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20/03/2011 1 Profa. Dr. Fabiane Moreira Farias CURSO DE FARMÁCIA DISCIPLINA: FARMACOGNOSIA Uruguaiana Forma física dos sistema de cromatografia fase estacionária em tubo cilíndrico: coluna fase estacionária sobre suporte planar: camada delgada CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA Analítica ou preparativa Estado físico da fase móvel gasosa líquida estado supercrítico CROMATOGRAFIA Polaridade relativa das fases Cromatografia gasosa: fase móvel inerte – interação se dá entre a amostra e a fase estacionária Cromatografia líquida: interação entre as duas fases (móvel e estacionária) - fase normal e fase reversa CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA Por processos físicos Adsorção: fase estacionária sólida - adsorção do soluto na interface entre o sólido e a fase móvel. Absorção ou partição: fase estacionária líquida depositada na superfície de um suporte sólido inerte, sendo que a fase móvel também é líquida. MECANISMOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRAFIA MECANISMOS DE SEPARAÇÃO ADSORÇÃO ABSORÇÃO x CROMATOGRAFIA Por processos químicos A fase estacionária é uma matriz contendo grupos funcionais ionizáveis (troca iônica). Trocadores catiônicos: sítios ativos carregados positivamente. Trocadores aniônicos: sítios ativos carregados negativamente. Cromatografia por bioafinidade: emprega grupos com especificidade biológica quimicamente ligados às matrizes: antígenos (anticorpos), enzimas (proteínas) ou lectinas (açúcares). MECANISMOS DE SEPARAÇÃO 20/03/2011 2 CROMATOGRAFIA Fases móveis e estacionárias mais utilizadas Adsorventes Amido, Sacarose Carbonato de Ca (1º) Carbonato de Mg Óxido de Mg Gel de sílica Alumina Carvão ativado Solventes Hexano Benzeno Clorofórmio Éter etílico Acetato de etila Acetona Metanol CROMATOGRAFIA Adsorventes mais utilizadas Sílica (SIO2) G, H, F Aplicada para substâncias pouco polares, como aldeídos, cetonas, fenóis, aminoácidos, alcalóides, terpenóides, esteróides. Fase normal e fase reversa CROMATOGRAFIA Adsorventes mais utilizadas Alumina (Al2O3) Características neutras, ácidas e alcalinas Solventes mais comuns: hexano, clorofórmio, diclorometano, éter etílico, acetato de etila, acetona e metanol. Empregada principalmente para alcalóides Celulose Suporte da fase estacionária líquida em cromatografia por partição. Solventes mais comuns: acetato de etila, metanol, n-butanol, água e ácido acético. Ácidos fenólicos, heterosídeos flavônicos, antocianos e saponinas. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) Adsorção ou partição. Placa de vidro recoberta com adsorvente (analítica ou preparativa). Cromatoplacas: suporte de alumínio ou plástico CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) Cálculo do RF (Fator de Retenção): distância percorrida pela amostra distância percorrida pelo solvente CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) Aplicação das amostras com micropipetas ou capilares de vidro 20/03/2011 3 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) Visualização Observação direta Observação em luz UV Soluções reveladoras CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) A B C Clorofórmio: Metanol (80:20 V/V) Fase estacionária Fase móvel SI SII (R:rutina; Q: quercetina; AC: ácido clorogênico) SI: Acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético glacial:água (100:11:11:27 V/V); SII: Acetato de etila: metanol:ácido fórmico:água (80:1:8:10 V/V) CCD analítica Espessura da sílica: 0,25 mm CCD preparativa Espessura da sílica: 0,5 mm CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) Distribuição dos componentes de uma mistura entre uma fase estacionária, disposta no interior de um tubo cilíndrico, e uma fase móvel de natureza líquida. Mecanismos de separação: Adsorção Partição Troca iônica Filtração em gel bioafinidade 20/03/2011 4 CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) Forças atuantes: Gravidade Vácuo Pressão (bombas) CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) Cobre, aço inox, alumínio, vidro, teflon, sílica fundida; Material não deve reagir com o recheio ou com a amostra; Classificadas conforme o diâmetro: preparativas - 6 a 50 mm analíticas - 2 a 6 mm capilares - diâmetro < 2 mm COLUNAS CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) Comprimento Diâmetro interno Fatores que afetam a eficiência da coluna cromatográfica Vazão da fase móvel Volume da amostra Empacotamento da coluna Úmido Seco CROMATOGRAFIA CIRCULAR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) 20/03/2011 5 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) COLUNAS Tubos de metal retos, em 8 ou em U, de material inerte e capaz de resistir a altas pressões Cada vez mais uniformes e pequenas (10 - 50 cm) analíticas: 3-5 mm d.i. preparativas: ~10mm d.i. Material de preenchimento: gel de sílica simples ou modificado (fase reversa) partículas esféricas são mais caras e eficientes Analíticas Preparativas CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) PRÉ-COLUNAS - Usadas para proteger colunas analíticas e preparativas; - Remover partículas que ficam fortemente retidas; - Mais baratas AUMENTAM A VIDA DA COLUNA!!! CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) Vantagens análises rápidas e sensíveis alta resolução (permite análise de misturas complexas) análise quantitativa com precisão de mais de 95% versatilidade automatização CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) Desvantagens alto custo de instrumentação difícil operação requer instrumentador treinado difícil análise qualitativa não tem detector universal e sensível 20/03/2011 6 CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) a b c d e a. gás de arraste b. sistema de injeção c. coluna d. detector e. sistema de tratamento de dados CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) Fase móvel He quimicamente inerte condutividade térmica custo (consumo) H2 inflamável atividade química N2 / Ar condutividade térmica (formam filme na superfície da fase estacionária, diminuindo a eficiência da coluna) CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) Fase estacionária • Fases líquidas – Colunas apolares: esqualeno - Apiezon – Colunas de média polaridade: polímeros de silicone ex.: SE30, DB5 – Colunas polares: polietilenoglicol ex.: Carbowax • Fases sólidas – Chromosorb: baseado em terras diatomáceas CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) Tipos de coluna Comprimento médio: 10 a 100 m Diâmetro interno médio: 0,1 a 1 mm Empacotadas Capilares vidro: resolução X fragilidade aço inoxidável: paredes internas muito lisa sílica fundida: resolução estabilidade térmica resistência e flexibilidade 20/03/2011 7 CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) Fatores que influenciam a separação Comprimento da coluna Diâmetro interno da coluna Espessura do filme (qto > espessura , > tr) “thin film”: amostras pouco voláteis “thick film”: amostras voláteis Tipo gás de arraste velocidade do gás de arraste temperatura da coluna CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) Vantagens análise rápida (minutos) eficiência (alta resolução) alta sensibilidade (ppm, ppb) não destrutível: permite anexar detectores como EM, IV reprodutibilidade requer pequenas quantidades de amostra (l) reprodutível e de fácil automação alta capacidade de separação menos susceptível a problemas técnicos do que CLAE20 CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) Desvantagens Só é possível analisar gases, substância voláteis ou que formem derivado volátil Substâncias termodinamicamente estáveis Requer preparação de amostras A identificação das substâncias requer o uso de técnicas espectroscópicas tais como EM. Fornece quantidades baixas em técnicas preparativas
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