Métodos de Estudos em Biologia Celular II

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MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA 
CELULAR 
 
II - CITOQUÍMICA 
Célula 
Tecido 
Órgão 
Análises 
in situ 
Sistemas de estudos 
in vitro 
Cultura 
Fertilização 
Manipulações 
Extrações/Purificações 
Centrifugações 
Diálises 
Eletroforeses 
Tecnologia do DNA/RNA 
Estudos 
bioquímicos 
Preparações citológicas 
Citoquímica 
Autorradiografia 
Imunocitoquímica 
Para o estudo do material biológico ao Microscópio são 
necessários alguns procedimentos prévios que vão desde a 
escolha e coleta do material até a montagem final do preparado 
histológico 
Princípios da 
Citoquímica 
Métodos de Estudos in situ 
Preparações Citológicas e Técnicas Citoquímicas 
 Que os elementos a ser 
analisados 
 não sejam difusíveis; 
 Que o produto da reação 
seja visível (cor ou 
precipitado); 
 Que a reação seja 
específica/seletiva para o 
que se pretende analisar 
O sucesso de uma reação citoquímica depende principalmente 
dos passos anteriores ao da reação de coloração: 
Coleta do material 
Fixação e agentes fixadores 
Agentes desidratantes 
Métodos de Estudos in situ 
Preparações Citológicas e Técnicas Citoquímicas 
Mesentério 
Glândulas de insetos 
Membranas fetais 
Preparado permanente 
Células preservadas para melhor demonstração de sua estrutura 
Ideal = sejam mantidos estrutura e composição química quando in vivo 
Coleta do Material 
1) Montagem total: 
•Material fino / transparente – na lâmina 
• Fixação e coloração 
• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas) 
 
Glândulas Salivares de Rhodnius prolixus 
Montagem total 
Glândula 
Principal 
Ducto 
Principal 
Glândula 
Acessória 
Ducto 
Acessório 
2) Esfregaço: consistem em promover o espalhamento de células livres 
sobre a lâmina com o auxílio de outra lâmina 
• Células livres: sangue, linfa, sêmen, líquor 
• Fixação e coloração 
• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas) 
 
Coleta do Material 
3) Espalhamento: 
• Erroneamente esfregaço 
• Raspagem (espátula / palitos) de camadas superficiais (mucosas) 
 Mucosas: bucal, anal, vaginal 
• Fixação e coloração 
• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas) 
 
Coleta do Material 
Cromossomos 
Núcleo/Nucléolo 
4) Esmagamento: 
• Esmagar, entre lâmina e lamínula, o material a ser analisado 
• Coloração concomitante ou posterior 
• Vantagem: estudo de divisões celulares 
Coleta do Material 
5) Decalque ou Imprint: 
• Coleta de núcleos de tecidos moles – fígado, baço, rim. timo 
• Retira-se órgão – face cortada lavada com salina – seca com papel – 
pressiona contra a lâmina (carimbo) 
 Resultado: núcleos impressos 
• Fixação e coloração 
• Vantagem: - simples 
 - estudo da quantidade de DNA 
Coleta do Material 
 6) Corte histológico 
Clarificação 
Cortes Histológicos 
A fixação do material biológico é uma das etapas mais importantes do 
processamento histotécnico, pois dela depende a preservação da estrutura 
e dos componentes químicos a serem avaliados pelas técnicas 
subseqüentes 
Fixação e Agentes Fixadores 
Agentes 
 Fixadores 
Substâncias fixadoras: aldeídos, 
álcoois, ácido pícrico, ácido acético, 
teróxido de ósmio 
Misturas fixadoras: 
Carnoy, Bouin, Helly, Karnovisky 
A desidratação do material biológico é uma etapa essencial da técnica 
histológica, pois a inclusão do material em parafina ou resinas especiais é a 
etapa seguinte, e estes materiais são hidrofóbicos 
Agentes Desidratantes 
Agentes 
 Desidratantes 
Etanol 
Metanol 
Acetona 
 
(série crescente desde o 
50% até 100%) 
Micrótomo Leica RM2155 
Cortes blocos parafina e resina - lâminas 
Navalha 
parafina 
Navalha 
resina 
Navalha diamante 
Área da biologia celular e estrutural dedicada 
aos estudos dos métodos de coloração dos 
tecidos e constituintes celulares e subcelulares 
Citoquímica / Histoquímica 
Células x Tecidos 
Elementos químicos de Baixo P.M. (C, O, N, H, etc.) 
 ↓ Matéria Orgânica 
 Baixo Contraste 
 
Material a ser examinado ao M.L. 
 - Fino 
 - Transparente ( luz  formação da imagem) 
 ↓ Material Biológico 
 Coloração ou reações 
 Métodos de coloração 
 Princípios químicos das reações de coloração 
 Procedimentos protocolares 
Citoquímica 
Componentes químicos que podem ser avaliados pela 
técnica citoquímica 
Ácido Nucléicos 
Proteínas 
Polissacarídeos 
Lipídios 
Íons (Complexos moleculares) 
Vitaminas e Enzimas 
• Pesquisa científica 
• Diagnóstico patológico 
Coloração do Material Biológico 
Sucesso da reação citoquímica: 
 
Elementos avaliados → Não difusíveis no processamento 
 
Produto da reação 
 
Reação específica para o composto celular analisado 
 
 
Passos anteriores à reação: 
cor 
insolúvel 
Coleta 
Fixação 
Desidratação 
Corante Substrato 
Ligações eletrostáticas 
Ligações covalentes 
Interações hidrofóbicas 
Reações Citoquímicas 
Natureza das reações citoquímicas envolvidas 
Substrato 
catiônico 
Substrato 
aniônico 
Corante 
aniônico 
Corante 
catiônico 
Acidofilia 
Basofilia 
Afinidade eletrostática: um corante ionizado em uma 
solução reage com um substrato de carga iônica oposta. 
Reações Citoquímicas Mediadas por Ligações Eletrostáticas 
Basofilia Corantes Básicos (Catiônicos) 
Azul de metileno 
Azul de toluidina 
Azul de alcian 
Substrato carregado negativamente (aniônico) reage 
eletrostaticamente com um corante carregado positivamente 
(catiônico). 
Corantes: 
Basofilia 
Corantes ácidos (Aniônicos) 
Xilydine Ponceau 
Amarelo de 
Naftol 
Sírius Red 
Orceína 
Fast green 
Esses corantes reagem com os elementos que possuem cargas positivas 
na célula, como por exemplo, as proteínas, que podem apresentar 
radicais básicos de seus aminoácidos ionizados (NH3+). 
Reação de Acidofilia 
 Grupamentos se ionizam na dependência de pHs 
diferenciados 
 
 
 Obtidos a partir de solução tampão em que os corantes são 
diluídos 
Reação de Acidofilia 
Fast Green 
(pH ácido: 2,5) 
• Proteínas totais 
• Corpos residuais 
Ex.: Corante aniônico 
Fast Green 
(pH alcalino: 8,5) 
• Proteínas básicas 
(histonas / protaminas) 
• Ausência de marcação de corpos 
residuais 
Ex.: Corante aniônico 
Orceína lacto-acética 
Testículo de gafanhoto 
Orceína lacto-acética 
• Corante se liga à proteínas histônicas ou totais, complexadas ao 
DNA da cromatina; 
• Diferenciação entre eucromatina e heterocromatina (corante mais 
forte); 
• Heterocromatina: Mais compacta e menor número de proteínas. 
Ex.: Corante aniônico 
Orceína lacto-acética 
Espermatogênese em testículo 
de triatomíneos 
Hematoxilina (+) 
 
Substratos (-) 
 
Núcleos 
(grupam/os fostato do DNA) 
 
Azul 
Eosina (-) 
 
Substratos (+) 
 
Citoplasma 
(grupam/o NH2
+) 
 
Rosa 
Hematoxilina Eosina 
Coloração de rotina para análise geral da 
morfologia dos túbulos seminíferos 
(Mus muscullus) 
(ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002) 
Hematoxilina Eosina 
(Ribeiro & Lima, 2000) 
C 
R 
G 
(Peruquetti, 2004) 
HE 
• Estrutura dos túbulos 
seminíferos 
• Formação do grânulo pré-
acrossomal 
Impregnação por Íons Prata 
Impregnação pelo Nitrato de Prata 
A técnica de impregnação pela prata é utilizada para marcar: 
 
 Nucléolos de núcleos interfásicos 
 Regiões organizadoras nucleolares (RONs) nos cromossomos 
 
 
CF 
CFD 
CG 
Nucléolo (ME) 
Identificação de proteínas nucleolares (B23 e C23) 
 (nucléolos e corpúsculos nucleolares) 
(Mus muscullus) 
(ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002) 
Impregnação por íons prata 
(Howell & Black, 1980) 
Prata 
• Proteínas nucleolares – B23 e C23 
(Peruquetti, 2004) 
A) Pesquisas citogenéticas 
 Bandamento cromossômico 
 Indicar atividades de transcrição do DNAr 
 Estudo da atividade nucleolar durante a gametogênese 
B) Diagnósticos patológicos 
 Leucemias 
 Tumores: 
 ovário 
 mamaútero 
 tireóide 
Aplicações 
↑ Proteínas AgNOR 
↑ Taxa de proliferação 
↑ Grau de malignidade 
Tecido conjuntivo (azul esverdeado) 
Células: pigmentos de fucsina 
Núcleos: escuros 
Tricrômico de Gömöri 
Língua 
Fibras musculares (lilás) 
Fibras colágenas (azul) 
Núcleos (azul escuro) 
Tricrômico de Masson 
Outro exemplo clássico deste tipo de reação são as reações 
intermediadas pelo Reativo de Schiff: Reação de Feulgen 
(DNA); Teste do PAS (polissacarídeos neutros) 
Leucoderivado 
da Fucsina básica Restauração do grupo cromofórico 
(2 fórmulas prováveis) 
2(R-CHO) 
Aldeídos 
livres 
Reações Citoquímicas Mediadas por Ligações Covalentes 
Reação de Feulgen 
 Desenvolvida a partir de pesquisas sobre o uso de um 
reagente (reativo de Schiff) 
 
 Schiff, 1886: pesquisas industriais - detecção de aldeídos e 
cetonas  whisky 
 
 Específico para DNA  conteúdo de DNA por lote 
cromossômico  constante para as s spp animais e vegetais  
replicação  intérfase 
1924: Feulgen e Rosenbeck 
 Conteúdo de DNA médio é constante para as diferentes espécies; 
 Replicação do DNA ocorre na intérfase; 
 Verificou-se a influência da ação de drogas, hormônios e do 
 envelhecimento sobre o conteúdo do DNA; 
 Detectou-se a presença de aneuploidias e poliploidias em vários 
 em vários tipos de tumores. 
 DNA – Feulgen + 
 RNA – Feulgen - 
 
Controle da reação: Extração do DNA 
Feulgen - 
Importância da Reação de Feulgen 
Túbulos Seminíferos de Mus musculus 
 Somente as desoxirriboses se comportam 
como verdadeiros aldeídos 
 
 O RNA é extraído rapidamente durante a 
hidrólise ácida 
Por que o Reativo de Schiff não cora RNA? 
C G 
R Reação de Feulgen 
Túbulos seminíferos 
• Áreas nucleolares (-) 
(espermatócitos I → Espermátides) 
• Heterocromatina 
• Ausência de marcação dos 
corpos residuais 
(Peruquetti, 2004)