Confeccionar a curvas de crescimento celular, utilizando o método 
turbidimétrico; 
• Calcular o tempo de geração (G )e a velocidade específica máxima 
de crescimento (µmáx) e a produtividade celular (P) em cada meio de 
cultivo. 
 
INTRODUÇÃO: 
 
 O crescimento microbiano pode ser definido em termos, tanto da 
massa, como também do número de células. Em condições de 
crescimento exponencial, massa celular e número de células 
permanecem