02_métodos cromatográficos

Prévia do material em texto

20/03/2011
1
Profa. Dr. Fabiane Moreira Farias
CURSO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA: FARMACOGNOSIA
Uruguaiana
Forma física dos sistema de cromatografia
 fase estacionária em tubo cilíndrico: coluna
 fase estacionária sobre suporte planar: camada delgada
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA
Analítica ou preparativa
Estado físico da fase móvel
 gasosa
 líquida
 estado supercrítico
CROMATOGRAFIA
Polaridade relativa das fases
 Cromatografia gasosa: fase móvel inerte – interação se
dá entre a amostra e a fase estacionária
 Cromatografia líquida: interação entre as duas fases
(móvel e estacionária) - fase normal e fase reversa
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
Por processos físicos
 Adsorção: fase estacionária sólida - adsorção do soluto
na interface entre o sólido e a fase móvel.
 Absorção ou partição: fase estacionária líquida
depositada na superfície de um suporte sólido inerte, sendo
que a fase móvel também é líquida.
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO
CROMATOGRAFIA
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO
ADSORÇÃO ABSORÇÃO x
CROMATOGRAFIA
Por processos químicos
A fase estacionária é uma matriz contendo grupos
funcionais ionizáveis (troca iônica).
 Trocadores catiônicos: sítios ativos carregados
positivamente.
 Trocadores aniônicos: sítios ativos carregados
negativamente.
 Cromatografia por bioafinidade: emprega grupos com
especificidade biológica quimicamente ligados às matrizes:
antígenos (anticorpos), enzimas (proteínas) ou lectinas
(açúcares).
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO
20/03/2011
2
CROMATOGRAFIA
Fases móveis e estacionárias mais utilizadas
Adsorventes
Amido, Sacarose
Carbonato de Ca (1º)
Carbonato de Mg
Óxido de Mg
Gel de sílica
Alumina
Carvão ativado
Solventes
Hexano
Benzeno
Clorofórmio
Éter etílico
Acetato de etila
Acetona
Metanol
CROMATOGRAFIA
Adsorventes mais utilizadas
Sílica (SIO2)
G, H, F
Aplicada para substâncias pouco polares, como
aldeídos, cetonas, fenóis, aminoácidos, alcalóides,
terpenóides, esteróides.
 Fase normal e fase reversa
CROMATOGRAFIA
Adsorventes mais utilizadas
Alumina (Al2O3)
 Características neutras, ácidas e alcalinas
 Solventes mais comuns: hexano, clorofórmio, diclorometano,
éter etílico, acetato de etila, acetona e metanol.
 Empregada principalmente para alcalóides
Celulose
 Suporte da fase estacionária líquida em cromatografia por
partição.
 Solventes mais comuns: acetato de etila, metanol, n-butanol,
água e ácido acético.
 Ácidos fenólicos, heterosídeos flavônicos, antocianos e
saponinas.
CROMATOGRAFIA EM CAMADA 
DELGADA (CCD)
Adsorção ou partição.
Placa de vidro recoberta com adsorvente (analítica ou
preparativa).
Cromatoplacas: suporte de alumínio ou plástico
CROMATOGRAFIA EM CAMADA 
DELGADA (CCD)
Cálculo do RF (Fator de Retenção): distância percorrida pela amostra
distância percorrida pelo solvente
CROMATOGRAFIA EM CAMADA 
DELGADA (CCD)
Aplicação das amostras com micropipetas ou capilares de 
vidro
20/03/2011
3
CROMATOGRAFIA EM CAMADA 
DELGADA (CCD)
Visualização
Observação direta
Observação em luz UV
Soluções reveladoras
CROMATOGRAFIA EM CAMADA 
DELGADA (CCD)
  
A B C
Clorofórmio: Metanol (80:20 V/V)
Fase 
estacionária
Fase móvel
SI SII
(R:rutina; Q: quercetina; AC: ácido clorogênico)
SI: Acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético glacial:água
(100:11:11:27 V/V);
SII: Acetato de etila: metanol:ácido fórmico:água (80:1:8:10 V/V)
CCD analítica
Espessura da sílica: 0,25 mm
CCD preparativa
Espessura da sílica: 0,5 mm
CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)
Distribuição dos componentes de uma mistura entre
uma fase estacionária, disposta no interior de um tubo
cilíndrico, e uma fase móvel de natureza líquida.
Mecanismos de
separação:
Adsorção
Partição
Troca iônica
Filtração em gel
bioafinidade
20/03/2011
4
CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)
Forças atuantes:
Gravidade
Vácuo 
Pressão (bombas)
CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)
Cobre, aço inox, alumínio, vidro, teflon, sílica 
fundida;
Material não deve reagir com o recheio ou com a 
amostra;
Classificadas conforme o diâmetro:
preparativas - 6 a 50 mm
analíticas - 2 a 6 mm
capilares - diâmetro < 2 mm
COLUNAS
CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)
Comprimento 
Diâmetro interno
Fatores que afetam a eficiência da coluna
cromatográfica
Vazão da fase móvel
Volume da amostra
Empacotamento da coluna
Úmido
Seco
CROMATOGRAFIA CIRCULAR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
20/03/2011
5
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (CLAE)
COLUNAS
Tubos de metal retos, em 8 ou em U, de material inerte e
capaz de resistir a altas pressões
Cada vez mais uniformes e pequenas (10 - 50 cm)
analíticas: 3-5 mm d.i.
preparativas: ~10mm d.i.
Material de preenchimento:
gel de sílica simples ou modificado (fase reversa)
partículas esféricas são mais caras e eficientes
Analíticas Preparativas
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (CLAE)
PRÉ-COLUNAS
- Usadas para proteger colunas analíticas e preparativas;
- Remover partículas que ficam fortemente retidas;
- Mais baratas
AUMENTAM A 
VIDA DA 
COLUNA!!!
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (CLAE)
Vantagens
 análises rápidas e sensíveis
 alta resolução (permite análise de misturas complexas)
 análise quantitativa com precisão de mais de 95%
 versatilidade
 automatização
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (CLAE)
Desvantagens
 alto custo de instrumentação
 difícil operação
 requer instrumentador treinado
 difícil análise qualitativa
 não tem detector universal e sensível
20/03/2011
6
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
a
b
c d e
a. gás de arraste b. sistema de injeção
c. coluna d. detector
e. sistema de tratamento de dados
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
Fase móvel
He
quimicamente inerte
 condutividade térmica
 custo (consumo)
H2
inflamável
atividade química
N2 / Ar
 condutividade térmica
(formam filme na superfície
da fase estacionária,
diminuindo a eficiência da
coluna)
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
Fase estacionária
• Fases líquidas
– Colunas apolares: esqualeno - Apiezon
– Colunas de média polaridade: polímeros de silicone
ex.: SE30, DB5
– Colunas polares: polietilenoglicol ex.: Carbowax
• Fases sólidas
– Chromosorb: baseado em terras diatomáceas 
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
Tipos de coluna
Comprimento médio: 10 a 100 m
Diâmetro interno médio: 0,1 a 1 mm
Empacotadas
Capilares
 vidro:  resolução X fragilidade
 aço inoxidável: paredes internas muito lisa
 sílica fundida:  resolução
 estabilidade térmica
 resistência e flexibilidade
20/03/2011
7
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
Fatores que influenciam a separação
Comprimento da coluna
Diâmetro interno da coluna
Espessura do filme (qto > espessura , > tr)
“thin film”: amostras pouco voláteis
“thick film”: amostras voláteis
Tipo gás de arraste
velocidade do gás de arraste
temperatura da coluna
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
Vantagens
análise rápida (minutos)
 eficiência (alta resolução)
alta sensibilidade (ppm, ppb)
não destrutível: permite anexar detectores como EM, IV
reprodutibilidade
requer pequenas quantidades de amostra (l)
reprodutível e de fácil automação
alta capacidade de separação
menos susceptível a problemas técnicos do que CLAE20
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
Desvantagens
Só é possível analisar gases, substância voláteis ou que
formem derivado volátil
Substâncias termodinamicamente estáveis
Requer preparação de amostras
A identificação das substâncias requer o uso de técnicas
espectroscópicas tais como EM.
Fornece quantidades baixas em técnicas preparativas