Métodos de Estudo da Célula

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Métodos de Estudo da Célula
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA
BIOLOGIA CELULAR
Profa. Rosa Valéria S. Amorim
Preparados Temporários (Estudos de Células 
Vivas)
Corantes supravitais;
Ex. Cultura de células e de tecidos (in vitro); Cultivo de 
protozoários; Células vegetais( películas de folhas); 
Células em atividade e/ ou em circulação, no organismo de 
pequenos animais.
Preparados Permanentes (Células Mortas)
Fixação e Coloração;
Preparados permanentes... Vantagem! 
Células preservadas melhor demonstração 
(fixadas e coradas) de seus componentes. 
Como as Células podem ser Estudadas?
Quatro tipos de Microscopia óptica - Imagem de uma célula cultivada de fibroblasto. A)
Microscopia de campo-claro. B) Microscopia de contraste de fase; c) Microscopia de contraste de
Interferência diferencial; d) Microscopia de campo escuro.
Microscopia Óptico
TIPOS DE MICROSCOPIA
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TIPOS DE MICROSCOPIA
Microscopia Eletrônica 
Microscopia Eletrônica de 
Transmissão 
Microscopia Eletrônica de 
Varredura 
As unidades de medida atualmente usadas em 
biologia celular e em histologia são as seguintes: 
Unidade de 
medida
Símbolo Valor
Micrômetro m 0,001 mm (milésima parte do 
milímetro)
Nanômetro nm 0,001mm (milésima parte do 
micrômetro)
Técnicas de Coleta
Existem métodos específicos para 
coleta de material distintos.
 Decalque ou imprint – Para visualizar os núcleos 
de órgãos de consistência mole (fígado, baço, rins);
 Esfregaço: Células livres presentes nos fluidos 
corpóreos (sangue, linfa, sêmem, líquor, hemolinfa); 
 Espalhamento: Consiste em promover uma 
raspagem das camadas superficiais das mucosas 
Ex.: mucosas vaginais ou bucais;
 Montagem total (à fresco ou não): Ex.: Órgão 
inteiro de insetos;
 Corte histológico: cortes extremamente finos 
(micrômetros) ;
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Preparação de Lâminas Permanentes para a 
observação em Microscopia de Luz
Etapa do Processamento Microscopia de Luz
Fixação Em uma etapa (formalina ou 
outro agente fixador)
Desidratação Álcool etílico
Clarificação Xilol
Inclusão Parafina
Corte Micrótomo
Coleta do corte Lâmina de vidro
Coloração Corantes (Ácidos ou Básicos)
Processamento de Material Biológico
Fixação do material
“A fixação imobiliza os componentes químicos celulares”
· Proteínas;
· Ácidos Nucléicos;
· Polissacarídeos;
· Lipídeos
Finalidades:
1. Evitar autólise;
2. Impedir a atividade e proliferação de bactérias;
3. Preparar células para etapas seguintes das técnicas
histológicas;
4. Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos 
corantes usados na microscopia óptica
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Existe pouco conteúdo dentro das
células que impedem a passagem da
luz, assim células fixadas e
seccionadas vistas ao Microscópio
Óptico são transparentes, com exceção:
células vegetais – cloroplastos
Célula animal – hemácias
Uma maneira de tornar as células
visíveis é a utilização de corantes!!!
“Diferentes componentes celulares podem 
ser seletivamente corados” 
“A coloração acentua a absorção de luz pelo material”
Corantes - moléculas orgânicas que apresentam em sua estrutura
duplas ou triplas ligações, as quais interagem com a luz dotando
os corpos de capacidades absortivas: Grupo Cromofórico.
 Corantes Ácidos = aniônicos (Eosina, 
Orange G, Fucsina):
– Grupo iônico carregado 
negativamente;
– Liga-se a moléculas básicas (+);
 Ex: Proteínas ricas em aa básicos (NH2)
Eosina
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 Corantes Básicos = catiônicos (Azul de toluidina, 
Azul de metileno, Hematoxilina):
– Grupo iônico carregado positivamente;
– Liga-se a moléculas ácidas
 Ex: radicais fosfato -H2PO4 (DNA e RNA), 
carboxilas -COOH, Hidroxila –OH, sulfatos –HSO4. 
Azul de metileno
Reações de Acidofilia e Basofilia
 Afinidade por corantes ácidos (proteínas básicas 
citoplasmáticas)  ACIDÓFILAS
 Afinidade por corantes básicos (DNA, RNA, 
glicoproteínas ácidas, Pectatos e polissacarídeos 
ácidos)  BASÓFILAS
Células de Allium cepa coradas com Azul 
de Metileno.
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OS MÉTODOS DE COLORAÇÃO PODEM SER GERAIS 
OU CITOQUÍMICOS
COLORAÇÃO GERAL
Os métodos gerais são aqueles cujo pH final da solução
permite a coloração de uma ampla gama de substratos, não
havendo possibilidade de se quantificar os compostos corados.
Ex.: Hematoxilina e Eosina
COLORAÇÃO CITOQUÍMICA
Os métodos citoquímicos apresentam alta especificidade
para seus substratos, havendo técnicas que permitem a
quantificação destes após a coloração. Ex. Corantes
citoquímicos:
Ex. Azul de Tuluidina e Xylidine Ponceau
Citoquímica / Histoquímica
“COMPREENDE TÉCNICAS DIVERSAS PARA A 
IDENTIFICAÇÃO E LOCALIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS QUE 
CONSTITUEM AS CÉLULAS”
· Proteínas;
· Ácidos Nucléicos;
· Polissacarídeos;
· Lipídeos;
· Íons (Ex. Ca+2);
· Enzimas;
Métodos Especiais de Estudo
Deve ser:
Específicas - Reações químicas só deve ocorrer 
com o componente pesquisado;
Sensível - Capaz de detectar quantidades muito 
pequenas do componente;
Citoquímica / Histoquímica
Para se localizar uma determinada substância, a 
reação citoquímica deve resultar:
Produto da Reação Tipo de 
Microscopia
Insolúvel e corado 
Cromóforo
Emite Fluorescência
Fluoróforo
Dispersar elétrons 
Eletro-denso
M. O.
Microscopia de 
Fluorescência
M.E.T.
As reações citoquímicas podem
ser mediadas por:
•Interações Eletrostáticas;
•Ligações Covalentes;
•Interações Hidrofóbicas;
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REAÇÃO DE P.A.S. ( Periodic Acid Schiff): muito útil na
detecção de polissacarídeos neutros (glicogênio, amido e
celulose) e de radicais glicídicos de glicoproteínas;
A reação de P.A.S. (ácido periódico/reativo de Shiff),
também consiste de duas etapas:
1 Oxidação com ácido periódico, de grupamentos OH
vizinhos formando grupamentos aldeídos;
2 Coloração com reativo de Shiff, restaurando o grupo
cromofórico e gerando um composto corado (Magenta).
Reações Citoquímicas (Ligações Covalentes)
OBS.: a fixação do material não 
pode ser feita com formaldeído, 
paraformaldeído e Glutaraldeído. 
Corte transversal das glândulas do intestino 
grosso, mostrando as suas células 
caliciformes e absorventes. Método do PAS 
(Periodic-Acid-Schiff). Aumento médio.
células de Fígado. Método do PAS (Periodic-
Acid-Schiff). Aumento médio.
APLICAÇÃO: Fígado (acúmulo de glicogênio); Estômago 
(camada de revestimento – glicosaminoglicanos); 
Depósito de polissacarídeos nos tecidos = Amiloidoses e 
outras patologias.
CITOQUÍMICA ENZIMÁTICA
“DETECTA ENZIMAS ASSOCIADAS COM ESTRUTURAS SUBCELULARES”
FUNDAMENTO: O método emprega um substrato que é
especificamente clivado por uma enzima na célula para liberar um
produto, o qual é transformado em um precipitado visível.
Ex.: A atividade da fosfatase ácida (lisossomos) foi determinado pela
incubação das células com -glicerofosfato de sódio e revelada em presença do
chumbo fosfato de chumbo, precipitado elétron-denso .
Requisitos: 1.Preservação da integridade molecular
(Fixadores brandos ou congelamento)
2. Ambiente de incupação adequado (pH
e temperatura)
Figura -Micrografia Eletrônica mostrando
a localização da enzima fosfatase ácida
em lisossomos.
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IMUNOCITOQUÍMICA ou IMUNOHISTOQUÍMICA
“AS TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS PERMITEM O ESTUDO DA 
LOCALIZAÇÃO INTRACELULAR DE PROTEÍNAS ESPECÍFICAS”
É BASEADA NA REAÇÃO: ANTÍGENO - ANTICORPO
ANTÍGENO: Qualquer substância estranha que pode induzir
uma resposta imune em um hospedeiro e reage
especificamente com anticorpos.
ANTICORPO: Proteínas que se ligam fortemente aos seus
alvos, sendo sintetizadas pelas células brancas do sangue.
O complexo antígeno-anticorpo pode ser
revelado por meio de marcadores
especiais ou sondas (corantes
fluorescente, enzimas, esferas de ouro
coloidal) e podem se visualizados sob
diferentes microscopias.
PODE SER DE DOIS TIPOS:
IMUNOCITOQUÍMICA DIRETA - O anticorpo é marcado por um 
marcador (sonda), ex.: enzima, proteína.
IMUNOCITOQUÍMICA INDIRETA- O anticorpo é marcado por 
um segundo anticorpo (anticorpo secundário), ao qual será inserido um 
marcador (sonda).
IMUNOCITOQUÍMICA ou IMUNOHISTOQUÍMICA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
“QUANDO O COMPOSTO UTILIZADO NA MARCAÇÃO DO ANTICORPO É UM 
FLUOROCROMO”
 Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) – Emite fluorescência VERDE.
 Isotiocianato de Tetrametilrodamina (TRITC) - Emite fluorescência
VERMELHA.
EQUIPAMENTO UTILIZADO: MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA.
Marcação por fluorescência. Em vermelho: actina; em 
verde: microtúbulos; em azul: núcleo
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Aplicações:
• Identificar subpopulações de linfócitos;
• Identificar espécies bacterianas;
• localização de hormônios;
• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes
•Detecção anticorpos anti-DNA
• Teste qualitativo;
Fc