Métodos Gerais de Estudos

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Métodos Gerais de Estudos 
Objetivos 
• Definir técnica histológica. 
• Definir e Citar a importância das técnicas de coleta do material biológico: esfregaço, esmagamento, 
decalque, montagem total e espalhamento. 
• Definir método a fresco (ou imediato) e Citar suas limitações. 
• Definir método permanente (ou mediato). 
• Conceituar fixação (métodos e modos) e fixador. 
• Citar 04 (quatro) qualidades de um bom fixador. 
• Definir “misturas fixadoras” e exemplificá-las. 
• Baseado no quadro abaixo, Descrever cada uma das etapas do processamento de material biológico 
para análise ao MO e ME de Transmissão e de Varredura. 
• Definir corantes ácidos e básicos. Definir acidofilia, basofilia e metacromasia. 
• Descrever resumidamente a técnica de rotina para processamento de material biológico a ser Ana-
lisado ao MET e MEV. 
 
Quadro Sinóptico Comparativo – Processamento de material biológico, por técnicas de rotina, para aná-
lise ao MO e ME de transmissão e Varredura. 
 
 M. Óptica METransmissão MEVarredura 
Fixação Formol, Bouin Glutaraldeído Glutaraldeído 
Lavagem Água, Soro Soluções Tampão Soluções Tam-
pão 
Pós-fixação Tetróxido ósmio Tetróxido ósmio 
Lavagem Soluções Tampão Soluções Tam-
pão 
Desidratação Solução Álcool Álcool / Acetona Álcool / Acetona 
Diafanização Xilol, Toluol Óxido propileno Óxido propileno 
Impregnação Parafina Resina Epóxi 
Inclusão Parafina Resina Epóxi Ap. Ponto crítico 
Aparamento Toalete do bloco Toalete do bloco 
Microtomia (MO) 
 
 
Ultramicrotomia (MET) 
Comum, manual 
congelação (5µm) 
Escolha do campo de 
estudo (0,5 - 1,0µm) 
 
Cortes ultrafinos 
60 nm espessura 
 
 
 
Montagem cortes Lâminas de vidro Grades de cobre Suporte metálico 
Desparafinização Xilol, Toluol 
Hidratação Álcool → Água 
Coloração (MO) 
Contrastação (MET) 
Hematoxilina Eo-
sina 
Acetato Uranila 
Citrato Chumbo 
Cobertura com 
Ouro/Platina 
Desidratação Soluções Álcool 
Diafanização Xilol, Benzol 
Montagem final Bálsamo Canadá 
 
 
Processamento de Material Biológico MO 
O objetivo deste texto é oferecer ao estudante da Área III, o conhecimento da técnica de processa-
mento de espécimen biológico, para inclusão em parafina, coloração pela Hematoxilina e eosina e, monta-
gem final permanente, o que denominaremos de “preparação histológica”. 
Introdução 
Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente com o aperfeiçoamento dos métodos 
de investigação. A princípio o uso do microscópio composto possibilitou o descobrimento das células e a 
elaboração da teoria segundo a qual todos os seres vivos são constituídos por células (Teoria Celular). 
Posteriormente, foram descobertas técnicas citoquímicas que possibilitaram a identificação e localização 
de diversas moléculas constituintes das células. Com o advento do microscópio eletrônico, foram observa-
dos pormenores da estrutura celular que não eram sequer imaginados pelos estudos feitos com o micros-
cópio óptico. 
Embora seja possível o estudo microscópico de células vivas, existem muitas vantagens em obter 
uma preparação permanente, na qual as células ficam preservadas, isto é, fixadas e coradas, para melhor 
demonstração de seus componentes. 
Para processarmos material biológico para inclusão em parafina, previamente, elaboramos um pla-
no de trabalho, onde levamos em consideração: a escolha do animal (devemos nos preocupar com a pre-
servação da fauna), as peças anatômicas a serem coletadas, as etapas da técnica histológica a serem utili-
zadas, listagem do material cirúrgico e dos reagentes, entre outros, para que possamos alcançar o objetivo 
final, que é a preparação histológica. 
Denomina-se preparação histológica, ao “sanduíche” composto por duas superfícies de vidro, uma, 
medindo 76mm x 25mm x 1mm, denominada de lâmina e, outra, de formato, comprimento e largura vari-
áveis, mas de espessura NUNCA superior a 0,17 mm, conhecida por lamínula e, como “recheio”, o tecido 
ou esfregaço. As preparações histológicas, de acordo com sua perenidade, são classificadas em: 1. Perma-
nente (Mediato) - apresentam tempo de vida útil muito longo, e; 2. A Fresco (Imediato) – de vida útil mui-
to limitada. 
O processamento histológico pode ser dividido em várias fases: 
Coleta do material 
O material para a confecção de preparações histológicas é coletado, na maioria das vezes, de ani-
mal de laboratório, como por exemplo, rato, camundongo, coelho, etc. 
Ao manipularmos animais de laboratório, inicialmente devemos proceder à anestesia para, em se-
guida, coletarmos a peça anatômica desejada. A anestesia deve ser lenta e gradativa, manipulando-se os 
animais quando estiverem completamente anestesiados. A narcose é recomendável não apenas no sentido 
de evitar-se o sofrimento do animal, bem como, evitar contrações e distensões anormais das peças. 
A anestesia pode ser por gás, líquido ou sólido. Dependendo do organismo e do anestésico, pode 
ser administrado por via oral, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou endovenosa. 
O anestésico mais comumente usado é o éter etílico; pequenos mamíferos como ratos, camundon-
gos cobaias e mesmo coelhos, são colocados num recipiente contendo algodão saturado com éter, até 
adormecerem profundamente. Outro exemplo é o nembutal (pentobarbital sódico), administrado via en-
dovenosa ou intraperitoneal, variando-se a dosagem de acordo com o animal. Para o rato, administra-se 
uma dose de 50 mg/Kg de peso corporal, via subcutânea. A anestesia dura aproximadamente 1 hora. 
Na prática, usando-se câmara anestésica, produtos farmacêuticos de uso anestésico e meios de a-
plicação apropriados, promove-se a anestesia do animal. Enquanto durar o efeito do anestésico, através de 
técnicas cirúrgicas indicadas, faz-se a coleta das peças anatômicas, iniciando pelas mais sensíveis à autóli-
se. O animal anestesiado, deve ser mantido vivo durante a coleta e as peças anatômicas coletadas no me-
nor tempo possível, a fim de evitar a autólise. Por vezes, administramos o fixador via endovenosa, o que 
propicia uma fixação melhor e mais uniforme, das peças anatômicas. Nesses casos, terminada a coleta do 
espécimen, as mesmas são colocadas em frascos contendo o liquído fixativo em uso e, o animal é sacrifica-
do e descartado. 
Para outras técnicas de coleta de materiais, vide A Célula 2001 – Cap.3 – Métodos de Estudo da Cé-
lula. 
Fixação 
A fixação é o processo que consiste no uso de substâncias fixadoras, cujo objetivo principal é o de 
estabilizar e preservar os componentes celulares, das peças anatômicas, como se estivessem vivos. 
Na fixação, como em qualquer etapa do processamento histológico, é muito importante controlar os pa-
râmetros (ou variáveis), tais como: concentração, temperatura, pH, soluções diluentes (ex: tampões), os-
molaridade, agitação e tempo, seja da solução fixadora, bem como, das demais soluções utilizadas no de-
correr do processamento histológico. Particular atenção deve ser dada ao tamanho da peça anatômica a 
ser coletada, ou seja, quanto MENOR, melhor será a penetração dos líquidos (fixador, desidrataste e ou-
tros) em seu interior. 
Fixadores são agentes empregados para manterem inalteradas, o quanto possível, as estruturas ce-
lulares das peças anatômicas, após sua retirada do animal. 
As peças anatômicas, normalmente são coletadas e imersas no líquido fixador. Entretanto, recomenda-se 
que os fixadores sejam perfundidos no animal, via subcutânea ou intravenosa e, a peça, após ser removida, 
seja colocada no mesmo fixador, em um recipente. 
Um bom fixador deve apresentar: 
• Penetração rápida e vigorosa - atuar rapidamente com a mesma eficácia, fixando igualmente tanto 
as camadas superficiais quanto as mais profundas; 
• Evitar a autólise e impedir a proliferação bacteriana; 
• Coagular as proteínas, de forma moderada; 
• Conservar os detalhes estruturaistão próximos quanto possíveis daqueles que apresentavam “in 
vivo” promover o endurecimento relativo das peças anatômicas, dando às estruturas uma consis-
tência semissólida impedir o aparecimento de estruturas artificiais aumentar a afinidade das estru-
turas celulares pelos corantes. 
 
Classificação - os agentes fixadores podem ser classificados, de acordo com o quadro ao lado, em Físi-
cos e Químicos. 
 Normalmente, os agentes químicos são preferidos para o estudo das células e dos tecidos. Esses 
agentes são subdivididos em Simples, quando constituídos de um só componente e, de Misturas fixado-
ras, quando formados por mais de um componente. 
Dentre os agentes fixadores simples, o mais freqüentemente usado é o formaldeído, um gás preparado em 
solução saturada que recebe o nome de formol ou formalina, cuja diluição varia ao redor de 40% (p/v). 
Nesta diluição, denominada de formol comercial, é um líquido incolor, odor picante e sabor cáustico. Seus 
vapores irritam às mucosas nasais e nasofaríngeas. O formol é muito miscível com a água e o álcool e não 
com o éter e clorofórmio. Pela presença do aldeído, o formol comercial, espontaneamente, em contato 
com o ar sofre oxidação; isto aumenta o teor de ácido fórmico, que além de perturbar sua ação fixadora, 
forma precipitados nas peças e destroi as células mucosas com acentuada deteriorização citoplasmática, 
sendo preferível, por isso, usar-se formol neutro. O formol penetra bem, mas de forma lenta, o que exige 
aumento do tempo de fixação e peças de dimensões o mais reduzidas possível. 
 Na prática, utiliza-se rotineiramente, o formol neutro a 10%. O tempo de fixação previsto varia de 6 
a 24 horas. 
 
 
Classificação 
 
Agentes 
Fixadores 
Físicos 
 Calor 
 
 Frio 
 
Químicos 
Simples 
 
Ácidos Inorgâ-
nicos 
 Tetróxido de Ósmio 
 Tetróxido de Cromo 
 
Sais Metálicos 
Dicromatos de K+, Na+, 
Mg++,Zn++,Ba++,Ca++,Cu++ 
Dicloreto de Mercúrio 
 
 
Ácidos 
Orgânicos 
 
Ácido Acético 
Ácido Tricloroacético 
Ácido Pícrico 
 
Redutores 
Formol-aldeído fórmico 
Álcool Metílico 
Álcool Etílico 
Acetona - Propanona 
 
Misturas 
Fixadoras 
 Bouin 
 Zenker 
 FAA – Formol/Ácido Acético/Álcool 
 
 Com o objetivo de completar a ação de um fixador simples, aumentando suas boas qualidades e 
atenuando seus defeitos, tornou-se freqüente o emprego de misturas fixadoras. As misturas mais comu-
mente usadas são: BOUIN, ZENKER, ALFAC (ou FAA), etc. 
 A mistura de Bouin possui boa penetração, com um tempo médio de fixação variando de 04 a 24 
horas; é excelente para uso geral, fixando bem proteínas e o glicogênio, precipitando os ácidos nucleicos, 
tornando-os mais evidenciados. 
A solução de Zenker fixa bem o núcleo celular e se presta à muitas técnicas de coloração, inclusive aquelas 
seletivas. O tempo médio de fixação para peças pequenas, varia de 06 a 12 horas e, para as maiores, até 
24 horas. 
 A mistura Alfac (ou FAA), que ao contrário de muitas outras, não recebe o nome de seu criador, e 
sim, designada pelas inicias de seus componentes, penetra satisfatoriamente e com relativa rapidez, man-
tém a peça sob uma consistência adequada, não interfere na coloração a ser utilizada e serve como fixador 
para determinados estudos histoquímicos. Utiliza-se um tempo de fixação que varia de 06 a 12 horas. 
Desmineralização ou Descalcificação 
É a retirada dos sais minerais das peças histológicas normalmente mineralizadas, como os ossos e 
dentes, ou daquelas que, anormalmente, se tornaram sede de depósitos dos mesmos. Para a obtenção de 
cortes ao micrótomo, é necessário a retirada dos sais minerais e utiliza-se para tal, os agentes desminerali-
zadores (ou descalcificadores). 
 Os agentes usados para a desmineralização variam entre os ácidos inorgânicos e orgânicos (exem-
plo: solução de Perenyil) aos quelantes (E.D.T.A). Os primeiros (ácidos) atuam retirando os íons metálicos 
(cátions) e com eles tendem a formar sais solúveis; promovem alterações consideráveis na peça histológi-
ca. Já os quelantes, promovem a retirada dos íons metálicos das estruturas sem se combinarem com eles, 
formando sais; por conseqüência, praticamente não causam alterações no material e, assim, são os prefe-
ridos para a desmineralização. 
 Após a fixação (e/ou desmineralização), o excesso deste líquido deve ser removido, antes da desi-
dratação, e assim, minimizar uma possível reação entre o fixador e o agente desidratante. É aconselhável 
lavar a peça com o líquido diluente do fixador . 
Desidratação 
 A desidratação é necessária porque usualmente, a parafina (ou outros meios de emblocagem) não é 
miscível com a água. Assim, toda a água do fixador (se existente) e da lavagem, no espécimen, deve ser 
substituída por um solvente orgânico. A retirada da água, tanto do interior das células quanto das substân-
cias intercelulares é realizada através do uso de uma bateria crescente de álcool etílico, miscível com a 
água e com o agente diafanizante (a ser usado, a seguir); dessa forma, evita-se alterações estruturais irre-
versíveis na peça. A substituição da água por álcool torna as peças histológicas resistentes, indeformáveis e 
macias. Outros agentes desidratantes utilizados são os álcoois metílico, amílico e butílico, o clorofórmio, e 
a acetona. 
 Na prática, utiliza-se a seguinte bateria crescente de álcool etílico : 
 Álcool 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, Absoluto (100%, 100% e 100%) - 30 a 60 minutos cada, trocando a 
solução, pelo menos, 3 vezes cada. 
Diafanização 
 Consiste na substituição do álcool pelo agente diafanizante, o qual confere a peça histológica seu 
alto índice de refração, tornando-a translúcida, sendo assim, esta etapa, chamada diafanização. Como a-
gentes diafanizadores, utilizam-se o xilol, benzol, toluol, fenol e o clorofórmio. Embora o xilol endureça 
muito as peças histológicas, tornando-as friáveis, é universalmente mais usado. Existe a tendência de subs-
tituí-lo pelo benzol ou pelo toluol, que não apresentam este inconveniente. 
 O diafanizador tem obrigatoriamente, que ser miscível com o agente desidratante (álcool) e ser 
dissolvente da parafina, o que faz com que esta, penetre na intimidade dos tecidos, durante a fase seguin-
te do processamento histológico (impregnação). 
 Na prática, utilizamos o seguinte protocolo: 
 Xilol Puro - 3 banhos de 30 a 60 minutos cada. 
Impregnação pela Parafina 
É a fase na qual a peça histológica é imersa na parafina líquida, que penetra nos interstícios da 
mesma, ocupando completamente, todos os seus espaços. 
 À temperatura ambiente, a parafina apresenta-se em estado sólido, de cor branca, sendo solúvel 
nos agentes diafanizantes acima citados. A parafina é caracterizada pelos seus pontos de fusão; as deno-
minadas brandas, fundem-se entre 40 a 50°C e as chamadas duras, apresentam ponto de fusão em torno 
de 55 a 65°C. 
 Rotineiramente, utilizamos parafina com ponto de fusão intermediário, entre 52 e 55°C. Ela pode 
ser misturada com cera de abelha (5% cera / 95% parafina), carnaúba a 3% ou ainda, estearina, na propor-
ção de 25g / 1000g de parafina. O acréscimo destes produtos à parafina, melhora sua plasticidade e facilita 
a microtomia. 
 Na prática, a impregnação de peças histológicas é feita na estufa, onde a temperatura está sempre 
2 graus centígrados acima daquela do ponto de fusão da parafina. Freqüentemente usam-se dois ou três 
banhos sucessivos de parafina a fim de retirar de cada um deles, todos os vestígios do agente diafanizador 
que prejudicaria a qualidade do bloco, bem como, a perfeição dos cortes. 
Inclusão definitiva 
 A inclusão definitiva da peça na parafina que constituirá o bloco é feita num molde apropriado (bar-
ras de Leuckart - duas barras de chumbo em forma de L - , formas de papel, etc), no qual se despeja a para-
fina fundida e onde, com o auxílio de uma pinça é colocada apeça deixando-a em repouso até que a para-
fina se solidifique, depois de esfriar. Deve-se tomar o cuidado de colocar a superfície da peça que se quer 
cortar, voltada para o fundo do molde. A parafina usada para fazer o bloco não deverá ser nem muito mole 
(temperatura de fusão baixa) - o que não permitiria fazer cortes finos - nem muito dura (temperatura de 
fusão alta), já que o aquecimento para fundi-la poderia deteriorar as peças. 
3 
1 
2 
Toalete do Bloco 
 A peça histológica, agora incluída na parafina, forma com esta o que denominamos de bloco. A 
toalete do bloco consiste em reduzir as dimensões do mesmo, removendo-se o excesso de parafina que 
venha dificultar, posteriormente, a microtomia. Em seguida, com o uso de uma espátula aquecida, fundi-
mos a parafina da face do bloco contrária àquela que contenha a peça histológica incluída e o prendemos a 
um suporte de madeira, plástico ou metal. Através deste suporte, o bloco será preso ao porta-objeto do 
micrótomo. 
Microtomia (confecção de cortes) 
 A microtomia tem por finalidade cortar a peça histológica em fatias finíssimas, com espessura vari-
ando de 1 a 7 µm, utilizando-se para isto um aparelho mecânico denominado micrótomo. 
Para a obtenção dos cortes, devemos proceder da seguinte maneira: 
• Uma navalha de aço é presa ao seu suporte no micrótomo; 
• Prender e orientar o suporte do bloco (madeira, plástico ou metal) no porta - objeto, do aparelho; 
inicia-se o movimento do bloco no sentido norte - sul até que passe pela navalha, fazendo uma sec-
ção ou corte; 
• Após várias secções realizadas e tendo o tecido cortado em toda a sua extensão, regula-se a micra-
gem (espessura do corte) desejada; 
• A cada giro completo (360 o) da manivela (seta negra) do micrótomo, o bloco passa pela navalha e 
novos cortes são confeccionados. 
Os cortes ficam ligados uns aos outros, surgindo uma fita de parafina com os cortes. 
A fita é transferida para um banho-maria (ou cristalizador) contendo água a 40 - 50°C, para estiramento da 
parafina e, por consequência, dos cortes histológicos, a fim de não restarem dobras nos mesmos. 
Coleta dos Cortes (Pescaria) 
A pescaria dos cortes é realizada, utilizando-se lâmina de vidro limpa, já contendo uma película (al-
bumina / glicerina, v/v) na sua face que receberá os mesmos. Os cortes, isoladamente, ou vários, em fita, 
podem ser montados com o auxílio de um pincel sobre as lâminas nas quais ficarão colados. Escorre-se o 
excesso de água e coloca-se a lâmina, numa estufa (ou placa aquecedora) a 37°C para total evaporação e 
colagem final do corte. 
Uma vez confeccionados os cortes histológicos e montados nas lâminas de vidro, o passo subse-
qüente será corá-los. Entretanto, os cortes estão imersos em parafina e a mesma deve necessariamente, 
ser removida. 
Desparafinização e Hidratação dos Cortes 
 A retirada da parafina é feita mergulhando-se a lâmina com o corte histológico em três banhos su-
cessivos de xilol: 1o. banho - 5 minutos; 2o banho - 3 minutos, e; 3o banho - apenas 2 minutos. 
 O xilol, agora ocupando os espaços teciduais, em substituição à parafina, não é miscível com a água 
(normalmente, o diluente dos corantes). Assim, a substituíção do xilol é realizada, lavando-se os cortes 
com álcool absoluto. 
A hidratação consiste na substituição paulatina, do álcool pela água. Para tal, utilizamos uma bate-
ria decrescente de álcool etílico até a água corrente. 
 
Prática: 
 
1o. Banho de álcool absoluto - 2 minutos; 
2o. Banho de álcool absoluto - 2 minutos 
 Álcoois 95%, 90%, 80%, 70% e 50% - 2 banhos cada, de 2 minutos 
 Água corrente – 5 minutos. 
1 
2 
3 
Coloração pela Hematoxilina e Eosina 
A maioria dos elementos que constituem os tecidos é naturalmente incolor ou transparente. Para 
que eles se tornem visíveis no microscópio óptico comum e contrastem em relação uns aos outros, os cor-
tes devem ser corados. 
Coloração é o processo que consiste em submeter o corte histológico, já hidratado, à ação de um 
ou vários corantes. 
 Os corantes, substâncias ou agentes utilizados para corar, são constituídos por sais cujos cátions, 
ânions ou ambos, são coloridos. Quando somente o cátion do sal é colorido, diz-se que o corante é básico 
(ex: azul de metileno, hematoxilina). Quando apenas o ânion do sal é colorido, diz-se que o corante é ácido 
(ex: eosina). Quando ambos os íons são coloridos, considera-se que o corante seja neutro (ex: eosinato de 
azul de metileno) 
A maioria dos corantes usado em histologia (ácidos e básicos) tende a formar ligações salinas com 
radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Os componentes dos tecidos que se coram com corantes básicos 
são chamados basófilos, sendo denominados de ácidófilos os que se ligam a corantes ácidos. 
A coloração dupla pela Hematoxilina - Eosina é a mais utilizada na rotina em Histologia. Existem várias fór-
mulas de preparo da hematoxilina, sendo as principais : Hematoxilina de Harris, Hematoxilina de Delafield, 
Hematoxilina de Mayer e Hematoxilina de Carazzi. A eosina pode ser preparada em solução alcoólica a 1% 
e solução aquosa a 2,5%. Além destes corantes, muitos outros também são utilizados. 
Na prática, o tempo médio de coloração dos cortes, pela Hematoxilina é de 45 segundos, podendo 
atingir até 2 minutos (dependendo do tempo de uso do corante); em seguida, lava-se os cortes em água 
corrente (torneira) e deixa-os por mais dez minutos, para que ocorra a viragem para o azul. A viragem é 
obtida pela ação dos sais alcalinos terrosos existentes na água de torneira. Caso a água seja ácida, utiliza-se 
um pouco de carbonato de lítio para alcaliniza-la; passa-se os cortes rapidamente em água destilada, duas 
a três vezes. Submergem-se os cortes em solução aquosa de eosina a 1%, por 1 ou 2 minutos, obtendo-se 
uma sobrecoloração. Lava-se em água destilada rapidamente e diferencia-se em alcool a 70%, até se obter 
a intensidade de coloração desejada. 
(Resultados: núcleos celulares corados em tonalidades de azul, roxo ou violeta, pela hematoxilina - 
e o citoplasma, variando do róseo ao alaranjado, pela eosina). 
Uma vez corados, os cortes deverão ser cobertos por uma lamínula, que irá protegê-los e preservá-
los por longo tempo; este processo é denominado de montagem. Usualmente, o meio de montagem per-
manente mais utilizado, o bálsamo do Canadá, não é miscível com a água, presente nos cortes; dessa for-
ma, torna-se imprescindível sua retirada. 
Desidratação, Diafanização e Montagem Final 
 A retirada da água das estruturas inter e intracelulares, é realizada através do uso de uma bateria 
crescente de álcool (vide desidratação - ítem 3). Entretanto, o álcool também não é miscível com o meio de 
montagem permanente e, assim, o agente desidratante deve ser substituído por uma substância, que obri-
gatoriamente, deve ser miscível no álcool e no bálsamo do Canadá; utiliza-se como diafanizador, o xilol 
(vide diafanização - ítem 4). Nestas circunstâncias, procede-se à montagem final dos cortes. 
A montagem final consiste em fechar o material (corte, esfregaço, etc) em um tipo de câmara cons-
tituída pela própria lâmina de vidro, que suporta o espécimen (azul) e uma lamínula de vidro. 
 A lamínula é colada sobre o material com o auxílio de uma resina natural (ou sintética) solidificável, 
meio altamente refringente, que serve ao mesmo tempo para aumentar a transparência dos cortes e con-
servá-los. O meio anidro de montagem mais usado é o bálsamo do Canadá, resina obtida da casca das ár-
vores Abies balsamea e Abies canadensis ; dissolvido no xilol, seu índice de refração é de 1,532 e, ao secar 
(n = 1,535) é próximo ao do vidro de que é feita a lamínula ( n = 1,518), com o que se evita a perda de raios 
luminosos por refração. 
 O bálsamo do canadá é um líquido espesso, transparente e amarelado. É parcialmente solúvel em 
álcool e completamentesolúvel no xilol. A principal desvantagem do bálsamo do Canadá é que escurece e 
torna-se ácido com o tempo, por oxidação do xilol. Isso resulta em descoloração de corantes básicos (ex: 
hematoxilina). O bálsamo do Canadá não deve ser aquecido para fundir. Para evitar acidez, adiciona-se um 
pedaço de mármore no frasco contendo a resina. 
 Outros meios de montagem são utilizados, como por exemplo, o Permount, transparente, neutro, 
seca rapidamente e possui índice de refração de 1,53. 
Processamento de Material Biológico MET 
O objetivo deste texto é o de apresentar aos estudantes de graduação da Área III, os princípios bá-
sicos do processamento de espécimen biológico, para inclusão em resina Epoxi, ultramicrotomia, contras-
tação com metais pesados e exame ao microscópio eletrônico de transmissão (MET). 
Introdução 
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) tem trazido substanciais contribuições para a solu-
ção de problemas em biologia e na medicina, nas quais, o Microscópio Eletrônico de Transmissão possibili-
ta e auxilia-nos no exame direto das estruturas biológicas a nível ultra-estrutural. Tais informações são de 
importância vital para a compreensão da correlação entre estrutura e função a nível celular. 
 O estudo ultra-estrutural de células e tecidos, utilizando-se o M.E.T., usualmente requer fixação 
química. Os objetivos principais da fixação química são a estabilização e a preservação dos componentes 
celulares. 
Anestesia do animal e Coleta do espécimen 
 Normalmente, os animais são previamente anestesiados, ou alternativamente, sacrificados por des-
locamento cervical ou mesmo decapitação, e em seguida, os tecidos são coletados e imersos no fixador. 
 Pequenos animais (ex: rato) podem ser anestesiados com anestésicos voláteis como o éter ou halo-
tane; entretanto, o uso do barbital é o mais indicado. Para grandes animais, a injeção intravenosa ou intra-
peritoneal com nembutal, hidrato cloral ou inactina é usada. Injeção intravenosa é preferida para adminis-
tração de drogas em solução; drogas irritantes aos tecidos podem ser administradas dessa maneira, com 
muita segurança. Por outro lado, a injeção intraperitoneal é relativamente fácil e recomendada para a ad-
ministração de drogas não irritantes. O efeito da anestesia é mais lento e suave com injeção intraperitone-
al do que com a intravenosa. 
 Se o animal necessita ser sacrificado, é importante ressaltar que o método de sacrifício pode alterar 
a ultra-estrutura de certos tecidos. Os espécimens são coletados imediatamente após o sacrifício do ani-
mal, evitando-se assim, alterações pós-morte, devido à parada da circulação sangüínea. 
4. A fixação deve também, minimizar as alterações na reatividade química das substâncias celulares tais 
como as enzimas e preservar e protegê-las. 
 Idealmente, o que se espera de um método de fixação é a preservação satisfatória da célula como 
um todo e não meramente a melhor preservação de apenas uma parte dela. Na prática, a fixação é usual-
mente mais seletiva do que geral, uma vez que, o objetivo do estudo é que determina o tipo e a maneira 
de fixação. 
Na fixação, como em qualquer etapa do processamento histológico, é muito importante controlar 
os parâmetros (ou variáveis), que afetam a sua qualidade, tais como: concentração, temperatura, pH, solu-
ções diluentes (ex: tampões), osmolaridade, agitação e tempo, seja da solução fixadora bem como das 
demais soluções utilizadas no decorrer do processamento histológico. Particular atenção deve ser dada ao 
tamanho da peça anatômica a ser coletada, ou seja, quanto MENOR, melhor será a penetração dos líquidos 
(fixador, desidratante e outros ) em seu interior. 
 Os mais efetivos fixadores usados rotineiramente na MET são os aldeídos e o tetróxido de ósmio 
(OsO4). 
Dentre os aldeídos, o Glutaraldeído (ou aldeído glutárico), um dialdeído, promove ligações cruzadas 
irreversíveis, intra e intermolecular, dentro das proteínas, principalmente através dos grupos ∈-amino da 
lisina. Os grupos aminos nos fosfolipídios também reagem com o glutaraldeído, resultando na ligação entre 
estes lipídios e as proteínas da membrana. Outros tipos de lipídios, bem como, glicoproteínas não são fixa-
das com o glutaraldeído. Outro aldeído menos comumente utilizado é o formaldeído, obtido da dissocia-
ção do paraformaldeído em pó. Sendo um monômero, ele penetra nos tecidos mais rapidamente do que o 
glutaraldeído, fixa mais facilmente grandes blocos de tecidos, sendo por isso, utilizado para preservar a-
queles provenientes de cirurgia e biópsias, para ambas as microscopias, eletrônica de transmissão e óptica. 
 
 
 
 O formaldeído é um pobre fixador para lipídios; degrada alguns deles e, aqueles fixados, durante a 
desidratação são extraídos. Dessa forma, não sendo utilizado como fixador primário, são indicados, em 
certos casos, combinados com o glutaraldeído, na concentração de 1,5 a 4%. Ressalta-se que a mistura 
formaldeído-glutaraldeído penetra até 500 µm em tecidos ou órgãos, como o fígado de ratos ou camun-
dongos. 
 Os aldeídos, sendo de natureza orgânica, não oferecem eletro-densidade ao espécimen. Essa defi-
ciência é superada pelo uso do tetróxido de ósmio, como agente pós-fixador. 
Procedimentos Práticos 
Fatias pequenas e finíssimas de tecidos são coletadas do animal, utilizando-se uma pinça e uma gi-
lete e, em seguida, imersas em frascos contendo solução fixadora de aldeído glutárico a 2,5% (podendo 
variar de 2 a 4%). Após 10 a 20 minutos de prévia fixação, sobre uma placa de cera ou um pedaço de bor-
racha com uma ou duas gotas do mesmo fixador, usando-se uma gilete nova, estas fatias são reduzidas a 
pequenas peças ou fragmentos com cerca de 0,5 mm3. Os fragmentos são colocados em frascos pequenos 
e arrolhados, contendo a referida solução fixadora, por 1 a 3 horas (às vezes, devendo permanecer por até 
24 horas), à temperatura ambiente ou a 4o C, de preferência, sob constante agitação mecânica. Findo o 
tempo de fixação, os fragmentos deverão ser lavados e pós-fixados em tetróxido de ósmio. 
Soluções Tampão 
O veículo de um fixador normalmente consiste de uma solução tampão a qual pode ser adicionado 
sais ou outras substâncias para aumentar a sua osmolaridade. O termo osmolaridade é usado aqui estrita-
mente com relação à resposta da célula quando imersa na solução, ou seja, uma solução fixadora é isotô-
nica com a célula (ou tecido) se a mesma não incha e nem se contrai, quando imersa nela (solução). Dentre 
as principais e mais utilizadas soluções tampões, citamos o Fosfato de sódio e o Cacodilato de sódio. 
Lavagem 
Após fixação primária com aldeído glutárico, o espécimen deve ser lavado e, posteriormente, pós-
fixado com tetróxido de ósmio a fim de que NÃO ocorra qualquer reação entre estes agentes fixadores. 
Uma vez pós-fixado, o espécimen deve ser lavado novamente, para que NÃO haja reação entre estes agen-
tes, o pós-fixador e o desidratante. Para as lavagens, utiliza-se a solução tampão utilizada como diluente 
dos fixadores, o que minimiza diferenças na osmolaridade efetiva. 
Procedimentos Práticos 
Utilizando-se uma pipeta de Pasteur, retira-se todo o liquido fixador do frasco. Com outra pipeta, 
coloca-se a solução tampão; agita-se o frasco para que os espécimens sejam bem lavados; novamente, 
retira-se o líquido e substitui-se por um novo e, a partir de então, marca-se o tempo desejado. Repetir esse 
procedimento pelo menos três vezes, como programado no protocolo experimental. Em seguida, procede-
se à pós-fixação com tetróxido de ósmio. 
Pós-fixação 
O tetróxido de ósmio é um fixador que reage com lipídios insaturados e com certas proteínas, bem 
como, fornece eletro-densidade ao tecido. Assim, o tetróxido de ósmio atua como fixador e como corante 
eletro-denso. Este agente é um fixador aditivo, pois se torna parte da substância celular que ele fixa. As 
ligações insaturadasnas moléculas lipídicas são os sítios de reação primários. O tetróxido de ósmio não 
reage com as pentoses ou hexoses dos açucares ou seus polímeros e, a maioria dos carboidratos dos teci-
dos fixados com o OsO4 são extraídos durante a lavagem e a desidratação. Uma rápida e uniforme fixação 
com o tetróxido de ósmio podem ocorrer até uma profundidade de 0,25 mm, para a maioria dos tecidos. 
A solução tamponada de tetróxido de ósmio é rotineiramente usada na concentração de 1% ou 2% (às ve-
zes, 4%), a temperatura ambiente. 
Procedimentos Práticos 
A melhor preservação da ultra-estrutura celular tem sido obtida pela fixação primária com glutaral-
deído (ou mistura glutaraldeído mais paraformaldeido), como descrito acima e, em seguida, pelo tetróxido 
de ósmio. Esta fixação sequencial é denominada de dupla fixação. A pós-fixação do espécimen é realizada 
necessariamente, dentro de uma capela, uma vez que este reagente é muito volátil e cancerígeno. O líqui-
do de lavagem é substituído pela substância pós-fixadora, na concentração de 2%, usando pipeta de Pas-
teur. A pós-fixação é realizada à temperatura ambiente, por aproximadamente 2 horas, sob constante agi-
tação mecânica e dentro da capela. Findo o tempo, 
Durante a coleta, o tecido está sujeito a danos físicos; para minimizar estes danos, devemos banhar 
(ou colocar algodão sobre) o órgão de interesse, com a solução fixadora, por 5 ou 10 minutos, antes de sua 
coleta. A perfusão vascular é ideal para minimizar danos físicos e obter-se uma fixação uniforme mesmo 
nas regiões mais profundas dos órgãos. 
Fixação 
A fixação química é o método mais extensivamente usado para a preservação de espécimens bioló-
gicos, tanto para a microscopia eletrônica de transmissão quanto para a de varredura. 
 Os principais objetivos da fixação são: 
• preservar a estrutura celular com o mínimo de alterações possíveis, principalmente quanto à mor-
fologia, volume e relação espacial de organelas e macromoléculas; 
• Perda mínima de constituintes dos tecidos; 
• Proteção do espécimen contra os tratamentos subsequentes, incluindo lavagem, desidratação, em-
bebição, contrastação, vácuo e a exposição aos feixes de elétrons; 
• A fixação deve também, minimizar as alterações na reatividade química das substâncias celulares 
tais como as enzimas e preservar e protegê-las. 
 Idealmente, o que se espera de um método de fixação é a preservação satisfatória da célula como 
um todo e não meramente a melhor preservação de apenas uma parte dela. Na prática, a fixação é usual-
mente mais seletiva do que geral, uma vez que, o objetivo do estudo é que determina o tipo e a maneira 
de fixação. 
Na fixação, como em qualquer etapa do processamento histológico, é muito importante controlar 
os parâmetros (ou variáveis), que afetam a sua qualidade, tais como: concentração, temperatura, pH, solu-
ções diluentes (ex: tampões), osmolaridade, agitação e tempo, seja da solução fixadora bem como das 
demais soluções utilizadas no decorrer do processamento histológico. Particular atenção deve ser dada ao 
tamanho da peça anatômica a ser coletada, ou seja, quanto MENOR, melhor será a penetração dos líquidos 
(fixador, desidratante e outros ) em seu interior. 
 Os mais efetivos fixadores usados rotineiramente na MET são os aldeídos e o tetróxido de ósmio 
(OsO4). 
Dentre os aldeídos, o Glutaraldeído (ou aldeído glutárico), um dialdeído, promove ligações cruzadas 
irreversíveis, intra e intermolecular, dentro das proteínas, principalmente através dos grupos ∈-amino da 
lisina. Os grupos aminos nos fosfolipídios também reagem com o glutaraldeído, resultando na ligação entre 
estes lipídios e as proteínas da membrana. Outros tipos de lipídios, bem como, glicoproteínas não são fixa-
das com o glutaraldeído. Outro aldeído menos comumente utilizado é o formaldeído, obtido da dissocia-
ção do paraformaldeído em pó. Sendo um monômero, ele penetra nos tecidos mais rapidamente do que o 
glutaraldeído, fixa mais facilmente grandes blocos de tecidos, sendo por isso, utilizado para preservar a-
queles provenientes de cirurgia e biópsias, para ambas as microscopias, eletrônica de transmissão e óptica. 
O formaldeído é um pobre fixador para lipídios; degrada alguns deles e, aqueles fixados, durante a desidra-
tação são extraídos. Dessa forma, não sendo utilizado como fixador primário, são indicados, em certos 
casos, combinados com o glutaraldeído, na concentração de 1,5 a 4%. Ressalta-se que a mistura formalde-
ído-glutaraldeído penetra até 500 µm em tecidos ou órgãos, como o fígado de ratos ou camundongos. 
 Os aldeídos, sendo de natureza orgânica, não oferecem eletro-densidade ao espécimen. Essa defi-
ciência é superada pelo uso do tetróxido de ósmio, como agente pós-fixador. 
Procedimentos Práticos 
Fatias pequenas e finíssimas de tecidos são coletadas do animal, utilizando-se uma pinça e uma gi-
lete e, em seguida, imersas em frascos contendo solução fixadora de aldeído glutárico a 2,5% (podendo 
variar de 2 a 4%). Após 10 a 20 minutos de prévia fixação, sobre uma placa de cera ou um pedaço de bor-
racha com uma ou duas gotas do mesmo fixador, usando-se uma gilete nova, estas fatias são reduzidas a 
pequenas peças ou fragmentos com cerca de 0,5 mm3. Os fragmentos são colocados em frascos pequenos 
e arrolhados, contendo a referida solução fixadora, por 1 a 3 horas (às vezes, devendo permanecer por até 
24 horas), à temperatura ambiente ou a 4o C, de preferência, sob constante agitação mecânica. Findo o 
tempo de fixação, os fragmentos deverão ser lavados e pós-fixados em tetróxido de ósmio. 
Soluções Tampão 
O veículo de um fixador normalmente consiste de uma solução tampão a qual pode ser adicionado 
sais ou outras substâncias para aumentar a sua osmolaridade. O termo osmolaridade é usado aqui estrita-
mente com relação à resposta da célula quando imersa na solução, ou seja, uma solução fixadora é isotô-
nica com a célula (ou tecido) se a mesma não incha e nem se contrai, quando imersa nela (solução). Dentre 
as principais e mais utilizadas soluções tampões, citamos o Fosfato de sódio e o Cacodilato de sódio. 
Lavagem 
Após fixação primária com aldeído glutárico, o espécimen deve ser lavado e, posteriormente, pós-
fixado com tetróxido de ósmio a fim de que NÃO ocorra qualquer reação entre estes agentes fixadores. 
Uma vez pós-fixado, o espécimen deve ser lavado novamente, para que NÃO haja reação entre estes agen-
tes, o pós-fixador e o desidratante. Para as lavagens, utiliza-se a solução tampão utilizada como diluente 
dos fixadores, o que minimiza diferenças na osmolaridade efetiva. 
Procedimentos Práticos 
Utilizando-se uma pipeta de Pasteur, retira-se todo o liquido fixador do frasco. Com outra pipeta, 
coloca-se a solução tampão; agita-se o frasco para que os espécimens sejam bem lavados; novamente, 
retira-se o líquido e substitui-se por um novo e, a partir de então, marca-se o tempo desejado. Repetir esse 
procedimento pelo menos três vezes, como programado no protocolo experimental. Em seguida, procede-
se à pós-fixação com tetróxido de ósmio. 
Pós-fixação 
O tetróxido de ósmio é um fixador que reage com lipídios insaturados e com certas proteínas, bem 
como, fornece eletro-densidade ao tecido. Assim, o tetróxido de ósmio atua como fixador e como corante 
eletro-denso. Este agente é um fixador aditivo, pois se torna parte da substância celular que ele fixa. As 
ligações insaturadas nas moléculas lipídicas são os sítios de reação primários. O tetróxido de ósmio não 
reage com as pentoses ou hexoses dos açucares ou seus polímeros e, a maioria dos carboidratos dos teci-
dos fixados com o OsO4 são extraídos durante a lavagem e a desidratação. Uma rápida e uniforme fixação 
com o tetróxido de ósmio podem ocorrer até uma profundidade de 0,25 mm, para a maioria dos tecidos. 
A solução tamponada de tetróxido de ósmio é rotineiramente usada na concentraçãode 1% ou 2% 
(às vezes, 4%), a temperatura ambiente. 
Procedimentos Práticos 
A melhor preservação da ultra-estrutura celular tem sido obtida pela fixação primária com glutaral-
deído (ou mistura glutaraldeído mais paraformaldeido), como descrito acima e, em seguida, pelo tetróxido 
de ósmio. Esta fixação sequencial é denominada de dupla fixação. A pós-fixação do espécimen é realizada 
necessariamente, dentro de uma capela, uma vez que este reagente é muito volátil e cancerígeno. O líqui-
do de lavagem é substituído pela substância pós-fixadora, na concentração de 2%, usando pipeta de Pas-
teur. A pós-fixação é realizada à temperatura ambiente, por aproximadamente 2 horas, sob constante agi-
tação mecânica e dentro da capela. Findo o tempo, procede-se a uma nova lavagem com o tampão diluen-
te do fixador para, em seguida, desidratar-se os espécimens. 
Importante - Embora os tipos celulares variem de organismo para organismo, bem como entre os tecidos 
ou estágios do ciclo biológico, existem alguns critérios para a análise preliminar de avaliação da fixação 
(PEASE – 1968, Histol. Techniq. Electr. Microsc., Academic Press, NY) : 
1. Os núcleos devem aparecer uniformes e finamente granulares, usualmente associados com outras 
organelas. 
2. A cromatina deve aparecer como massas agregadas, embora nem sempre presentes no corte. 
3. Mitocôndrias devem aparecer sem expansões (inchações) e não terem aspectos “vazios”. 
4. Quando o retículo endoplasmático está disposto mais ou menos em cisternas, o arranjo e o diâme-
tro das cisternas devem ser mais ou menos uniformes e não expandidas irregularmente. 
5. O espaço entre as duas membranas do Envoltório nuclear deve ser uniforme. 
6. A Membrana Plasmática deve ser contínua. 
7. A matriz citoplasmática ou substância de fundo, deve ser finamente precipitada e não muito evi-
dente na maioria das células. 
Desidratação 
É necessária, uma vez que, vários meios para inclusão NÃO são miscíveis com a água. Dessa forma, 
toda a água contida no espécimen, proveniente da fixação, lavagem e pós-fixação, deve ser substituída por 
solvente orgânico antes da embebição e da inclusão (ou emblocagem). A remoção total da água é desne-
cessária quando o espécimen for embebido em resinas miscíveis em água. A água é removida, submeten-
do-se o espécimen a uma bateria crescente de álcool etílico ou acetona. O uso de óxido de propileno no 
último estágio da desidratação é necessário quando o etanol é usado como agente desidratante. 
Procedimentos Práticos 
O líquido de lavagem (ou o pós-fixador) é retirado do frasco com pipeta de Pasteur e substituído pe-
lo líquido desidratante. O frasco é agitado, manualmente, para que os espécimens sejam bem lavados. Em 
seguida, o líquido desidratante é substituído por um novo, da mesma concentração; os frascos, devida-
mente arrolhados e contendo os espécimens são guardados na geladeira a 4o.C sob constante agitação 
mecânica, durante o tempo determinado no protocolo experimental. Este procedimento é realizado para 
todas as etapas da desidratação. As seguintes baterias podem ser utilizadas: 
 
Acetona – 10% - 20% - 40% - 60% - 80% - 95% - 100% - 100% - 100% - 5 minutos para cada etapa. 
Álcool Etílico – 10% - 20% - 40% - 60% - 80% - 95% - 100% - 100% - óxido de propileno 100% (2 vezes) – 5 
minutos para cada etapa (ou tempos superiores). 
Embebição e Emblocagem 
Normalmente, os espécimens são extremamente pequenos, frágeis, porosos e quebradiços, devendo ser 
manuseados com muito cuidado. Esses materiais, após a desidratação, devem ser penetrados com resinas 
apropriadas e que facilite a obtenção dos cortes semi e ultrafinos. A maioria dos espécimens é embebida e 
emblocada em resinas NÃO miscíveis com a água, como por exemplo, Epon 812, Araldite e o Maraglas. 
Outros são embebidos e incluídos em resinas miscíveis com a água; dentre eles citamos o Durcupan e o 
Lowicryl K4M. As primeiras são polimerizadas por aquecimento, enquanto que as últimas, são “solidifica-
das” por aquecimento ou radiação ultravioleta a baixas temperaturas. A finalidade básica da emblocagem 
ou inclusão é oferecer ao espécimen condições de rigidez suficientes para a realização da ultra-microtomia 
e, por conseqüência, a obtenção de cortes ultrafinos (60nm de espessura). 
Procedimentos Práticos 
Embebição – semelhantemente aos procedimentos anteriores, o líquido desidratante é substituído pela 
substância na qual os espécimens ficarão embebidos. A embebição é realizada à temperatura ambiente, 
sob constante agitação mecânica e, sempre que possível, dentro de uma capela. O seguinte protocolo po-
de ser utilizado: 
 Acetona + Resina Epon 812 (3v : 1v) - 30 minutos 
 Acetona + Resina Epon 812 (1v : 1v) - 30 minutos 
 Acetona + Resina Epon 812 (1v : 3v) - 30 minutos 
 Resina pura Epon 812 - 30 minutos. 
Emblocagem – é feita em cápsulas de gelatina ou moldes de borracha. Uma pequena gota de resina Epon 
812 pura e nova é colocada no fundo da cápsula (ou no topo do molde). Os espécimens são removidos do 
frasco e colocados sobre um papel alumínio e, com um palito de dente, cada fragmento é colocado indivi-
dualmente, em uma cápsula, imerso na gota de resina. Em seguida, a cápsula é preenchida em sua totali-
dade, por resina. As cápsulas são transferidas para uma estufa a 60o.C, por 72 horas, para a polimerização 
da resina. Findo este tempo, cada bloco é retirado de sua respectiva cápsula (ou molde). 
Importante – especial atenção deve ser dada à orientação do espécimen, na cápsula ou no molde de bor-
racha, por ocasião da emblocagem. 
Ultra-microtomia 
Existem duas principais razões para se realizar cortes ultra-finos: 
 
 1. o feixe de elétrons do microscópio eletrônico de transmissão, operado a uma aceleração de vol-
tagem convencional (50 ~70Kv) não penetra cortes mais espessos do que 100nm; 
 2. sendo, a maioria dos tecidos de consistência relativamente mole, deve ser emblocado em resinas 
duras, tipo resinas epóxi. 
 
Usualmente, o bloco contendo o espécimen embebido deve ser reaparado antes da ultra-
microtomia. Para a MET, o principal propósito deste reaparamento é o de remover o excesso de resina ao 
redor do espécimen, no topo do bloco. 
Cortes semi-finos – o uso destes cortes em histologia e patologia é de grande valia no diagnóstico 
clínico. Além disso, saliente-se que as resinas preservam os componentes celulares melhor do que o faz a 
parafina. Para exame ao microscópio óptico, estes cortes são 5 vezes mais finos do que aqueles obtidos 
quando emblocados em parafina. Na MET, através destes cortes, pode-se determinar precisamente a área 
de interesse de estudo, prioritariamente à obtenção de cortes ultra-finos, ganhando-se assim, em econo-
mia de tempo gasto e na acuracidade do estudo. Localiza-se a área de interesse analisando-se os cortes ao 
microscópio óptico e, posteriormente, reapara-se o bloco de modo que ele contenha apenas a região de 
interesse. Este bloco agora é cortado para obtenção de cortes ultra-finos. 
Procedimentos Práticos 
Utiliza-se uma gilete para a remoção da resina, resultando num bloco cujo espécimen adquire uma 
forma piramidal, e o tamanho final não exceda a 0,3 mm2 (ou menor). Uma vez reaparados, os blocos são 
presos ao embolo do ultra-micrótomo e, com o uso de navalha de vidro e com sua “banheira” cheia de 
água, cortes semi-finos de aproximadamente 0,5 a 1 µm de espessura são realizados. Em seguida, são 
transferidos para uma lâmina de vidro, secos numa placa aquecedora a 60o.C e corados com azul de tolui-
dina a 1% + bórax. Esses cortes são examinados ao microscópio óptico para escolha da área de interesse. 
Como descrito acima, os blocos são novamente reaparados, resultando numa área extremamente 
pequena. Cortes ultra-finos, com espessura em torno de 60 nm são realizados no referido ultra-
micrótomo, utilizando-se preferencialmente, navalhade diamante. A espessura do corte é determinada 
por interferência de cor. 
Coleta dos cortes – os cortes ultra-finos ficam flutuando por sobre a água contida na banheira da navalha 
de diamante e são estirados por vapores de acetona. Em seguida, são coletados com grades metálicas per-
furadas (variando de 100 a 800 mesh). Normalmente, utilizam-se grades de cobre em trabalhos de rotina, 
mas, recomendam-se para trabalhos especiais as de níquel, ouro, platina e teflon. A perfuração (mesh) das 
grades mais comumente usadas é a de 200 a 300 mesh. Uma grade possui um diâmetro externo de 3 mm. 
Contrastação dos cortes ultra-finos 
A coloração positiva aumenta o poder de dispersão de elétrons por parte dos espécimens biológi-
cos. Este aumento é necessário por duas razões: 1. espécimens biológicos são compostos principalmente 
de elementos de baixo número atômico (carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio), os quais possuem um 
poder de dispersão de elétrons relativamente baixo; 2. para a obtenção dos cortes, os espécimens estão 
embebidos em resinas epóxi, as quais são de origem biológica e assim, possuem os mesmos átomos que os 
espécimens. Dessa forma, existe pouca diferença entre espécimens e resinas quanto ao poder de dispersão 
dos elétrons. Um relativo poder de dispersão de elétrons de um espécimen é aumentado pela introdução 
de metais de átomos pesados (ósmio, urânio e chumbo), no tecido ou corte, ou ambos. 
 Espécimens podem ser corados durante a fixação (com tetróxido de ósmio), antes ou durante a 
desidratação (com acetato de uranila, em bloco), após a emblocagem mas antes da microtomia (com ácido 
fosfotungstico, PTA) , e/ou após cortes ultra-finos (com acetato de uranila e citrato de chumbo). 
 
Procedimentos Práticos 
O método de dupla coloração de cortes semi-finos com acetato de uranila e citrato de chumbo é o 
mais utilizado. Uma pequena quantidade de pastilhas de NaOH é colocada em um dos lados de uma placa 
de Petri, produzindo uma atmosfera livre de CO2. Um pedaço de cera dental é colocado no outro lado da 
placa e servirá de local para a contrastação. A placa de Petri é coberta. Sobre o pedaço de cera, cada grade 
é imersa em uma gota de solução aquosa de acetato de uranila a 0,5 a 1%, por cerca de 5 minutos. Durante 
o tempo de contrastação, a atmosfera está livre de CO2. Em seguida, cada grade é lavada com jatos de á-
gua bi-destilada livre de CO2, utilizando-se uma pisceta plástica. Repete-se esta lavagem, 3 ou 4 vezes. 
 Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur limpa, duas gotas de citrato de chumbo (Reynold, J. Cell 
Biol., 17: 208 - 1963) são colocadas por sobre a placa de cera. Imediatamente, a grade é imersa na gota ou 
colocada por sobre a mesma, com o lado dos cortes voltados para baixo (sobre o corante). O tempo de 
contrastação varia de 5 a 15 minutos e a placa de Petri deve permanecer tampada. Em seguida, a grade é 
lavada vigorosamente com solução a 0,02N de NaOH (0,08%) livre de CO2 e água destilada livre de CO2. As 
grades lavadas são secas tocando a grade lateralmente em papel de filtro. 
Importante – os cortes não devem tocar o papel de filtro. Alguns pesquisadores recomendam contrastar as 
grades minutos antes de sua análise ao MET. 
Referências Bibliográficas 
1. HAYAT, M.A. – Basic transmission electron microscopy / Academic Press, Inc., pp. 411 / 1986. 
2. JOHANNESSEN, J.V. – Instrumentation and techniques / In “Electron microscopy in human medicine” / 
vol. 1 / McGraw – Hill, Inc. / pp. 348 / 1978. 
 
	Objetivos
	Processamento de Material Biológico MO
	Introdução
	Coleta do material
	Fixação
	Classificação
	Desmineralização ou Descalcificação
	Desidratação
	Diafanização
	Impregnação pela Parafina
	Inclusão definitiva
	Toalete do Bloco
	Microtomia (confecção de cortes)
	Coleta dos Cortes (Pescaria)
	Desparafinização e Hidratação dos Cortes
	Coloração pela Hematoxilina e Eosina
	Desidratação, Diafanização e Montagem Final
	Processamento de Material Biológico MET
	Introdução
	Anestesia do animal e Coleta do espécimen
	Procedimentos Práticos
	Soluções Tampão
	Lavagem
	Procedimentos Práticos
	Pós-fixação
	Procedimentos Práticos
	Fixação
	Procedimentos Práticos
	Soluções Tampão
	Lavagem
	Procedimentos Práticos
	Pós-fixação
	Procedimentos Práticos
	Desidratação
	Procedimentos Práticos
	Embebição e Emblocagem
	Procedimentos Práticos
	Ultra-microtomia
	Procedimentos Práticos
	Contrastação dos cortes ultra-finos
	Procedimentos Práticos
	Referências Bibliográficas