MANUAL-DE-AULAS-PRATICAS-DE-MICROBIOLOGIA-DOS-ALIMENTOS 2021 1

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CENTRO UNIVERSITÁRIO SANTO AGOSTINHO - UNIFSA 
PRÓ - REITORIA DE ENSINO 
COORDENAÇÃO DO CURSO DE NUTRIÇÃO 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
MANUAL DE AULAS 
PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TERESINA – PIAUÍ 
 
2 
 
 
MEDIDAS DE BIOSSEGURANÇA E MATERIAIS UTILIZADOS NO 
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 
 
 
1.1 Medidas de Biossegurança: 
Condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a prevenir, 
controlar e reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer a 
saúde humana, animal, vegetal e o meio ambiente. 
 
As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os 
princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos 
uma variedade de bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem, portanto é 
essencial que as normas abaixo sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações 
acidentais. 
 
➢ O uso do jaleco é obrigatório; 
➢ Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e 
equipamentos; 
➢ Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática; 
➢ Lavar as mãos e calçar luvas de procedimento ao iniciar a análise, lavar as mãos antes 
de sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento 
nas mãos, procurar não tocar no material; 
➢ Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise; 
➢ Utilizar exclusivamente material estéril para a análise; 
➢ No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a 
desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer 
ferimentos ou cortes; 
➢ Não comer, beber ou fumar no laboratório; 
➢ Não deixar seus pertences sobre os balcões onde os experimentos serão realizados; 
➢ Manter canetas, dedos e outros longe da boca; 
➢ Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho; 
➢ Avisar ao professor em caso de contaminação acidental; 
➢ Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a 
bancada; 
➢ Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso; 
➢ Os cultivos após a leitura devem ser encaminhados para esterilização, portanto não os 
colocar na estufa ou despejar na pia; 
➢ Colocar os materiais contaminados (pipetas, lâminas e etc.) em recipientes apropriados 
colocados na bancada; 
➢ Desinfetar a bancada de trabalho com lisoforme ou álcool ou hipoclorito de sódio, ao 
início e término de cada aula prática. Isto removerá microorganismos que possam 
contaminar a área de trabalho; 
➢ Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser manuseado 
cuidadosamente e após o seu uso, desligá-lo, limpá-lo, e colocar a capa; 
➢ Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias 
inflamáveis por perto; 
➢ Trabalhe sempre próximo ao fogo, preservando o cuidado pessoal. 
 
 
3 
 
 
Materiais mais utilizados no Laboratório de Microbiologia 
 
1. Autoclave (calor úmido) - O seu funcionamento baseia-se no vapor d'água sob pressão, 
e é utilizada para esterilização de materiais usados em microbiologia, principalmente meios 
de cultura; 
 
2. Estufa esterilizadora ou Forno Pasteur (calor seco) - Usado para esterilizar materiais 
secos tais como tubos, placas, etc; 
 
3. Estufa Incubadora - Onde os microrganismos são mantidos durante o seu 
desenvolvimento em uma temperatura constante; 
 
4. Placa de Petri - Recipiente redondo de vidro com tampa rasa, destinada ao cultivo de 
microrganismos em meio sólido; 
 
5. Tubo de Cultura - Destinado ao cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio 
(líquido ou sólido). 
 
6. Pipeta Volumétrica ou Graduada - Utilizada para diluição, inoculação, etc. Contém um 
tampão de algodão em uma das extremidades. 
 
7. Alça: é um fio reto de platina ou liga metálica, recurvado na extremidade e adaptado ao 
cabo de Kolle. Serve para semear meio sólido em superfície ou meio líquido. A quantidade 
de inoculo transportado pela alça, depende, é óbvio, do diâmetro da mesma. 
 
8. Tubos de Durham: são tubos pequenos, cilíndricos, medindo mais ou menos 5 x 30 mm, 
colocados invertidos no meio líquido contido em um tubo de cultura comum. Servem para 
aprisionar o gás formado em uma fermentação. Durante a esterilização, o tubo de Durham 
se enche do meio líquido, após inoculação e fermentação, o líquido é deslocado 
parcialmente ou totalmente. 
 
9. Balões e frascos de Erlenmeyer: servem para armazenar quantidades maiores de 
meios de cultura; para o desenvolvimento de microrganismos em meio líquido, com 
agitação ou aeração; ou para conter quantidades determinadas de líquidos para diluições 
em série, etc. 
 
10. Pinça de dissecação: serve para manipular material que a mão não deve tocar. É 
também usada, por muitos, para auxiliar a tamponar tubos. 
 
11. Pinça para tubos (com material isolante ou não no cabo): serve para manipular tubos 
com meio sólido fundido ou outros materiais quentes de vidro. 
 
 
 
 
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1. MATERIAIS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 
 
Objetivo: Identificar os materiais utilizados no laboratório de microbiologia, com suas 
respectivas funções. 
 
1 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
2 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
3 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
4 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
5 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
7 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
8 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
5 
 
 
9 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
10 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
15 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
16 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
6 
 
 
17 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
18 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
7 
 
 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
26 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nome: 
Função: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
2. LIMPEZA E PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
É muito importante a assepsia dos materiais e do próprio laboratório, quando se trabalha com 
microrganismos, isto porque, qualquer matéria estranha pode ser uma fonte de contaminação. O 
chão do laboratório deve ser esfregado todos os dias com pano molhado e um desinfetante, 
preferencialmente lisoforme. Os balcões e todas as outras superfícies também devem ser 
desinfetados. 
 
Objetivo: Demonstrar a importância da assepsia dos materiais utilizados em Laboratório de 
Microbiologia dos Alimentos, com a finalidade de eliminar fontes de contaminação tanto nas análises 
quanto nos manipuladores. 
 
Materiais: 
 
• Placas de Petri 
• Tubos de cultura 
• Pipetas 
• Espátulas 
• Alça de Drigalski 
• Alça de platina 
• Bico de Bunsen 
• Detergente 
 
• Esponja 
• Água destilada 
• Álcool • Algodão 
• Papel para embalagem 
• Régua para corte 
• Cordão para embalagem 
• Autoclave 
• Luvas 
Metodologia: 
 
• Lavar os materiais selecionados utilizando detergente esponja; 
• Deixar os materiais em repouso em água destilada por 20 minutos; 
• Limpar e sanitizar as bancadas com álcool 70% para a embalagem dos materiais; 
• Secar em estufa de secagem; 
• Embalar os materiais com o papel e cordão próprios para a embalagem; 
• Levar para a autoclave. 
• Mostrar como utilizar o bico de Bunsen para esterilização; 
 
Observações: 
 
• Alça e fio de platina devem ser flambados antes e depois dequalquer operação de semeadura. É 
importante que se faça o esfriamento da alça antes de ser colhido o material. 
• Em relação às semeaduras feitas em tubos de ensaio, deve ser flambada a boca dos mesmos, 
após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. Este deve ser mantido pelo dedo 
mínimo da mão direita e nunca deixado sobre a mesa do laboratório. 
• As placas de Petri deverão ser manuseadas com cuidado e não poderão ficar abertas no ambiente, 
além do cuidado de manuseá-las sempre próximo a uma chama. Uma vez semeadas, devem ser 
incubadas em estufa, com a tampa voltada para baixo. 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
Utilização das técnicas microbiológicas 
 
OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de microrganismos no 
campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível 
selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a 
chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. E importante ressaltar que 
a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de flambagem seja 
executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama 
são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para flambagem), Zona 
Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas 
para a flambagem). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
MEIOS DE CULTIVO E TÉCNICAS DE SEMEADURA 
 
 
Meios de Cultivo 
 
Os meios de cultivo, também chamados meios de cultura, são complexos que se destinam ao cultivo artificial 
de microrganismos. 
As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes microrganismos nos meios de cultura seja eficiente 
e que as seguintes finalidades sejam atingidas: 
 
- Crescimento bacteriano; 
- Isolamento bacteriano; 
- Estudo da morfologia colonial; 
- Pesquisa de patogenicidade; 
- Pesquisa das características bioquímicas. 
 
Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias para o seu crescimento e 
multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva devem dispor de fontes de 
carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também necessários 
alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento. 
 
Classificação dos meios de cultivo: 
 
❖ Quanto à consistência: 
 
• Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. O crescimento 
bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja, o meio sofre uma turvação. 
• Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena 
porcentagem de um polissacarídeo proveniente de algas marinhas, chamado Ágar. São geralmente utilizados 
em tubos e a partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana. 
• Meios sólidos: são aqueles que possuem uma porcentagem maior de Ágar (cerca de 15 g/litro de água 
destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da 
finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, 
conseguir o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da 
morfologia colonial. Já a cultura em Ágar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obtenção 
de uma biomassa de microrganismos. 
 
❖Quanto à função: 
 
• Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microrganismos pouco 
exigentes. Ex: caldo simples. 
• Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, 
ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Agar sangue. 
• Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados microrganismos em detrimento 
de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. Ex: Agar Salmonella-Shigella. 
• Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de microrganismos com características 
relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex: Ágar 
MacConkey. 
• Meios de manutenção: são aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: Ágar 
Nutriente. 
 
❖Quanto à natureza: 
 
• Meios animados: são constituídos de células vivas, como animais de laboratório, tecidos vivos ou ovo 
embrionado. 
• Meios inanimados: não possuem células vivas. Podem ser naturais ou sintéticos. Naturais são aqueles que 
possuem substâncias provenientes da natureza, e o sintético contém substâncias obtidas em laboratório. 
Ainda podemos obter meios de cultivo semi-sintéticos, que são resultantes da união dos dois anteriores. 
 
Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois 
devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua 
utilização. 
Técnica de Semeadura 
11 
 
 
A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio 
de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras devem ser seguidas nas inoculações: 
- A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina) devem ser 
esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado de esfriá-las antes da 
coleta. 
- Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen. 
- Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante 
o cultivo. 
 
Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o Ágar, 
pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar as condições de 
crescimento bacteriano. 
 
Técnica I: Meio Líquido 
 
1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. 
2- Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a alça. 
 
 
 
 
Técnica II: Meio semi-sólido 
 
1- Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é fornecida 
2- Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-sólido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
Técnica Ill: Meio sólido (Ágar inclinado) 
 
1- Mergulhe a Alça do Platina esterilizada na cultura bacteriano que lhe é apresentada 
2- Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na 
superfície do Ágar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Técnica IV: Meio sólido (Placa de Pelei — técnica do esgotamento) 
 
1- Divida a Placa de Petri em três partes; fazendo linhas com a caneta retroprojetor na parte de 
baixo da placa 
2- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada. 
3- Faça estilas em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível Ioda a 
superfície da placa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
3. PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para o cultivo e identificação de microrganismos, usam-se soluções e substâncias nutritivas 
chamadas meios de cultura, que devem atender às exigências nutricionais das espécies a serem 
cultivadas. 
 
Quanto à composição química, podem ser: Meios sintéticos (os componentes são 
quimicamente definidos) e Meios complexos (quando se adicionam ao meio, substâncias 
complexas, como por exemplo, extrato de carne, peptona, sangue, etc.). Em relação ao estado 
físico, podem ser líquidos, também denominados de caldos, ou sólidos (caldo contendo 1,5% a 2% 
de Agar). 
 
 
Observação: Os meios de cultura mais utilizados em laboratórios de microbiologia estão 
disponíveis comercialmente, já na forma desidratada. 
 
Objetivo: Preparar (100 ml) de diferentes meios de cultura a serem utilizados parao cultivo de 
microrganismos. 
 
Material: 
 
• Caldo Escherichia coli (EC) 
• Caldo Bile Verde Brilhante (VB) 
• Erlenmeyer (vidrarias) 
• Tubos de cultura 
• Placas de Petri 
• Tubos de fermentação (Durhan) 
• Balança semi analítica 
 
Método: 
 
Conforme recomendação do fabricante dissolver o meio em água destilada, aquecer até 
fervura para completa dissolução. Autoclavar a 121 °C por 15 minutos. 
 
Função: 
 
• Caldo Escherichia coli (EC) — meio seletivo cresce com produção de gás apenas os 
Coliformes fecais ou termoresistentes. 
• Caldo Bile Verde Brilhante (VB) — é um meio seletivo. Crescimento com produção de gás 
no tubo de Durhan evidencia um teste positivo. O meio de cultura apresenta sais biliares que 
inibe o crescimento de microrganismos Gram-positivos e a lactose é utilizada como substrato 
para produção de gás pelos coliformes. 
 
Questões: 
1. Qual a importância dos meios de cultura na Microbiologia de Alimentos? 
 
2. Por que existem diferentes meios de culturas nas análises microbiológicas? 
 
 
14 
 
 
4. TÉCNICAS BÁSICAS DE SEMEADURA EM PLACAS POUR PLATE E 
SPREAD PLATE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Conhecer as técnicas de semeadura mais utilizadas para a contagem de microrganismos 
em placas. 
 
Materiais: 
 
• Placas de Petri 
• Tubos de cultura com Solução Salina (9 mL) 
• Pipetas (1 mL, 2 mL e 5 mL) 
• Alça de Drigalski 
• Pinças 
• Tesoura 
• Bico de Bunsen 
• Solução Salina Peptonada em erlenmeyer para diluição (225 mL) 
• Agar Padrão para Contagem (PCA) 
• Álcool 70% 
• Algodão 
• Alimento (biscoito salgado e leite em pó) 
• Pêra 
• Espátula 
 
Procedimentos Gerais: 
 
✓ Higienizar a bancada com álcool 70%; 
✓ Ligar a chama do bico de Bunsen; ATENÇÃO! Trabalhar próximo à chama. 
✓ Identificar todos os tubos e placas que serão inoculados, com o código da amostra, a sigla 
do meio de cultura contido; 
✓ Para cada diluição utilizar placas em duplicata (A e B) 
 
Metodologia: 
 
1. Plaqueamento em Profundidade (POUR PLATE): 
 
Fundir o meio de cultura (preparado com antecedência) em banho com água fervente, 
mantendo a fervura apenas o tempo necessário para a fusão do ágar; 
Resfriar o meio em água fria e manter a temperatura de 44 a 46°C até o momento do uso; 
Retirar assepticamente 25 g ou mL do alimento e colocar em erlenmeyer com 225 mL de 
água peptonada previamente esterilizado e homogeneizar (10-1); 
 
15 
 
Dessa diluição (10-1), retirar 1,0 ml e transferir para um tubo com 9,0 mL de solução salina 
peptonada (10-2); 
Dessa diluição (10-2), retirar 1,0 ml e transferir para um tubo com 9,0 ml de solução salina 
peptonada (10-3); 
Retirar de cada diluição alíquotas de 1 mL da amostra, com auxilio de uma pipeta depositar 
fora do centro da placa, pois isto facilitará a posterior mistura com o meio de cultura. 
Lembrar que, para cada diluição devem-se utilizar pipetas diferentes; 
Adicionar o meio de cultura PCA, em uma quantidade de 15 a 20 mL no meio das placas e 
misturar o meio com o inóculo, movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em 
movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares no sentido horário e anti-horário; 
Incubar as placas invertidas em estufas a 35 °C por 48 horas. 
 
2. Plaqueamento em Superfície (SPREAD PLATE): 
 
Retirar assepticamente 25 g ou mL do alimento e colocar em erlenmeyer com 225 mL de água 
peptonada previamente esterilizado e homogeneizar (10-1); 
Dessa diluição (10-1), retirar 1,0 ml e transferir para um tubo com 9,0 mL de solução salina 
peptonada (10-2); 
Dessa diluição (10-2), retirar 1,0 ml e transferir para um tubo com 9,0 ml de solução salina peptonada 
(10-3); 
Retirar de cada diluição alíquotas de 0,1 mL da amostra, com auxilio de uma pipeta e colocar no 
interior da placa com o meio de cultura (PCA). Lembrar que, para cada diluição devem-se utilizar 
pipetas diferentes; 
Com auxílio de uma alça de Drigalski, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio até que o 
excesso de liquido seja absorvido; 
Incubar as placas invertidas em estufas a 35 °C por 48 horas. 
 
Observação: Usar pipeta de no máximo 1 mL para transferência do inóculo de 0,1 mL. Não 
assoprar a pipeta e nem mudar a ponta de posição, para liberar a última gota. 
 
3. Contagem de Colônias em Placas(PCA): 
 
3.1. Após 48 horas da incubação, realizar o seguinte procedimento: 
3.1.1. Higienizar a bancada com álcool 70%; 
3.1.2. Identificar as placas com número de colônias entre 25 a 250 colônias; 
3.1.3. Contar as colônias com auxílio da lupa de um contador de colônias e do pincel marcador, 
para facilitar a visualização; 
 
Questões: 
 
1. Qual a diferença entre as técnicas de semeadura? 
 
2. Qual a importância dessas técnicas na Microbiologia de Alimentos? 
 
 
Identificação da Placa de Petri 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
5. CÁLCULO DOS RESULTADOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Compreender os métodos de contagem em placas de microrganismos e calculo dos 
resultados. 
 
Regras Gerais para Cálculo e Registros 
 
1. Expressão de resultados de contagem: 
 
No cálculo das contagens, o resultado final será expresso em UFC/g ou mL, levando-se em conta 
a diluição empregada, da seguinte maneira: 
R = a x 10b UFC/g ou mL 
Onde: 
R = resultado 
a = os dois primeiros algarismos significativos, números de 0 a 9 
b = expoente (0 a 10) 
UFC = unidade formadora de colônias 
g = grama e mL= mililitro 
 
Exemplos: 
Diluição 10-2 (1:100) 
Média das contagens: 25 UFC 
Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL 
Diluição 10-3(1:1.000) 
Média das contagens: 38 UFC 
Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL 
 
O resultado final será expresso considerando-se os dois primeiros algarismos 
representativos, separados por vírgula. Os algarismos subseqüentes, quando existirem, deverão 
ser arredondados e transformados em potência de 10. 
 
2. Arredondamento de resultados: 
 
Quando se fizer necessário, e visando não criar uma falsa idéia de precisão, aplicar a 
seguinte regra para a aproximação dos resultados: 
 
2.1. Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo 
imediatamente após for superior a 5. 
 
Exemplo: 
Diluição 10-2 
Média das contagens: 186 UFC 
Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 =1,9 x 
104UFC/g ou mL 
 
17 
 
Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo imediatamente 
após for inferior a 5. 
 
Exemplo: 
 
Diluição 10-2 
Média das contagens: 184 UFC 
Arredondando-se o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 
UFC/g ou mL 
 
2.2. Nos casos em que o terceiro algarismo ou o subseqüente for igual a cinco, arredondar para baixo quando 
o segundo ou o subseqüente for menor ou igual a 5 e para cima quando for maior que 5. 
 
Exemplos: 
 
Diluição 10-2 
Média das contagens: 185 UFC 
Arredondando o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g 
ou mL 
 
Média das contagens: 145 UFC 
Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 140 x 100 =14,000 = 1,4 x 104 UFC/g 
ou mL 
 
Média das contagens: 155 UFC 
Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 150 x 100 = 15.000 = 1,5 x 104 UFC/g 
ou mL 
 
2.3. Arredondamento de resultados obtidos pela contagem de placas em duplicata de duas diluições 
diferentes. Nas contagens de placas de duas diluições diferentes, o procedimento de arredondamento é 
semelhante ao da contagem de mesma diluição, isto é, só poderá ser efetuado após o cálculo da média das 
contagens, que será explicado a seguir nas regras específicas para contagem de colônias. 
 
3. Resultados estimados 
 
Nas contagens, em que em todas as placas o número de colônias encontrado estiver fora do intervalo 
de precisão e repefibilidade da metodologia aplicada, incluir no registro do resultado final a expressão 
"estimado" ou "por estimativa", por meio da abreviatura"est.", após o g ou mL. 
 
Quando houver condições para efetuar a contagem, expressar o número obtido. Pode-se ainda 
expressar o resultado como o limite inferior com o sinal de menor ou o superior com o sinal de maior, 
por estimativa ou estimado. 
 
Exemplos, com limite entre 15 e 150: 
Diluição 10-2 
Média das contagens: 160 UFC 
Resultado: 160 x 100 = 16.000 = 1,6 x 104 UFC/g ou mL est. 
Ou >1,5 x104 UFC/g ou ML est. 
 
Média das contagens: 11 UFC 
Resultado: 11 x 100 = 1.100 =1,1 x 103 UFC/g ou mL est. 
Ou <1,5 x103 UFC/g ou mL est. 
 
Nas contagens de amostras liquidas inoculadas diretamente, ou seja, diluição 100, quando não houver 
crescimento ou a contagem for menor que 10 UFC, o resultado será expresso por estimativa e na potência 
100. 
 
Caso a contagem seja superior a 10 UFC o resultado será expresso de acordo com o número obtido, ou seja, 
potência de 101 ou 102. 
Exemplo 1: 
Diluição 100: 
Intervalo de seleção: 15 a 150 
N° de colônias contadas: 12 
Resultado: 12 x 1 =12 = 1,2 x 101 UFC/mL est. ou <1,5 x 101 UCF/mL est. 
 
Exemplo 2: 
Diluição 100: 
Intervalo de seleção: 15 e 150 
18 
 
N° de colônias contadas: 232 
Resultado: 232 x 1 = 232 = 2,3 x 102 UFC/mL est. ou 1,5 x 102 UFC/mL est. 
 
4. Regras específicas para contagem de colônias 
 
As contagens se realizam de maneira similar para os casos em que os limites de números de colônias 
para as placas selecionadas se encontram em diversos intervalos como 15 a 150, 20 a 200, 30 a 300 ou 
outro. 
4.1. Situações nas qual o número de colônias, nas diversas diluições, se encontra dentro dos limites 
do intervalo de precisão e de repetibilidade. 
Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleção de placas com número de colônias contido no 
intervalo de precisão e repetibilidade de 25 a 250 colônias. 
 
4.1.1. Mesma diluição — placas em duplicata 
 
Calcular a média aritmética dos resultados encontrados e multiplicar pela diluição correspondente. 
 
Exemplo: 
Dil: 10-3= 130 colônias 
Dil: 10-3 = 224 colônias 
(130 + 224) /2 =177 x 1.000 = 177.000 => 180.000 UFC 
Resultado: 1,8 x 105 UFC/g ou mL 
 
4.1.2. Diluições Diferentes 
 
Multiplicar o resultado encontrado em cada placa pela respectiva diluição e calcular a média aritmética. 
 
Exemplo: 
Dil: 10-3 = 210 colônias 
210 x 1.000 = 210.000 
Dil: 10-4 = 32 colônias 
32 x 10.000 = 320.000 
 
Fazer a média das diluições diferentes 
(210.000 + 320.000) /2 = 265.000 =>270.000 
Resultado: 2,7 x 105 UFC/g ou mL 
 
4.2. Situações na qual o número de colônias se encontra dentro dos limites do intervalo de precisão e 
de repetibilidade em uma só diluição. 
 
Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleção de placas com número de colônias contido no 
intervalo de precisão e repetibilidade de 25 a 250 colônias. 
Quando, nas diversas diluições, o número de colônias em uma diluição encontra-se dentro do limite 
de 25 a 250 colônias e na outra diluição encontra-se fora deste limite, o resultado não será expresso como 
estimado. 
 
4.2.1. Mesma Diluição — placas em duplicata 
 
Calcular a média aritmética dos resultados encontrados e multiplicar pela diluição correspondente. 
 
Exemplo: 
Dil: 10-3= 230 colônias 
Dil: 10-3 = 261 colônias 
(230+261) /2 = 245,5 x 1.000 = 245.500 => 240.000 
Resultado: 2,4 x 10-5 UFC/g ou mL 
 
4.2.2. Diluições diferentes 
 
Exemplo 1: 
Dil: 10-3 = 232 colônias 
232 x 1.000 = 232.000 
Dil: 10-4 = 15 colônias 
15 x 10.000 = 150.000 
(232.000 + 150.000) /2 = 191.000 
19 
 
Resultado final: 1,9 x 105 UFC/g ou mL 
 
 
Exemplo 2: 
Dil: 10-3= 270 colônias 
270 x 1.000 = 270.000 
Dil: 10-4= 29 colônias 
29 x 10.000 = 290.000 
(270.000 + 290.000) /2 r- 280.000 
Resultado final: 2,8 x 105 UFC/g ou mL 
 
 
 
CONTAGEM DAS COLÔNIAS (Contagem Padrão em Placa) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 
 
 
 
6. CRESCIMENTO DE MICROORGANISMOS ORIUNDOS DE VÁRIAS 
FONTES COM A FINALIDADE DE OBSERVAR AS POSSÍVEIS 
CONTAMINAÇÕES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Observar o crescimento de microrganismos provenientes de várias fontes de 
contaminação. 
 
Importância: Verificar em que condição higiênica está o ambiente (local, utensílios, manipuladores) 
de produção de alimentos. 
É importante para quem trabalha em Microbiologia e Tecnologia de Alimentos. 
 
 
Material: 
 
• Placas de Petri com meio de cultura Agar Plate Country 
• Estufa a 37 °C 
• Swabs etc. 
• Solução Salina Peptonada (Cloreto de Sódio + Água destilada + peptona) 
• Tubos de ensaio 
 
Meio de Cultura: Agar Plate Country 
 
Amostras: o aluno deve escolher o tipo de amostra objeto de estudo. 
 
Procedimento: 
1. Pegar as Placas de Petri com meios de cultura previamente inoculado e já solidificados; 
2. Inocular as amostras nas placas da seguinte maneira: 
 
a) Placa A: usando um swab umedecido em solução salina peptonada, passe-o pela superfície de 
um objeto ou aparelho qualquer. Passe-o agora sobre a superfície do substrato de uma das placas. 
Tomar cuidado para não molestar a superfície do meio de cultura. 
b) Placa B: tocar a superfície do substrato, em vários lugares com os dedos. 
c) Placa C: remover a tampa da placa de Petri e, e com a cabeça próxima da mesma, corra seus 
dedos vigorosamente pelo seu cabelo. 
d) Placa D: inocular a placa, tossindo diretamente sobre a superfície da mesma. 
e) Placa E: usando um swab umedecido em solução salina peptonada, passe-o pela bancada de 
trabalho. Passe-o agora sobre a superfície do substrato de uma das placas. Tomar cuidado para 
não molestar a superfície do meio de cultura. 
f) Placa F: usando um swab umedecido em solução salina peptonada, passe-o pela superfície de 
uma vidraria (erlenmeyer). Passe-o agora sobre a superfície do substrato de uma das placas. Tomar 
cuidado para não molestar a superfície do meio de cultura. 
 
21 
 
 
Observação: Especificar nas placas o tipo de inoculação que foi feito, colocar o seu número e 
incubar em estufa a 37 °C, por 24 a 48 horas. 
 
 
RESULTADOS: 
 
1. Examine as placas e conte o número de colônias em cada placa; 
 
2. Descreva em termos gerais a aparência dessas colônias como: 
 
 
• Tamanho: grande 5 mm; média 2 a 5 mm; pequena 2 mm 
 
 
 
 
• Cor: incolor; pigmentada 
 
• Forma: circular; irregular; rizóide; filamentosa;puntiforme 
 
 
 
• Estrutura: lisa; granulosa; filamentosa; rugosa. 
 
• Brilho: transparente; translúcida; opaca. 
 
 
3. É capaz de distinguir entre uma colônia de fungo e uma de bactéria? Descreva a diferença. 
 
 
 
 
Questões: 
 
1. Quais são as fontes de microrganismos em estudo? 
 
2. Que importância prática tem os microrganismos para quem trabalha em microbiologia e 
tecnologia de alimentos? 
 
3. Que precauções devem ser tomadas para controlar os "contaminantes" desses locais em estudo? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
 
 
7. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE CONSERVAÇÃO DE CARNE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Avaliar o estado de conservação da carne através das características organolépticas e análises 
físico-químicas (testes rápidos). 
 
Esta análise consiste praticamente, em comprovar o estado de conservação já que as inspeções 
sanitárias, antes ou depois do abate dos animais dão a certeza de que as carnes não são nem perigosas nem 
tóxicas. Para fazer esta comprovação é suficiente verificar as características organolépticas e fazer algumas 
reações analíticas. 
 
1ª ETAPA: Observação das Características Organolépticas 
 
Objetivo: Observar as alterações nas características organolépticas. 
 
Material: 
• Carne fresca - 100 g 
• Pinça 
• Depósito de plástico com tampa 
 
Metodologia: 
• Cortar a carne em cubos, colocar em um depósito plástico com tampa e deixar em temperatura ambiente 
por 24 horas. 
• Usar uma pinça para observar o estado geral da amostra. 
 
Características Organolépticas: 
 
• COR: As carnes podem ser de cor vermelha, branca ou preta, dependendo da espécie do animal. 
• SABOR: "Sui generis";característica para cada espécie animal. 
• ODOR: "Sui generis"; agradável, característico de cada espécie. 
• CONSISTÊNCIA: Exsuda um líquido rosado de pH ácido, a consistência deve ser firme e pouco elástica. 
• ASPECTO: Brilhante e com veias de gordura. 
 
2ª ETAPA: Exame Físico-Químico 
 
O Determinação do pH: 
A determinação de pH nas carnes geralmente faz-se com reativo tornassol (liquido) ou com reativo 
tornassol papel. 
O pH das carnes é levemente ácido: 6,2 indica carnes muito fresca e, pH superior a 6,4 indica carnes 
em decomposição. 
 
Objetivo: Determinar o pH da amostra. 
 
Material: 
• Amostra de carne da etapa anterior 
• Pinça 
• Papel pH 
 
Metodologia: 
• Utilizar o líquido rosado que exsuda da amostra, e colocar em contato com o reagente tornassol papel, 
durante 5 minutos. 
• Observar na tabela de cores o pH da amostra. 
 
 
 
23 
 
Interpretação da Medida de pH em carnes in natura: 
a) pH entre 5,1 e 6,2 — carne adequada para consumo 
b) pH 6,4 — limite crítico de utilização (consumo imediato) 
c) pH acima de 6,4 — indica carne em início de decomposição 
d) pH 6,8 — carne em decomposição. 
 
3ª ETAPA: Prova de Éber para NH3 
 
Quando o pH das carnes aumenta de 6,8 para 7,0 ou mais, começam os primeiros sintomas de 
decomposição da matéria orgânica, com formação de NH3.(amônia) 
 
Objetivo:Verificar a presença de amônia. 
 
Material: 
• Amostra de carne da 1ª etapa 
• Erlenmeyer de 250 ml com tampão 
• Fio de arame. 
 
Reagentes: 
Reagente de Éber: 
• Álcool etílico (96°) - 3 partes (150 ml) 
• HCI (D =1,19) -1 parte (50 ml) 
• Éter etílico -1 parte (50 ml) 
 
Técnica: (fig. 1) 
Colocar num erlenmeyer o reagente de Éber, e suspender na boca do erlenmeyer, com o 
auxílio do fio de arame, um pedacinho de carne. O reagente, ao evaporar, contendo HCI, forma 
vapores brancos de cloreto de amônio, se a amostra contém NH3. 
 
HCI + NH3 NH4CI 
(ácido clorídrico) (amônia) (cloreto de amônia) 
 
 
4ª ETAPA: Prova de Éber para SH2 
 
Objetivo: Verificar a presença de sulfitos. 
 
Numa segunda etapa de decomposição da matéria orgânica e depois da formação de NH3, 
o gás sulfidrico aparece nas carnes, por ação dos microrganismos sobre os aminoácidos que 
contém enxofre. (metionina, cistina e cisteina) 
 
Pb(CH3C00)2.3H20 + SH2 H2O PbSH2 + 2CH3 COO- + 3H2O 
 
Pb(CH3COO)2. 3H20 + SH2 H2SO4PbSH2 + 2CH3 COO- + 3H2O 
 
Material: 
• Amostra de carne da 18 etapa 
• Erlenmeyer de 250 ml com tampão 
 
Reagente: 
 
1 - Papel reagente com acetato de chumbo a 10% 
• acetato de chumbo - 10 g 
• água destilada - 90 ml 
• placa de petri - 01 und. 
• tela de amianto - 01 und. 
• bico de bunsen - 01 und. 
 
24 
 
Corta-se o papel de filtro segundo as dimensões: 1 cm por 5 cm. Colocar uma tirinha de papel dentro 
de uma placa de petri que contém uma solução de acetato de chumbo. Deixar o papel imerso na 
solução durante 2 a 3 minutos. Retirar com uma pinça os papeis impregnados com acetato de 
chumbo e colocá-los numa placa de Petri para secá-los na estufa a 37 °C por 15 minutos ou em 
uma placa aquecedora (ou tela de amianto). 
 
2 - Ácido sulfúrico a 10% 
 
• H2SO4 (D=1,84) - 10 ml 
• Água destilada - 90 ml 
 
Obs: Vale lembrar que neste procedimento, coloca-se primeiro a água destilada e em seguida o 
ácido sulfúrico. 
 
Técnica: (Fig. 2) 
 
a) Em um erlenmeyer de 250 ml, colocarem a amostra e acrescentar o dobro do volume da 
amostra de reagente ácido sulfúrico (reação padrão). Suspender na boca de erlenmeyer uma tirinha 
de papel de acetato de chumbo (1) e tampar com algodão. Esquentar suavemente e observar o 
papel reagente. 
b) Em um erlenmeyer de 250 ml, colocar a amostra e acrescentar o dobro do volume da 
amostra de água (reação experimental). Suspender na boca de erlenmeyer uma tirinha de papel de 
acetato de chumbo (1) e tampar com algodão. Esquentar suavemente e observar o papel reagente. 
Em seguida, fazer o comparativo entre os dois papéis (com acetato de chumbo) e observar 
a presença ou ausência de gás sulfiddco na amostra, verificando a decomposição da matéria 
orgânica. 
 
 
Positivo ou Padrão: 
 
Cor amarelo-pardecento até negro: esta faixa de coloração depende das quantidades de 
SH2 presente por formação de sulfeto de chumbo. 
 
 
PROVASDE ÉBER: 
 
 
Investigação de NH3 Investigação de SH2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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25 
 
 
 
 
8. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE CONSERVAÇÃO DO OVO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Avaliar o estado de conservação do ovo, baseado nos padrões de conservação (através 
da câmara de ar). 
 
Metodologia: 
1.Pesar as amostras (ovo) separadamente. 
2. Observar a porosidade da casca do ovo através de uma lupa. 
 
 
Determinação do Tamanho da Câmara de Ar 
Um dos padrões mais importantes para conhecer a qualidade de conservação do ovo é 
determinando o tamanho da câmara de ar. 
 
Objetivo: determinar a densidade aproximada dos ovos. 
 
Material: 
• 01(uma) proveta graduada de 1000 ml. 
• 02 ovos 
• Solução de cloreto de sódio (NaCI) a 10% 
 
Metodologia: 
Colocar o ovo em uma proveta contendo solução de NaCI a 10%. 
 
Verificar: 
a) No fundo: Tamanho da câmara de ar: 
- Classe AA - 3 mm ou menos 
 
b) Flutua: Tamanho da câmara de ar: 
1. até ¼ inferior - Classe A - 6 mm ou menos 
2. até ½ ou ¾ - Classe B - 9 mm ou menos 
3. até superfície - Classe C - acima de 9 mm 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
 
 
 
Classificação dos Ovos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CLASSIFICAÇÃO SUGERIDA PELA FAO, DE ACORDO COM A ESTRUTURA 
 
Quebrar o ovo e colocar em uma placa de petri para observar: 
 
CLASSE 
AA A B C 
ESTRUTURA 
CASCA 
limpa e intacta limpa, 
praticamente 
normal 
limpa e 
levemente 
manchada 
limpa a 
moderadamente 
manchada 
CÂMARA DE AR 
com 3 mm ou 
menos 
com 6 mm ou 
menos, formato 
irregular 
com 9 mm ou 
menos, formato 
irregular 
acima de 9 mm, 
podendo estar 
livre e espumosa 
CLARA 
límpida e firme límpida, 
razoavelmente 
firme 
límpida fraca e aquosa, 
podendo estar 
presente 
pequenas 
manchas de 
sangue 
GEMA 
centralizada, 
contorno bem 
definido, sem 
defeitos 
bem defidina e 
centralizada, 
praticamente 
sem defeitos 
descentralizada descentralizada, 
aumentada, 
achatada, pode 
apresentar o 
desenvolvimento 
de germe 
 
 
CLASSIFICAÇÃO DO OVO DE ACORDO COM O PESO 
 
OVO PESO (g) 
Extra 61 
Especial 55 a 60 
Ovo tipo 1 49 a 54 
Ovo Tipo 2 43 a 48 
Ovo Tipo 3 35 a 42 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
 
 
9. ADULTERAÇÃO DO LEITE E DERIVADOS 
 
Densidade do Leite (Pasteurizado) 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Avaliar alterações sofridas na composição química do leite. 
 
 
Material: 
• Proveta de 1000 mL 
• Termolactodensímetro de Quévin 
• 1 litro de leite pasteurizado 
 
Procedimento: 
Colocar 1000 mL de leite na proveta e mergulhar o lactodensímetro, dando uma ligeira torção, 
evitando que encoste nas paredes da proveta. 
Anote a temperatura e densidade. 
 
Observação: A leitura deve ser feita na temperatura de 15 °C (ideal) se der valores menor ou maior 
que 15 °C deverá ser feita a correção. 
 
Correção: 
Se a temperatura estiver abaixo de 15 °C subtrai-se de 15 o valor lido e multiplica-se pelo fator 0, 
0002, e subtrai-se da leitura (densidade) 
Se a temperatura estiver acima de 15 °C subtrai-se do valor lido, o número 15 e multiplica-se pelo 
fator 0,0002, o resultado soma-se à leitura obtida. 
 
Lembrete: A densidade da água é igual a 1,0. 
 
RESULTADO E CONCLUSÃO: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
 
 
 
Acidez em Ácido Láctico (In natura) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Avaliar o estado de conservação do leite por meio do grau de acidez. 
 
Importância: O teste de acidez tem por finalidade avaliar o grau de acidificação ou estado de 
conservação do leite. A acidez normal está entre 15 °D a 18 °D 
 
Material: 
• Pipetas 
• Erlenmeyer de 250 mL 
• Bureta contendo solução de NaOH a0,1 N 
• Leite "in natura" 
 
Reagentes: 
NaOH 0,1 N 
Fenolftaleina a 1% 
 
Procedimento: 
Medir 10 mL da amostra e transferir para o erlenmeyer, adicionar 5 gotas de fenolftaleína e titular 
com solução de NaOH 0,1 N até o aparecimento da coloração rósea. Anotar os mL gastos na 
titulação. 
 
Cálculo: 
A=Vxfx0,9 
a 
 
A = acidez em ácido lático 
V = número de mL da solução NaOH gastos na titulação 
f = fator da solução de NaOH 0,1 N 
a = n° de mL da amostra 
0,9 = equivalente grama do ácido láctico. 
 
Observação: 
Valores da acidez em ácido láctico, padrão para o leite varia de 0,16 a 0,20 gramas de ácido láctico 
por 100m1 da amostra. Para transformar 100 mL em 10 mL da amostra, faz-se uma regra de três. 
ou seja: 
 
0,16 ------------- 0,20 -----------> 100 ml 
 
0,016 ------------ 0,020 ----------> 10 ml 
 
RESULTADO E CONCLUSÃO: 
 
29 
 
10. CONTROLE MICROBIOLÓGICO DO LEITE 
Prova de Redutase 
Determina a qualidade higiênicossanitária do leite 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Investigar o grau de contaminação do leite cru. 
 
Fundamento: tempo de descoloração do azul de metileno pela ação enzimática microbiana. 
 
MÉTODO DO AZUL DE METILENO: 
 
Introdução: 
É uma prova de seleção do leite cru. Constitui-se num dos meios práticos de determinar a quantidade 
de bactérias contidas no leite. Investiga o grau de contaminação do leite ou de envelhecimento. Pode ser 
utilizado nas usinas ou fábricas de lacticínios, para controlar a pasteurização (as redutases destroem-se a 80 
°C — 85 °C). 
 
Fundamento: 
Baseia-se no tempo de descoloração do azul de metileno pela ação enzimática microbiana (germes 
produzem substâncias redutoras que descoloram o azul de metileno). 
 
Material: 
• Leite "in natura" 
• Tubos de ensaio esterilizados 
• Provetas esterilizadas 
• Uso de Bico de Bunsen 
• Pipetas de 10 mL 
 
Reagente: 
• Azul de Metileno 
• Água destilada 
 
Técnica: 
a) Preparar a solução estoque de azul de metileno dissolvendo 1,1 g do corante seco em 500 mL de água 
destilada. Conservar a solução estoque ao abrigo da luz. 
b) No momento de usar, preparar a solução para o teste, diluindo 1 ml da solução estoque em 39 mL de água 
destilada e homogeneizar. 
c) Fazer a prova de redutase, colocando em tubo de ensaio estéril 10 ml do leite em exame e 1 mL da solução 
teste (azul de metileno) e em seguida agitar para homogeneizar. 
d) Levar o tubo a estufa a 37 °C até obter a descoloração. 
e) Fazer a leitura classificando o leite de acordo com a tabela a seguir. 
 
TEMPO QUALIDADE GERMENS 
Mais de 8 horas Muito boa 3.500 — 50.000 
De 7 a 8 horas Boa 50.000 — 100.000 
De 2 a 7 horas Regular 100.000 — 3.000.000 
De 15 min. a 2 horas Ruim 3.000.000 — 20.000.000 
Menos de 15 minutos. Muito Ruim Mais de 20.000.000 
Interpretação da Reação: 
Descoloração antes de 1 hora: leite muito contaminado 
Descoloração entre 2 a 5 horas: leite de regular qualidade 
Descoloração após 6 horas: leite muito bom 
Descoloração após 7 horas: leite pasteurizado. 
 
RESULTADO E CONCLUSÃO: 
 
 
30 
 
Prova de Lacto – Fermentação do Leite 
(Leite "In Natura") 
 
 
Objetivo: Identificar o tipo de coagulação formada para saber que tipo de bactéria (microrganismo) 
está presente. 
 
Material: 
• 20 mL de leite "in natura" 
• Tubos de ensaio esterilizados 
• Provetas esterilizadas 
• Bico de Bunsen 
• Estufa 
• Pipetas de 20 mL 
 
É uma prova prática para reconhecer o tipo de fermentação do leite. 
 
a) Tomar 20 mL do leite em um tubo de cultura esterilizado (previamente identificado) e deixar em 
estufa a 38 °C - 40 °C até coagulação. Observar o resultado com 24 horas (no máximo) 
b) Observar o tipo de coágulo formado, interpretando como segue: 
 
I. Tipo Gelatinoso: sem separação de soro. Tem sabor e cheiro de leite ácido, revelando a presença 
de bactérias do ácido tático. É uma coagulação desejável sob o ponto de vista tecnológico. 
 
II. Tipo Gasoso: a coalhada tem aspecto de queijo. Há retração do coágulo, com dissolução parcial 
e separação grande de soro. É também bom tipo de fermentação sob o ponto de vista tecnológico. 
 
III. Tipo Esponjoso: o coágulo tem aspecto de esponja. Há abundante separação do soro turvo. É 
indesejável e indica contaminação por microrganismos das fezes, rações, forragens etc. Não produz 
gases. 
 
IV. Tipo Gaseoso: coalhada irregular com separação de soro turvo e abundante produção de gases. 
É o mais perigoso tipo de fermentação não só para a saúde do consumidor, como para a indústria. 
Os coliformes são comumente os responsáveis por este tipo de fermentação. 
 
 
RESULTADO E CONCLUSÃO: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
11. CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS EM PLACAS EM 
AMENDOINS 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Detectar a presença de bolores e leveduras em amendoins, por meio do método de contagem em 
placas. 
 
Materiais: 
• 50 g de amendoim com pele 
• Agar Dextrose Batata (ADB) 
• Solução de Ácido Tartárico a 10% 
• Solução Salina Peptonada 
• Erlenmeyer de 250 ml 
• Bastão de vidro 
• Alça de Drigalski 
• Bico de Bunsen 
• Balançasemi-analítica 
• Espátula de metal 
▪ Estufa incubadora regulada a 25 °C 
 
O método de contagem de microrganismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado tanto 
para a contagem de grandes grupos microbianos, como os aeróbios mesófilos, os aeróbios psicrotrófilos, os 
bolores e leveduras e os clostridios sulfito redutores, como também para a contagem de gêneros e espécies 
em particular como Staphylococcus aureus, Bacilluscereus e Clostridium perfringens, por exemplo. 
 
Procedimento: 
1. Colocar uma porção de 25 gramas da amostra para um frasco de homogeneização, previamente 
esterilizado e tarado. Adicionar 225 ml de solução salina peptonada e homogeneizar a amostra (10-1). 
2. Dessa diluição (10-1), retirar 1,0 ml e transferir para um tubo com 9,0m1 de solução salina peptonada (10-
2). 
3. Dessa diluição (10-2), retirar 1,0 ml e transferir para um tubo com 9,0 ml de solução salina peptonada (10-
3). 
 
OBS: Para a contagem de bolores e leveduras em alimentos de umidade intermediária, recomenda-se 
macerar a amostra, homogeneíza-la e mantê-la de molho no diluente, por 5 minutos, para amolecer o produto 
e facilitar a liberação dos microrganismos presentes. 
 
Método Plaqueamento: 
• Colocar 4 gotas de solução de ácido tartárico a 10% nas placas de petri, no momento de plaquer; 
• Adicionar às placas ± 15 ml do meio ADB previamente fundido e resfriado a aproximadamente 45 °C; 
• Homogeneizar com movimentos suaves e esperar solidificação; 
• Inocular 0,1 ml de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas e, usando uma alça 
de Drigalski, espalhar o inoculo por toda a superfície do meio, até que todo o excesso de líquido seja 
absorvido; 
• Aguardar que as placas sequem (mínimo 15 minutos), incubar em estufa a 25 °C de 5 a 7 dias em 
posição normal; 
• Contagem de bolores e leveduras: Observar as placas com três dias de incubação e, caso haja 
crescimento de bolores com colônias espalhadas, efetuar a contagem com cinco dias, para prevenir 
a perda das placas por espalhamento total dessas colônias. Caso não se observe risco de 
espalhamento, reincubar as placas e contar com sete dias de incubação. 
 
OBS: A posição de incubação das placas para bolores e leveduras é diferente para outros tipos de 
microorganismos. 
 
 
32 
 
ESQUEMA DE ANÁLISE PARA CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E 
LEVEDURAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura. 3.1. Esquema de análise para contagem total, de microrganismos aeróbios mesófilos e • psicrotrófilos e bolores 
e leveduras (adaptado de UBOLDI EIROA, 1982). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
RESULTADOS: 
 
Os bolores possuem aspecto cotonoso em função da presença do agrupamento de hifas 
que forma um micélio. Podem apresentar colônias com diversas colorações. As leveduras 
apresentam colônias mucóides, de colorações diferentes.Desenhar imagem Desenhar imagem 
 
Desenhar imagem 
 
34 
 
Contagem das colônias e cálculo dos resultados 
 
 
➢ Para aeróbios psicrotrófilos, bolores e leveduras: 
 
Selecionar as placas com 25 a 250 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa, 
em um contador de colônias. No caso de bolores e leveduras, recomenda-se contar placas com 10 
a 150 colônias, em lugar de 25 a 250. Calcular o número de unidades formadoras de colônia (UFC) 
por grama ou ml da amostra multiplicando o número de colônias por 10 e dividindo pela diluição 
inoculada (UFC/g ou ml = N° Colônias x 10/ diluição). 
 
 
 
 
 
 
Contagem de fungos de uma forma geral = Y x 10 
diluição 
 
 
Exemplo 1: 10-1: Incontáveis (>250) 
10-2: 230 
10-3: 21 
 
Cálculo: 230 x 10 = 2,3 x 105 
10-2 
 
 
Exemplo 2: 10-1: Incontáveis (>250) 
10-2: 140 
10-3: 32 
 
Cálculo: 140 x 10 = 1,4 x 105 
10-2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
N° de colônias 
encontrado 
35 
 
12. CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES FECAIS E 
Escherichia COLI EM HORTALIÇAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivo: Avaliar microbiologicamente a qualidade higiênica da alface. 
 
Material: 
• 50 g de alface ou cheiro verde 
• Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) 
• Caldo Verde Bile Verde Brilhante (VB) 
• Solução Salina Peptonada 
• Erlenmeyer de 250 mL 
• Bastão de vidro 
• Pipetas de: 1mL, 2 mL, 5 mL e 10 mL 
• Bico de Bunsen 
• Balançasemi-analítica 
• Pinça esterilizada 
• Faca esterilizada 
• Alça de Platina 
• Banho Maria a 45,5 °C 
• Estufa incubadora regulada a 35 °C. 
 
Coliformes totais incluem bactérias na forma de bastonetes gram-negativos, não esporogênicos, 
aeróbios e anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas 
a 35°C. O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais se encontram tanto bactérias originárias do trato 
gastrintestinal de humanos e outros animais de sangue quente, como também de diversos gêneros e espécies 
de bactérias não entéricas como Serratia e Aeromonas, por exemplo. 
Coliformes fecais têm a mesma definição, porém, restringindo-se aos membros capazes de fermentar 
a lactose com produção de gás, em 24 horas a 44,5 45,5°C. Este grupo inclui pelo menos três géneros: 
Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) inclui cepas de origem não 
fecal. Escherichia coli é o melhor indicador de contaminação fecal. 
 
Procedimento: 
1.Transferir uma porção de 25 gramas da amostra para um frasco de homogeneização; previamente 
esterilizado e tarado. Adicionar 225m1 de solução salina peptonada e homogeneizar a amostra (10-1). 
2. Dessa diluição (10-1), retirar 1,0 mL e transferir para um tubo com 9,0mL de solução salina peptonada (10-2). 
3. Dessa diluição (10-2), retirar 1,0 mL e transferir para um tubo com 9,0 mL de solução salina peptonada (10-3). 
4.Teste presuntivo: 
• Selecionar três diluições adequadas da amostra e, com uma pipeta de, no máximo 10 mL inocular uma 
série de três tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) por diluição, adicionando 1,0 mL da diluição por 
tubo com 10 mL de LST. Incubar os tubos de LST a 35°C por 24 horas e observar se há crescimento com 
produção de gás. Em caso positivo (crescimento e produção de gás), passar aos itens subseqüentes. Em 
caso negativo, reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura, passando para os itens subseqüentes. 
5. Teste Confirmativo: 
• Tomar todos os tubos de LST com produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura 
para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile (VB). Incubar a 37°C por 24-48 horas e observar se há 
crescimento com produção de gás. Anotar o número de tubos de VB com gás confirmativo da presença 
de coliformes totais e determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou ml em uma tabela de NMP 
apropriada às diluições inoculadas. 
6. Contagem de Coliformes a 45 °C (Fecais) – E. coli 
• Tomar os tubos de LST com produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura para 
tubos de caldo E. coli (EC). Incubar a banho-maria a 45,5°C por 24 horas e observar se há crescimento 
com produção de gás. Anotar o número de tubos de EC com produção de gás, confirmativo da presença 
de coliformes fecais e determinar o NMP/g ou mL em uma tabela de NMP adequada às diluições 
inoculadas. 
 
 
36 
 
ESQUEMA DE ANÁLISE PARA CONTAGEM DE COLIFORMES 
TOTAIS/FECAIS eE. Coli PELO MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL 
(NMP) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura. 4.1. Esquema de análise:para contagem de coliformes totais/fecais eE. coli pelo método do número mais 
provável (NMP) (adaptado de UBOLDI EIROA, 1982). 
 
 
 
Observação: Para interpretar os resultados, consultar a RDC n° 12 
Grupo de Alimentos 
Item: Hortaliças, legumes e similares. 
 
 
 
 
 
 
37 
 
RESULTADOS: 
 
 
 
 
 
Foto 18 — Contagem presuntiva de coliformes: totais 
pela técnica do Número Mais Provável. 
O meio de cultura utilizado é o Caldo Lauril Sulfato de sódio. 
Crescimento com produção de gás no tubo de Durhan 
evidenciam um teste positivo. Este meio de cultura permite 
um enriquecimento seletivo dos coliformes, recuperando as 
células injuriadas. 
 
 
 
 
 
 
 
Foto 19—Contagem confirmativa de coliformes totais 
pela técnica do Número Mais Provável. 
O meio de cultura utilizado é o CaldoVerde Bile Brilhante. 
Crescimento com produção de gás no tubo de Durhan 
evidenciam um teste, positivo. O meio de cultura apresenta 
sais biliares que inibe o crescimento de microrganismos 
Gram positivos ea lactose é utilizada como substrato para 
produção de gás pelos conformes. 
 
 
 
 
 
 
Foto 20— Contagem de coliformes fecais (NMP) 
O meio de cultura utilizado é o Caldo EC, (Escherichia coli), 
seletivo para microrganismos Gram negativos em função da 
presença de sais biliares. A incubação à temperatura de 
45,5ºC em banho-maria por 24 horas permite evidenciar a 
presença dos coliformes fecais, pois eles apresentam a 
capacidade de fermentação da lactose com produção de gás 
à temperaturas mais elevadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
TABELA — Número mais provável (NMP) em 1 g de amostra com limites de 
confiança de 95%. 
 
 
Números de Positivos Tubos 
NMP/g 
Limite NMP 
0,1 (10-1) 0,01 (10-2) 0,001 (10-3) Inferior Superior 
0 0 0 < 3 - - 
0 0 1 3 0,5 9 
0 1 0 3 < 0,5 13 
1 0 0 4 < 0,5 20 
1 0 1 7 1 21 
1 1 0 7 1 23 
1 1 1 11 3 36 
1 2 0 11 3 36 
2 0 0 9 1 36 
2 0 1 14 3 37 
2 1 0 15 3 44 
2 1 1 20 7 89 
2 2 0 21 4 47 
2 2 1 28 10 150 
3 0 0 23 4 120 
3 0 1 39 7 130 
3 0 2 64 15 380 
3 1 0 43 7 210 
3 1 1 75 14 230 
3 1 2 120 30 380 
3 2 0 93 15 380 
3 2 1 150 30 440 
3 2 2 210 35 470 
3 3 0 240 46 1.300 
3 3 1 460 71 2.400 
3 3 2 1.100 150 4.800 
3 3 3 > 2.400 - - 
 
 
 
FONTE: SPECK, M. L. Compêndiumofmethods for the microbiológicas examinationoffoods. 
Washingtos, D.C: APHA, 1976. 701p. 
 
 
 
 
39 
 
REFERÊNCIAS 
 
 
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 
2008 
 
JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. 6.ed. Porto Alegre: ARTMED, 2005 
NEUSELY, S., JUNQUEIRA-AMSTALDEN, V.C. Manual de métodos de análise 
microbiológica de alimentos e água.Blucher, 2017. 
 
GERMANO, P. M. L. GERMANO, M. J. S. Higiene e vigilância sanitária de alimentos. 
5.ed. São Paulo: Varela, 2015. 
OLIVEIRA, F. JORGE, L. I. F., RITTO, J. L. A. Microscopia de Alimentos: Exames 
Microscópicos de Alimentos In Natura e Tecnologicamente Processados. Editora Atheneu, 
2015. 
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