AULA MÉTODOS E MICROSCOPIA.

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AULA 1 – MÉTODOS EM BIOLOGIA E TIPOS DE MICROSCOPIA.
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Professora Liliana Guerreiro
ENTENDENDO A BIOLOGIA. MICROSCOPIA E MÉTODOS.
1º) A História do Microscópio.
A - Anthony Van Leeuwenhoeck. Monta o primeiro microscópio.
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B – Robert Hooke ( 1665).
Usando um microscópio mais aprimorado, observou cortes finos de cortiça, que se apresentavam ao microscópio com um aspecto similar a pequenos favos de mel empilhados. 
 A cada um destes favos Hooke atribuiu a designação de cellulae (células).
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3º)MICROSCOPIA NA ATUALIDADE
Os microscópios atuais, permitem aos cientistas a capacidade de estudar estruturas diversas (vivas ou não), aprofundando nosso conhecimento de uma maneira nunca antes pensada. Para um melhor entendimento de uma imagem atual, temos que diferenciar “LIMITE DE RESOLUÇÃO” e “PODER DE AUMENTO”. Veja, se uma fotografia for ampliada e observa a olho nu, a imagem terá AUMENTO. Porém, os pontos da imagem separados por menos de 100µm, serão vistos como um ponto só e aparecendo borrado. Isso significa que, ao ampliarmos a imagem não melhoramos sua definição. A imagem fica ampliada mas embaçada.
Isso é explicado pelo fato do olho humano apresenta um limite de resolução da ordem de 0,1mm. Logo, dois pontos de uma imagem separados por distância de menos de 0,1mm aparecem como uma só imagem. Os microscópios da atualidade, superam essa diferença. Logo, possuem maior poder de aumento e maior poder de resolução.
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MEDIDAS ATUAIS USADAS NO ESTUDO DA CÉLULA.
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MEDIDAS ATUAIS USADAS NO ESTUDO DA CÉLULA.
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O MICROSCÓPIO ÓPTICO.
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GENERALIDADES SOBRE O MICROSCÓPIO ÓPTICO
1ª) Amplia um objeto a ser estudado.
2ª) Funciona com um conjunto de lentes que atuam nessa ampliação.
3º) Pode usar iluminação natural ou artificial.
4º) Possui um sistema mecânico que suporta e permite controlar o sistema óptico que atua na ampliação das imagens.
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Ocular
Canhão
Revólver
Objetivas
Braço
Platina
Fonte luminosa
Diafragma
Pé ou base
Parafuso macromético
Parafuso micromético
Pinças
Condensador
OBSERVE AS PARTES DO MICROSCÓPIO ÓPTICO
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 Oculares: Ampliam a imagem fornecida pelo sistema de objetivas.
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Canhão (Tubo): Serve de suporte ao sistema ocular.
 PRISMAS:
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Braço: Suporta a platina e ao revólver.
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 Revólver: serve de suporte às objetivas e permite a mudança delas.
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Objetivas: Ampliam a imagem do objeto que está sendo observado.
 OBJETIVAS
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Platina:Serve de suporte para a colocação do material que vai ser observado. Observe que a mesma apresenta uma abertura central para a passagem da luz.
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8 - Condensador móvel;
9 - Diafragma Íris; 
10 - Polarizador; 
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Diafragma: regula a intensidade de luz captada da fonte luminosa. Observe que o mesmo apresenta um pino que ao ser manipulado abre ou fecha o mecanismo central.
Condensador: Distribui a luz que atravessa o diafragma. 
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1 - Diafragma Íris; 
2 - Condensador móvel;
3 - Polarizador. 
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DIAFRAGMA ÍRIS
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Fonte de Luz: Pode ser natural quando se usa um espelho refletor ou artificial.
Espelho que reflete a luz natural para o diafragma, objetivas e oculares
Fonte artificial.
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Parafusos Macrométrico e Micrométrico: Permitem movimentos de maior ou menor amplitude, afastando ou aproximando a preparação estudada.
 Macrométrico 
 Micrométrico 
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Base ou pé: Suporte de todos os elementos do microscópio.
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Transportá-lo com ambas as mãos, apoiando a base numa delas e segurando o braço com a outra.
Ao colocá-lo sobre a mesa, mantê-lo a alguma distância do bordo.
Evitar molhá-lo ao usar preparações temporárias.
As lentes são peças muito caras. Para as limpar, deve usar a flanela que normalmente acompanha o aparelho.
Após a utilização, encaixar a objetiva de menor ampliação alinhada com a ocular.
CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO
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MICROSCOPIA ELETRÔNICA
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OBSERVE UM MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO E MICROFOTOGRAFIAS ELETRÔNICAS
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Microscópio eletrônico de varredura: Permite a visualização de aspectos tridimensionais do objeto estudado.
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VEJA O PODER DE AUMENTO EM :http://www.neurofisiologia.unifesp.br/eletronica.htm 
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Microfotos em Varredura
Imagem de uma formiga feita com um Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). O MEV um equipamento que produz imagens de alta resolução. Ao contrário das imagens formadas pela radiação de luz, presente no microscópio óptico, as imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual, pois o que é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida por elétrons. Para entender o princípio de funcionamento do MEV, leia o texto "Microscópio Eletrônico de Varredura" em página sobre equipamentos dos laboratórios do Departamento de Geologia da Universidade Federal de Ouro Preto: http://www.degeo.ufop.br/laboratorios/microlab/mev.htm 
Publicado em 13 Mar 2009 Atualizado em 13 Mar 2009 
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OBSERVE OS ASPECTOS TRIDIMENSIONAIS DO INSETO ESTUDADO
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GRÃO DE PÓLEM NO GINECEU DE UMA FLOR E ISOLADO.
Fonte: http://danibiociencias.blogspot.com/2011/01/fotos-de-microscopia-de-varredura.html 
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Fonte: Foto Stock: E coli Bacteria close up ID da Imagem:72915928
http://www.shutterstock.com/ 
BACTÉRIAS EM VARREDURA 
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APLICAÇÃO INDUSTRIAL
ESTUDO DE FRATURA EM FILAMENTOS DE LÂMPADAS INCANDESCENTES.
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FRATURA QUE, AO LONGO DO TEMPO PODE QUEBRAR O FILAMENTO DIMINUINO ASSIM O TEMPO DE VIDA ÚTIL DA LÂMPADA.
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PROCESSAMENTO DE MATERIAL BIOLÓGICO
PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
Preservação das estruturas o mais semelhante à sua situação in vivo
Consistência “endurecer os tecidos e as células” 
Impedir a autólise 
Impedir a atividade e a proliferação de bactérias 
Resistência às etapas seguintes da técnica citológica
Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes citológicos
1º) FIXAÇÃO DE TECIDOS
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FÍSICOS
Calor - Fixação de bactérias leveduras
QUÍMICOS 
Substâncias químicas que preservam a estrutura e composição química dos tecidos.
Álcoois (metanol, etanol)
Fixadores com mercúrio (Zenker)
Fixadores com ácido pícrico (Bouin)
Glutaraldeído
Formaldeído
Tetróxido de ósmio
MÉTODOS DE FIXAÇÃO
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pH;
Osmolaridade;
Velocidade de penetração dos fixadores (2-3 mm espessura);
Volume de fixador;
Concentração do fixador;
Temperatura;
FATORES QUE AFETAM A FIXAÇÃO
MENSAGEM: Normalmente em laboratório temos a utilização das “misturas fixadoras” que são preparações químicas que fixam ao mesmo tempo os componentes ácidos e básicos do material a ser estudado.
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Consiste na remoção da água livre do tecido fixado, por ação do álcool.
A maior parte dos meios de inclusão são insolúveis em água, o que obriga a proceder a uma desidratação das amostras a incluir.
Série de álcoois de concentração crescente: 70º, 95º e 100º
DESIDRATAÇÃO
Passagem dos fragmentos de tecido fixados e desidratados por uma substância diafanizadora miscível com a substância de inclusão.
Ex: Xilol, Toluol, Benzol
A peça fica com aspecto mais claro e translúcida	
DIAFANIZAÇÃO
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Infiltração do tecido por uma substância impregnante (parafina líquida). Este procedimento é feito na estufa.
PROCESSADORES AUTOMÁTICOS
IMPREGNAÇÃO
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O tecido é colocado em suportes metálicos cheios de parafina líquida, que depois de solidificar permite cortar o tecido em secções finas. 
INCLUSÃO
Os tecidos têm de ser alinhados e orientados de acordo com as suas características e objetivos do trabalho.
Corte transversal
Corte longitudinal
Corte oblíquo
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A parafina solidifica à temperatura ambiente mas a polimerização é feita normalmente no frio.
POLIMERIZAÇÃO
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Os blocos incluídos são cortados em micrótomos
A espessura do corte deve estar compreendida entre 3 a 10 m
CORTE
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Colocam-se as secções a flutuar em banho-maria 
Colocam-se os cortes numa lâmina 
Estufa
APÓS O CORTE
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MATERIAL TECIDUAL CORTADO É LEVADO AO “BANHO MARIA”
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Laboratório de Biologia 05|06
As células e as estruturas dos tecidos são transparentes e incolores com índice de refração muito próximo, o que dificulta a sua observação. 
Recorre-se à utilização de corantes histológicos para evidenciar estas estruturas. 
Corantes básicos têm maior afinidade por moléculas ácidas como o DNA e o RNA que são estruturas basófilas. 
Corantes ácidos têm maior afinidade por moléculas básicas presentes em algumas proteínas, acidófilas. 
COLORAÇÃO
20x
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TÉCNICAS ESPECÍFICAS
Centrifugação diferencial em gradiente de sacarose
Amostra de tecido e retirada do órgão.
1 – A amostra é “macerada” em um tubo.
Etapas sucessivas de centrifugação em sacarose, separam os diversos componentes da célula de acordo com seu peso molecular, o que permite o seu estudo em separado após coleta do material.
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A molécula A tem uma afinidade intensa e específica por uma porção da molécula B.
 
(2) Se A e B são colocadas em contato, A se liga com a porção de B que ela reconhece. 
(3) Um marcador, visível em microscopia de luz ou eletrônica, pode ser ligado à molécula A. O marcador pode ser um composto fluorescente, uma enzima como a peroxidase, uma partícula de ouro ou um átomo radioativo. 
(4) A molécula B pode ser detectada se estiver presente em uma célula ou na matriz extracelular que forem incubadas com a molécula A.
TÉCNICAS ESPECÍFICAS
Substâncias que têm grande afinidade por uma molécula podem ser marcadas e usadas para identificar esta molécula. 
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INTERPRETAÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS
Observando os diversos tipos de situações colocadas ao lado, podemos imaginar que, se a mesma fosse um segmento do intestino ou outro órgão, poderíamos ter vários tipos de cortes para pesquisa.
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CORTES ESQUEMÁTICOS DO DUODENO.
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MICROVILOSIDADES EM MICROSCOPIA DE TRANSMISSÃO.
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MICROVILOSIDADES EM MICROSCOPIA DE VARREDURA.
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1 – Veículo
 Tampão (ex.: fosfato, bicarbonato, cacodilato, S-colidina) que pode ou não conter aditivos como cálcio ou sacarose 
 Meio em que as células vivem, como água do mar para o plankton ou meio de cultura para células em cultura
2 – pH
 Deve estar compreendido entre 7,2 a 7,4, embora se possam conseguir fixações razoáveis na gama dos 6 a 8.
 
3 – Osmolaridade
- Deve estar próxima da osmolaridade do meio extracelular, embora os fixadores ligeiramente hipertónicos produzam em regra bons resultados.
Após o corte:
1 - Colocam-se as secções a flutuar em banho-maria:
estica os cortes
ajuda e remover rugas
Colocam-se os cortes numa lâmina 
Estufa
secar
cortes aderirem à lâmina