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biorreatores 2

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26/03/2013 
1 
Estágios no processo 
produtivo 
Aula 2 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo 
Ciências Físicas e Biomoleculares 
IFSC - USP 
1- Os três estágios do bioprocesso 
2- Biorreatores 
3- Upstream 
 3.1– Escolha do Biocatalisador 
 3.2 – Obtenção do Biocatalisador 
 3.3 – Conservação do Biocatalisador 
 
Estágios no processo 
produtivo 
26/03/2013 
2 
1. Os três Estágios do 
bioprocesso 
Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios: 
Processo “Upstream” 
Biorreatores e biorreação 
Processo “Downstream” 
26/03/2013 
3 
Upstream 
Biorreação 
/Biorreator 
Downstream 
Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas 
mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas, 
microrganismos ou enzimas sobre condições controladas para a 
biotransformação de matérias primas em produtos 
 
Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um 
produto direto – biorremediação, desintoxicação de resíduos 
ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados 
 
Produto – alimento, medicamento ou composto industrial 
 
Escala laboratorial Escala industrial 
 
Estágios do processo produtivo 
26/03/2013 
4 
2. Biorreatores 
Biorreator ou fermentador 
Biorreatores, reatores 
bioquímicos, reatores biológicos 
são os reatores químicos nos 
quais ocorrem uma série de 
reações químicas catalisadas por 
biocatalisadores 
26/03/2013 
5 
Biorreator de 90L 
Biorreator de bancada 
http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930 
Biorreator ou fermentador 
http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor 
3- Processo Upstream: 
 a escolha do biocatalisador 
26/03/2013 
6 
Processo “Upstream” 
• Escolha do biocatalisador 
• Preparo da matéria prima ou substrato a ser processado 
• Preparação de meio e sua esterilização 
• Alimentação do biorreator 
• Regulação de temperatura, pH e pressão 
• Inoculação da cultura no meio assepticamente 
 
 
Biorreação 
Características gerais desejáveis de microrganismos para 
aplicação industrial: 
1. Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato 
em produto; 
2. Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter 
elevada concentração do produto no caldo fermentado; 
3. Não produzir substâncias incompatíveis com o produto; 
4. Apresentar constância quanto ao comportamento 
fisiológico; 
5. Não ser patogênico 
6. Não exigir condições de processo muito complexas; 
7. Não exigir meios de cultura dispendiosos; 
8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio. 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
7 
1 - Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em 
produto; 
Matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final 
(38 a 73% do custo total de produção) 
 
C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 
1 g glicose 0,511g de etanol 
S. cerevisiae rendimento de 90% da reação de fermentação anaeróbia 
Destilação - perda 
 
Quando o produto é produzido em menor quantidade em relação ao açúcar 
consumido (enzimas ou antibiótico) o custo com a recuperação do 
produtos são mais onerosas 
Processo “Upstream” 
2 - Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter 
elevada concentração do produto no caldo fermentado; 
 
Sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo 
 
 
3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto; 
 
Sem produzir proteases extracelulares 
 
Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulem 
menos compostos intermediários incrementam a síntese do 
produto 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
8 
3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto; 
Exemplo: 
 
Aspergillus produz glicoamilase 
 
 glicoamilase 
Amido Glicose 
 
 Várias aplicações (xaropes de glicose na 
 indústria de alimentos) 
 
Alguns microrganismos também sintetizam transglicosidase 
que polimeriza a glicose novamente, porém de uma forma que 
não são mais hidrolisadas pela glicoamilase 
Processo “Upstream” 
Característica importante: Estabilidade fisiológica da linhagem 
 
Não basta uma linhagem hiperprodutora de uma substância, 
mas que se conheça as técnicas mais adequadas para sua 
conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente 
produtora da substância de interesse ao longo de todas as 
etapas envolvidas desde sua proliferação no laboratório, 
germinadores e biorreator principal 
Processo “Upstream” 
4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico 
26/03/2013 
9 
 
Para a célula há sempre a tendência de otimizar o crescimento, 
em detrimento da síntese do produto, motivo pelo qual não 
basta verificar se a célula cresce, mas se ela continua a 
acumular o produto de maneira eficaz!! 
 
Durante a proliferação da célula há sempre chances de 
mutações naturais!! 
Massa pequena de células no inóculo 
 
 
Biorreatores de dezenas de milhares de litros 
10g de matéria seca de células/ L 
Processo “Upstream” 
5. Não ser patogênico!! 
Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas 
seguintes ao término da fermentação (downstream) 
 
Se manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de 
dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante 
aumentados, o que incidiria em custos adicionais 
 
São utilizados patógenos para produção de vacinas em reatores de 
pequeno porte (poucos milhares de litros), porém confinados em 
câmaras assépticas, tomando-se precauções necessárias para a não 
contaminação do meio ambiente 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
10 
Técnicos do 
Instituto Butantan 
trabalham na área 
de fermentação da 
linha de produção de 
vacinas 
http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumFotos_301191.shtml?foto=3 
http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php 
Fort Dodge (Pfizer) 
26/03/2013 
11 
6. Não exigir condições de processo muito complexas 
pH e Temperatura: em reatores de grande porte não há controle 
preciso, por isso o ideal é que o microrganismo tenha uma faixa 
de valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais, 
particularmente no que se refere ao acúmulo do produto 
Processo “Upstream” 
Heterogeneidade ao longo da altura do reator 
Reatores de grandes portes 
(dezenas de milhares de L) 
Importante: células devem manter seu 
desempenho dentro de uma faixa de 
valores ótimos!! 
pH e oxigênio 
26/03/2013 
12 
Biotecnologia do bioprocesso 
6. Não exigir condições de processo muito complexas 
Tensão de oxigênio: os microrganismos que conseguem manter 
um bom desempenho quando cultivados em baixas concentrações 
de oxigênio são muito interessantes 
 
 Há maior gasto de energia para 
a agitação e aeração do meio! 
Processo “Upstream” 
Biotecnologia do bioprocesso 
Tensão de oxigênio: 
Processo “Upstream” 
Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por 
exemplo) são evitados, pois a concentração de oxigênio no meio de 
cultivo terá de ser mais elevada, a fim de que as células mais internas 
destes aglomerados tenham acesso a este oxigênio, quando 
comparadas às células que crescem isoladamente 
26/03/2013 
13 
Biotecnologia do bioprocesso 
Não é conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma 
quantidade exagerada de proteínas para o meio 
 Geração de espuma. 
Isso torna complexo os processos aeróbios 
devido à necessidade de aerar e agitar o 
conteúdo do biorreator 
6. Não exigir condições de processo muito complexas 
Processo “Upstream” 
Biotecnologia do bioprocesso 
7. Não exigir meio de cultura dispendioso 
1. Ser o mais barato possível; 
2. Atender às necessidades nutricionais do microrganismo; 
3. Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser 
ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas do 
pH, ou evitar uma excessiva formação de espuma; 
4. Não provocar problemas na recuperação do produto; 
5. Os componentes devem permitir algum tempo de 
armazenagem, a fim de estarem disponíveis o tempo todo;6. Ter composição razoavelmente fixa; 
7. Não causar dificuldades no tratamento final do efluente. 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
14 
Biotecnologia do bioprocesso 
7. Não exigir meio de cultura dispendioso 
Meios sintéticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composição 
conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante. 
 
Para células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, 
espera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de 
não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação do 
produto final. 
 
 
 
Meios definidos ou sintéticos podem ser preferidos se permitirem uma 
maior economia nas etapas de recuperação do produto 
Processo “Upstream” 
Biotecnologia do bioprocesso 
7. Não exigir meio de cultura dispendioso 
Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como 
aminoácidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc) 
 
Adiciona-se as substâncias puras para manter o meio em sua forma 
mais definida – No entanto... Isso pode se tornar inviável 
financeiramente quando as instalações são de grande porte. 
 
Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de 
levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de 
malte, peptona (hidrolisado de proteínas) etc 
 
Problema: substâncias caras, composição variável (ao longo do 
tempo de armazenagem e na dependência do fabricante e do lote 
empregado) – oscilação no processo fermentativo!!! 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
15 
Biotecnologia do bioprocesso 
7. Não exigir meio de cultura dispendioso 
Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos 
processos fermentativos em grande escala: 
 
Matérias-primas naturais: caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas 
diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), água de maceração de 
milho (Corn Steep Liquor) etc 
 
•Composição química desconhecida 
•Pode-se conhecer os teores de açucares disponíveis, nitrogênio, fósforo, 
mas não se conhecem os teores dos sais minerais 
•Sempre são completados com alguns sais (contento nitrogênio e fósforo) 
 
Variação conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima, 
processamento durante colheita e estocagem etc – oscilações no processo 
fermentativo!! 
Processo “Upstream” 
Biotecnologia do bioprocesso 
7. Não exigir meio de cultura dispendioso 
Empresas que produzem antibióticos ou enzimas e que utilizam essas 
matérias primas naturais, principalmente a água de maceração de milho, 
devem manter uma planta piloto para o ajuste da composição do meio a 
cada novo lote de matéria-prima recebida para evitar surpresas nos 
biorreatores de grande porte 
 
Por serem as mais baratas são as mais utilizadas 
 
Porém podem causar problemas adicionais na recuperação e purificação 
do produto final, bem como problemas nos tratamentos das águas 
residuárias 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
16 
Biotecnologia do bioprocesso 
8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio 
•Se o produto é liberado no meio, ele poderá ser recuperado nas 
etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de 
lise celular e outras reações que elevam o custo 
 
•Se algum produto permanecer dentro das células ele poderá ser 
perdido após a separação das células do meio após a fermentação 
 
•Pode haver uma eventual inibição do próprio microrganismo pela 
retenção de um dado produto do metabolismo 
 
•Retenção de certos produtos nas células depende entre outros 
fatores de: linhagem empregada, da composição do meio de cultura e 
das condições impostas (pH, temperatura, etc) 
 
Processo “Upstream” 
3.2. Obtenção de Biocatalisadores 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
17 
3.2. Obtenção de Biocatalisadores 
Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser 
obtidos basicamente das seguintes formas: 
 
• Isolamento a partir de recursos naturais 
• Compra em coleções de culturas (ATCC, NCTC...) 
• Manipulações genéticas: 
1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais 
2. Fusão de protoplastos 
3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de 
engenharia genética 
Processo “Upstream” 
Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais 
 
•Solo 
•Água 
•Plantas 
 
 
 
 
 
Atividade de grande importância para obtenção de novas 
linhagens de interesse industrial como linhagens melhor 
produtoras de um dado produto. Além disso, pode conduzir 
à descoberta de novos produtos, o que confere a esta 
prática uma relevância inequestionável 
Muito trabalho experimental 
Custo relativamente elevado 
Biotecnologia do bioprocesso 
Processo “Upstream” 
26/03/2013 
18 
Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais 
Compra em coleções de culturas 
Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA) 
 
American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA) 
http://www.atcc.org/ 
 
Coleção de Culturas Tropical – (Campinas-SP) 
http://www.cct.org.br 
 
National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido) 
http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp 
 
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha) 
•Disponíveis em vários países 
•Compra bastante viável 
•Facilidade através dos recursos da Internet 
Microrganismos produtores de antibióticos, em geral, não estão 
disponíveis em uma coleção de culturas 
 
Oriundos de programas de melhoramento genético 
26/03/2013 
19 
Manipulações genéticas 
1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais 
2. Fusão de protoplastos 
3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de 
engenharia genética 
 
Biotecnologia do bioprocesso 
Processo “Upstream” 
Obtenção de mutantes induzidos por 
métodos convencionais 
Proliferação celular mutação natural 
Isolados 
 
 
Potencialidade de produção 
- Mutantes naturais – muito tempo 
 
- Métodos que forçam a mutação: radiações ultra-violeta, substâncias 
químicas (nitrosoguanidina) 
 
Destrói-se a maioria das células e recuperam-se as mutadas 
 
 
Verifica-se se a mutação ocorreu na direção desejada 
Mutação – deleção ou adição de 
uma ou mais partes químicas 
da molécula do DNA 
26/03/2013 
20 
Penicillium chrysogenum NRRL 1951 
Modificada por mutações 
Produção de penicilina aumentou de 
120 UI para 2580 UI (20x) 
Mutação pode levar à perda da função de 
características indesejadas ou aumento da 
produção por perda das funções de controle 
Raramente leva ao aparecimento de novas 
funções ou propriedades 
 
Utilizar em microrganismo com a 
característica desejada para melhoramento 
Fusão de protoplastos Protoplastos 
Frágeis – sem parede celular 
Sem capacidade reprodutiva 
 
Sem parede celular, a 
probabilidade de fusão 
celular entre diferentes 
espécies aumenta 
26/03/2013 
21 
Protoplasto 
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg 
Protoplastos 
de células das 
folhas de 
petúnias 
Protoplasto de 
fusão da célula 
da folha com a 
da pétala 
Digestão da 
parede celular 
Fusão de protoplastos 
Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas 
 
1. Protoplastos são preparados cultivando as células em meios 
isotônicos enquanto tratam-nas com enzimas; 
 
2. Os protoplastos são regenerados usando estabilizadores osmóticos 
como a sacarose; 
 
3. Se a fusão ocorre para formar híbridos, os recombinantes desejados 
são identificados através de meios seletivos; 
 
4. Após a regeneração da parede celular, o microrganismo pode ser 
utilizado para futuros estudos. 
26/03/2013 
22 
- Fusão pode ser realçada usando polietileno glicol e 
tratamento das preparações com irradiação ultravioleta 
 
- Fusão de células humanas ou de animais 
 
-Usado para o melhoramento da produção de antibióticos por 
combinar mutações de diferentes linhagens ou até mesmo 
espécies 
 
-Facilita a transferência de DNA recombinante 
 
-Método de associar grupos inteiros de genes entre diferenteslinhagens de macro- e microrganismos 
 
Fusão de protoplastos 
Fusão de células de mamíferos que levam à produção de 
 anticorpos monoclonais. 
 
Anticorpos são a principal defesa dos mamíferos. Uma célula de linfócito 
B produz um único tipo de anticorpo 
 
A produção de linfócitos B em meios de cultura não teve sucesso pois 
eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos 
 
1975 – Georges Köhler e Cesar Milstein 
 demonstraram a produção de anticorpos monoclonais de um hibridoma 
(produto de fusão) de Linfócitos B (células produtoras de anticorpos) e 
células tumorais de mieloma 
 
1984 – Prêmio Nobel 
 
1990’s – o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia 
US$ 6 bilhões!!! 
 
 
Fusão de protoplastos 
26/03/2013 
23 
Mudança: 
 
Células secretoras de 
anticorpos 
com tempo de vida limitado 
 
 
 
 
 
Células com capacidade 
contínua de crescimento 
(imortais) que mantém o 
potencial de secretar 
anticorpos 
Fusão de protoplastos 
Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde 
 
Aplicações do anticorpo monoclonal: 
 
-Diagnóstico in vitro em saúde humana, plantas e agricultura 
animal 
 
-Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga 
citotóxica para o sítio de células cancerígenas 
 
-Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta 
afinidade para ligar e purificar produtos caros 
Fusão de protoplastos 
26/03/2013 
24 
Diagnóstico imunológico 
Aplicações do anticorpo monoclonal 
Obtenção de microrganismos recombinantes por 
técnicas de engenharia genética 
26/03/2013 
25 
Linhagens instáveis limitam o emprego de sistemas de 
fermentação mais eficientes, como processos contínuos, pois 
poderá acontecer, ao longo do tempo, a seleção de células que 
privilegiem o crescimento em detrimento do acúmulo do produto 
•Linhagens naturais 
•Linhagens mutantes 
 
 
Células recombinantes por introdução de plasmídeos podem 
ser instáveis 
Obtenção de microrganismos recombinantes por 
técnicas de engenharia genética 
26/03/2013 
26 
3.3 - Conservação do 
Biocatalisador 
Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no 
bioprocesso, ela deve ser conservada 
Técnicas de conservação: 
 
-Transferência ou sub-cultura periódica em tubos ou placas 
de Petri com meio de cultura sólido (viabilidade: semanas) 
 
 
 
 
-Congelamento em freezers -20 ˚C ou -70 ˚C (anos) 
-Ultracongelamento: -196˚C, N líquido (anos) 
-Liofilização: desidratação por sublimação da água, 
 sob vácuo (anos ou décadas) 
26/03/2013 
27 
Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no 
bioprocesso, elas devem ser conservadas 
Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007 
... 100 
... 100 
26/03/2013 
28 
Criotubos 
Lento 
Rápido 
Desequilíbrio 
osmótico 
Fromação de 
cristais 
intracelulares 
 lise 
Congelamento 
Bactérias 
Células de mamíferos 
26/03/2013 
29 
Manual de Criopreservação Nunc 
Congelamento rápido minimiza os efeitos de 
concentração do soluto pois o gelo forma 
uniformemente 
 
Congelamento lento, por outro lado, resulta 
em grandes perdas de água da célula e 
menos gelo intraceclular, mas aumenta os 
efeitos da solução 
Congelamento 
26/03/2013 
30 
Agente de criopreservação 
 agente químico que protege as células durante o 
congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do 
aumento da concentração do soluto e formação de cristal 
Congelamento 
Mais comuns: 
Dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol (menos tóxico que DMSO). 
 
Escolha – depende da célula!! 
 
Agentes de criopreservação podem penetrar na célula e causar um 
congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de solução. 
DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor 
desitradação da célula antes do congelamento intracelular. 
 
DMSO penetra melhor nas células e geralmente mais usado para 
células maiores, mais complexas como os protistas. 
4 - Produção de etanol 
26/03/2013 
31 
Upstream 
Biorreação 
/Biorreator 
Downstream 
Exemplo prático: Produção de etanol 
Upstream 
Downstream 
Obtenção da matéria prima; 
 
Tratamento/preparo 
 
Escolha do microrganismo 
 
Preparo do pré-inóculo e 
inóculo 
Resíduos dos grãos 
26/03/2013 
32 
Biotecnologia do bioprocesso 
Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004 
Biorreação 
Biorreatores 
Pré-inóculo 
Inóculo 
26/03/2013 
33 
26/03/2013 
34 
Biotecnologia do bioprocesso 
 
Próximas aulas!! 
- Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de 
engenharia genética 
 
- Biorreatores 
 
- Biorreação 
 
-Processo Downstream 
 
 
Referências 
Manual de criopreservação Nunc – ver site da disciplina 
 
 
Capítulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology) 
– ver site da disciplina 
 
Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGraw-
Hill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And 
Biotechnology) – ver site da disciplina 
 
 
 
 
 
 
 
Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia 
Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher 
LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 2.

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