PCR ( Reação de Polimerização em Cadeia)

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Medicina Cesmac
anabeatrizcantarelli@outlook.com
PCR:
Essa é uma técnica revolucionária que separa o gene alvo, em meio ao DNA completo, através de sondas especificas. A sonda especifica é na verdade um primer previamente construído previamente que terá sequência complementar a parte do DNA que estou querendo. Esse primer vai oferecer uma extremidade 3’OH livre e a DNA Polimerase vai fazer o resto.
Relembrando Replicação: Na fase S do ciclo celular, a DNA POLIMERASE precisa de 8hs para replicar um DNA genômico, que é enorme. Mas ela não faz isso só, ela precisa do primer e quem coloca o primer é a primase. Precisa da helicase para separar a dupla fita, precisa da topoisomerase para diminuir a tensão da fita e mantê-las separadas. E, na fita descontínua, ainda precisa da ligase, para ligar os fragmentos de okasaki. Isso acontece “in vivo”, mas “in vitro” não precisamos de todas as enzimas, e a DNA POLIMERASE usada é a de uma bactéria que é termoestável.
Significado da técnica REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA. Permite a amplificação do DNA “in vitru” (em algo não vivo, em tubinhos) igualzinha como acontece “in vivo” (no organismo vivo), se utilizando basicamente de uma reação enzimática catalisada pela enzima polimerase a qual é termoestável, ou seja, aguenta variações de temperatura, o que difere ne das outras enzimas, que são sensíveis a variações de temperatura e pH. Essa amplificação é um método extremamente rápido (cerca de duas horas), eficiente, específica e reprodutível (o resultado é sempre o mesmo sempre que for repetida, se for feito 30 vezes o resultado é o mesmo as 30 vezes), além de não ser caro.
Qual a importância da DNA POLIMERASE ser de uma bactéria? Porque é termoestável, ou seja, resistente a temperatura. E por quê? Porque ao invés de usar a helicase para separar a dupla fita do DNA, usamos a temperatura, aquecemos a 94ºC. A nossa DNA polimerase pára de funcionar a 42ºC. Procedimento: DNA+ água (usa-se uma máquina chamada de Mili Q que retira TODOS os sais. Essa água não entra na célula caso seja tomada, pois não possui sais. Ela não mata a sede) juntos num microtúbulos por duas horas na máquina de PCR. Depois, coloca-se em um gel de agarose e vai ter o resultado. Exemplo: a técnica que Angelina Jolie fez, foi essa, ela sabia que esses genes (BRCA1 e BRCA2) estavam envolvidos com o câncer de mama e ovário, devido a uma base cientifica. Como nosso genoma já foi sequenciado, previamente preparamos sondas especificas para identifica-los e descobrimos que seus genes eram mutados, o que poderia ocasionar futuros canceres.
OBS.: Essa ferramenta da PCR é importantíssima para diagnósticos precoces de doenças. Qualquer sequência alvo de DNA pode ser codificada por ela. E se eu quiser um vírus de RNA, eu posso fazer isso? Pode. Existe uma técnica que transforma o RNA em DNA chamada de CNA. Pode-se fazer isso para qualquer ácido nucleico, seja DNA ou RNA. 
Hoje, a Taq DNA polimerase é retiradas da Coli, uma bactéria, e isso é feito através da introdução do gene que é responsável pela codificação da Taq no genoma da Coli. A importância de usar a Coli é porque ela se reproduz rapidamente. Em que consiste essa técnica? Amplifica fragmentos específicos. Então, a gente parte do DNA molde, alvo, ele é nossa base, sem ele não tem amplificação. A partir da progressão, o DNA gerado vai sendo usado como base para uma nova replicação, por isso o crescimento é exponencial, porque o DNA gerado já é usado para molde de outro DNA. 
Essa replicação é feita em ciclos, esse ciclo consiste em variações de temperatura. O ciclo é composto por 3 fases, primeiro a 94 graus para abrir o DNA, depois baixa para 55 graus para o primer encontrar a região alvo, depois a temperatura sobe pra 72 graus, que é a temperatura ótima para a Taq, depois aumenta a temperatura e ela para de trabalhar, cada fase dura mais ou menos 30 segundos e em média são feitos 35 ciclos. Importante lembrar, que a sequência alvo só é obtida a partir do 3 ciclo.
Princípios da PCR: (3 Etapas)
Melting: é o aquecimento do DNA a 94ºC para abri-lo, essa fase é muito rápida, dura cerca de 30 segundos, e ocorre a desnaturação do DNA com abertura da dupla fita. Por que você consegue, aquecendo separar a dupla fita? Porque a força que une elas são ligações de hidrogênio, ligação fraca. Ela deveria ser forte? Não. Se fosse forte ia gastar muita energia pra abrir, e nossa células teriam que gastar muita energia para se renovarem. 
Annealing: Também chamada de anelamento, essa fase vai reconhecer a sequência alvo e se ligar, então, se eu fizer um teste e o primer não encontrar a região alvo? O que aconteceu? Você precisa ter controle pra afirmar se não tem a presença da sequência no paciente, para ter esse controle usa-se o controle positivo no gel, é um amostra que a gente já sabe que tem aquela sequência alvo (por exemplo uma amostra HPV positivo), se essa amostra positivo não aparecer no gel, não podemos afirmar o resultado das amostras dos pacientes, pois será duvidoso, as amostras podem ter sido contaminadas, também usamos um controle negativo, uma amostra sem o DNA alvo, então não pode aparecer nada nela. A temperatura nessa fase é muito variável, depende do primer e da região alvo, varia entre 37ºC e 65ºC.
Extension: A terceira fase é a extensão, a DNA polimerase (taq) entra em ação em uma temperatura de cerca de 72ºC, ela vê a extremidade 3’ OH livre e começa a fazer a replicação. Essas 3 fases se repetem dentro de um ciclo, então se são 35 ciclos, cada ciclo faz isso uma vez.
OBS.: Quando o resultado dá negativo mesmo, e que não foi um erro, é porque não tinha a sequência alvo.
OBS.: É preciso se preocupar com as quantidades dos reagentes que se colocam, pois, excessos de cofator (Mg++), excessos de enzimas e etc podem influenciar nos resultados.
Então, o que é colocado dentro desse tubinho? DNA Polimerase+sondas especificas (primer), e por que usamos um par de primer? Porque um primer vai pegar a fita contínua e o outro a descontínua, aumentando o número de amplificações do DNA molde. Coloca-se cloreto de magnésio, deoxinucleotídeos trifosfatos que são DNTPs, DATPs, DGTP. Coloca-se um tampão para manter o pH 8 que é o pH excelente para a DNA polimerase. E usa-se o DNA molde. A função dos primers é fornecer grupos 3’ OH para a DNA polimerase polimerizar; E ela nunca começa uma reação, ela apenas continua porque ela só faz a síntese no sentido 5´ -> 3´. Para fazer a síntese no sentido 5´-> 3´, ela precisa de uma extremidade 3’ OH livre. Portanto, sem primase não haveria replicação do nosso genoma, porque a DNA Polimerase não sabe começar a replicação, ela só faz continuar.
A taxa de erros da TAQ DNA Polimerase da bactéria é muito pequena, quase nula. A vantagem de usá-la é que sua taxa de erros é uma base a cada mil. Além de não ser inativada a temperatura elevada. Suas desvantagens, são que não tem atividade exonuclease, mas teoricamente, não precisa, como é o caso da nossa DNA Polimerase que possui essa função e ela mesma conserta os erros no DNA, e mesmo assim ainda podem passar no máximo 3 erros, depois do check point em G2. É por isso que ninguém possui genoma igual, mesmo que seja gêmeo monozigótico. 
OBS.: No nosso genoma só 8% é funcional. 92% é DNA lixo, então, a chance de uma mutação acontecer em um gene importante para mudar o fenótipo é rara. É talvez essa a importância dos íntrons nas células eucariontes. E uma mutação nos éxons? Uma mutação nos éxons pode mudar o códon, mas não muda o aminoácido já que o nosso código é degenerado (temos 3 sequencias aprox. para cada aminoácido). Às vezes muda o DNA, o códon, o aminoácido mas não muda a proteína porque às vezes há aminoácidos que possuem propriedades parecidas. Então, se eu mudei o aminoácido, não necessariamente irei mudar a função da proteína.
A PCR convencional que é a que a gente usa em larga escala e é mais barata, coloca o seu resultado em gel de agarose e dentro do gel ele vai correr. Vocês já viram qual é o princípio de um gel? Um gel de agarose é em pó e
você mistura com um tampão que é líquido, aquece no micro-ondas, forma uma solução líquida, você bota isso em uma bandeja de acrílico e ela polimeriza. Como assim polimerizar? Mistura o DNA e bota isso em um campo elétrico imerso em um tampão. Como o DNA tem carga negativa por causa do grupo fosfato você bota ele do lado negativo e liga a carga, ele vai sair do lado negativo e vai para o positivo, ao andar ele passa por dentro desse gel e marca o gel formando aquelas bandinhas.
A PCR evoluiu, hoje existem 2 grandes PCR’s, a convencional, que é a que a gente viu, e tem a outra que é a PCR real time, ela usa sondas que você vê a amplificação no computador, sem gel de agarose, uma dessas custa 50.000 reais, mas você ganha qualidade. Por exemplo, qual o tratamento para hepatite C? Interferon, que é uma droga que você usa para evitar a multiplicação do vírus. A PCR real time ajuda a medir as miligramas da sua carga viral, ele diz quantos vírus estão dentro de você e em cima dessa quantidade é prescrita a quantidade de interferon. Todo mês você faz um real time, quantifica e toma remédio em uma determinada quantidade. Depois de um ano você começa a negativar o vírus da hepatite C, vai ficar de certa forma curado.
Para diagnósticos como o mal de Huntington você faz um gel de agarose, coloca o DNA no lado negativo e ao ligar a voltagem (eletroforese), por possuir carga negativa, ele migrará para o polo positivo. A banda de DNA que está em cima é mais pesada do que a que está embaixo, as mais leves correm mais rápido. As mais pesadas tem mais repetições de CAG. Usa-se um controle positivo com 48 repetições, se o DNA teste tiver sua banda mais acima ele terá mais de 48 repetições, e fica, caracterizado esta doença. 
Para identificar defeitos em genes específicos deve-se extrair o DNA, faço uma PCR para o gene alvo. Tiro ele do gel e sequencio para verificar se você tem as mutações específicas.