Clonagem Animal por Transferência Nuclear

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CLONAGEM ANIMAL POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR
Derivado do grego (klon) = broto
Clonagem: Técnica de reprodução assexuada por brotamento com capacidade de produzir indivíduos geneticamente idênticos. Possui alto custo. 
DEFINIÇÃO DE CLONES: População de moléculas, células ou organismos que se originaram de uma única célula e que são idênticas à célula original e entre elas. Clones são indivíduos geneticamente idênticos.
MÉTODOS DE CLONAGEM:
Gêmeos idênticos (univitelinos): São clones naturais.
Separação de blastômeros;
Bipartição (Bissecção) embrionária; Clones artificiais.
Transferência Nuclear.
OBS: blastômeros são as células embrionárias.
GÊMEOS IDÊNTICOS:
Há 2 teorias:
Logo após a fertilização, no estágio de 2 células, a zona pelúcida rompe (se perde) devido alguma fragilidade: Nessa fase esses blastômeros estão fracamente ligados, quando ocorre o rompimento da zona pelúcida, esses se afastam. Então cada blastômero se desenvolve independentemente, produzindo indivíduos idênticos.
Eclosão do embrião: Na fase de 7-9 dias de vida o embrião está na fase de eclosão (rompe a zona pelúcida para se fixar no endométrio). Nesse processo forma-se uma fenda com abertura estreita e a massa embrionária vai saindo pela fenda, ate sair toda a massa. Fenda acaba cortando a massa formando assim 2 massas embrionárias. 
SEPARAÇÃO DOS BLASTÔMEROS:
Técnica onde na fase de 2 ou 4 blastômeros, cortava-se a zona pelúcida, e através de um chacoalhamento os blastômeros se separavam.
Hoje não é muito utilizada. 
BIPARTIÇÃO EMBRIONÁRIA:
Técnica para produzir gêmeo idêntico.
Nessa técnica pega o embrião em estagio de mórula compacta. Na luz do microscópio corta o embrião ao meio com uso de bisturi oftalmológico, formando 2 massas aproximadamente iguais. Transfere essas metades para uma receptora sincronizada, podendo ter uma gestação gemelar. Chances de 30% de ocorrer gestação, isso pq as células foram cortadas.
OBS: Esses embriões não devem ser congelados, pois perderá a zona pelúcida, já que esta está rompida.
OBS: Não haverá chances de Free Martin numa gestação gemelar, pois o embrião será cortado ao meio e terá então 2 machos ou 2 fêmeas e nunca 1 macho e 1 fêmea na gestação (condição para Free Martin).
TRANSFERÊNCIA NUCLEAR: 
Embrionária 
Fetal
AdultoMétodo usado para fazer clonagem. Envolve a transferência de núcleos: Remoção do DNA de um oócito maturo e introdução do núcleo de uma célula somática (2n). 
OBS: A célula do indivíduo adulto é mais interessante, pois já se conhece o indivíduo do qual será feito um clone. Do feto ou embrião, só se conhece o pai e mãe do indivíduo. A célula mais utilizada é o fibroblasto de pele. 
APLICAÇÕES DA CLONAGEM:
Produção de animais transgênicos (Bioreatores, modelos experimentais, xenotransplantes). Antes de colocar as células no lugar do núcleo do oócito, são tirados ou colocados genes de interesse.
Multiplicação de cópias de animais com características genéticas desejáveis. Mais utilizado no Brasil.
Preservação de raças ou espécies ameaçadas de extinção.
Pesquisa básica: herança do DNA mitocondrial; reprogramação do DNA; métodos de ativação, diferenciação celular etc.
Produção de Células Tronco de origem embrionária (clonagem terapêutica).
HISTÓRICO:
1938 - Estudo de diferenciação celular em anfíbios (SPEMANN);
1952 - Primeiros experimentos de clonagem em anfíbios (BRIGGS e KING);
1981 - Relato de Transferência Nuclear em mamíferos - blastômeros de 2 células em camundongos (ILLMENSEE e HOPPE);
1986 - Produção de clones ovinos - blastômeros de 8-16 células (WILLADSEN);
1987 - Produção de clones bovinos (PRATHER et al.);
1988 - Produção de clones coelhos (STICE E ROBL);
1989 - Produção de clones suínos (PRATHER et al);
1996 - Nascimento da Dolly a partir de células somáticasadultas (WILMUT et al.);
1997 - Nascimento de camundongos a partir de células da granulosa (WAKAYAMA et al.).
NO BRASIL
2001 - Nascimento da Vitória a partir de célula embrionária (EMBRAPA - DF);
2002 - Nascimento do Marcolino a partir de células fetais (FMVZ - USP);
2002 - Nascimento da Penta a partir de células adultas (FCAV - UNESP);
2003- Nascimento da Bela da USP a partir de célula adulta (FMVZ - USP).
ETAPAS DA CLONAGEM:
Antes disso os oócitos são aspirados de ovários em matadouros e frigoríficossão levados ao laboratórioseleciona oócitos bons e ruinsbons vão para a maturação in vitro para desenvolvimento do citoplasma, através da incubadora de CO2 em meio de cultivo com hormônioslogo após é feita a enucleação.
Enucleação do oócito (citoplasma receptor):
Consiste em retirar o núcleo do oócito, sobrando apenas citoplasma mais zona pelúcida, chamado citoplasma receptor.
São necessários:
Microscópio de alta definição;
Micromanipulador: sistema hidráulico para suavizar movimentos da pipeta no momento da enucleação.
Em bovinos, não dá para ver o núcleo do oócito, então podemos fazer 2 métodos para observação do núcleo:
Corar DNA com corante específico;
Utilizar corpúsculo polar (qd núcleo do oócito se divide) para localizar núcleo. O núcleo estará no citoplasma adjacente ao corpúsculo polar.
CITOPLASMA RECEPTOR:
Oócitos em MII enucleados com auxílio de micromanipulador;
ENUCLEAÇÃO POR ASPIRAÇÃO: remoção de parte do citoplasma adjacente ao 1o CP.
Transferência da célula doadora de núcleo para o oócito enucleado (reconstrução): Há 2 formas de fazer:
Pode aspirar fibroblastos com pipetafurar o oócito com a própria pipetajogar célula dentro do oócito (é muito invasivo).
Colocar a célula diplóide em contato membrana-membrana com o oócitoaplicação de choque (eletrofusão)membrana funde núcleo diplóide entra no oócito.
RECONSTRUÇÃO:
Transferência do núcleo da célula doadora para o citoplasma receptor (eletrofusão ou microinjeção).
Tipos celulares: embrionárias (blastômeros), fetais e adultas (fibroblasto, cumulus, etc.).
OBS: Células do cumulus também podem ser usadas para reconstrução, produzindo apenas embriões fêmeas, enquanto que com fibroblastos há produção de embriões machos e fêmeas.
CULTURA DE FIBROBLASTO:
OBS: As células somáticas mais usadas hoje são os fibroblastos (pele). São células diferenciadas que qd colocadas no oócito, desdiferenciam, cresce e formam o embrião. Essas células são cultivadasqd células 100% confluentes (após 15 dias)congelardescongelar em micromanipuladorreconstrução.
Após 15 dias(confluência)
CARÊNCIA DE SORO:
Cultivo em meio com
 
0,5% de soro por 2- 5 dias. 
RECONSTRUÇÃO:
Fusão da célula doadora com o citoplasma (eletrofusão):
Descrito acima.
Choque e fusão das 2 membranas.
ELETROFUSÃO:
SUCESSO NA ELETROFUSÃO:
Tipo celular (tamanho) e Contato entre membranas!!!
Câmara de eletrofusão.
Meio de fusão (Zimmermman, Manitol 0,28M).
Resultados: 10 - 60%. 
Ativação:
Estímulo para embrião começar a se dividir até chegar à fase de mórula (blastocisto) para ser transferido para uma receptora sincronizada.
É feito através mecanismo físico (choque) + químico (Cálcio, álcool).
ATIVAÇÃO ARTIFICIAL:
Mitose e início do desenvolvimento embrionário;
 [Ca] intracelular;
Métodos utilizados: físicos e/ou químicos (estímulo elétrico, álcool, cálcio, estrôncio etc);
Melhores resultados com combinação de estímulos (físico e químico).
 Cultivo dos embriões clonados:
Cultivar até atingir mórula.
CULTIVO EMBRIONÁRIO:
Embriões reconstruídos são cultivados por 7 a 9 dias em estufa CO2, 39oC com alta umidade.
Condições idênticas às da FIV (meios quimicamente definidos ou co-cultivo com células da granulosa).
Transferência para receptoras.
FONTE DE OÓCITOS:
Ovários de matadouro e frigorífico.
OBS: Oócitos não precisam ser da mesma espécie, mas de aparentados. Ex: clone de zebra com oócito de égua.
DESENVOLVIMENTO PÓS-TRANSFERÊNCIA:
Técnica extremamente ineficiente;
Taxa prenhez até 90 dias: < 30%;
Taxa nascimentos < 3% (Westhusinet al., 2001);Alta mortalidade pós-parto: problemas renais, cardiopulmonar, imunológico, síndrome da prole gigante (“largeoffspringsyndrome”). 
Principais causas das baixas taxas: falha na expressão de genes (reprogramação nuclear), placentação anormal, falha no reconhecimento materno da gestação.
OBS: Alta taxa de aborto (principalmente por falhas de desenvolvimento placentário).
FIBROBLASTO FETAL:
Primeira gestação: efetiva. 
Segunda gestação: Receptora desenvolveu hidroalantóide;
Terceira gestação: abortamento no 8° mês de gestação. 
Porem as características dos três clones eram mt parecidas.	 Experimento
FIBROBLASTO ADULTO:
Apenas 2 com sucesso ate hoje. 
QUESTÕES IMPORTANTES:
Idade biológica dos clones:
Estudo dos telômeros (DNA nas terminações dos cromossomos); os clones nascem com idade normal. 
Clone apresenta idade da célula doadora de núcleo? Não.
Os telômeros aumentem de tamanho à medida que o animal envelhece. Os estudos mostraram que estavam normais em clones.
Os clones são idênticos?
Fenotipicamente não.
Mutações das células doadoras, herança do DNA mitocondrial (mais importante), influência dos ambientes in vitro e in vivo (fatores epigenéticos).
Citoplasma: possui mitocôndrias com DNAcontaminação do clone com DNA mitocondrial de diferentes animais. Para evitar esse fato, faz-se clone com uso de oócito e célula somática de uma mesma fêmea.