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BCFM - Condições químicas e físicas para o cultivo de microrganismos (11/12) Qual a importância desse tema? - Dependendo do microrganismo vocês vão verificar que cada um vai ter uma condição diferente para seu crescimento. Então a importância de estudar esses métodos físico-químicos é justamente para você estudar esses microrganismos em laboratório, com isso fornecendo condições físicas e químicas adequadas ao metabolismo desses microrganismos. Porque eles são diferentes, então eles tem exigências nutricionais e condições diferentes. - O objetivo então é verificar o crescimento celular não só para identificação desse microrganismo, mas também para caracterização e também para o controle do crescimento. Condições químicas: Nutrientes: todo meio de cultura deve ter nutrientes básicos e esses nutrientes são usados para duas frentes principais: 1. Para a síntese de diversos componentes celulares, tanto de procariotos como de eucariotos; =>metabolismo anabólico. 2. Para obtenção de energia; =>metabolismo catabólico. - Você pode usar nutrientes com o objetivo de classificar microrganismos, porque existe uma grande diversidade de nutrientes disponíveis na natureza que são metabolizados ou não por diferentes tipos de microrganismos. - Essas diferentes classes tem exigências nutricionais típicas para cada espécies, uns são mais exigentes nutricionalmente e outros são menos. Então se necessita de condições diferenciais para diferentes microrganismos. - E também dependendo da localização, presença ou não desses nutrientes, no ambiente seja no solo, da água. - Esses nutrientes podem ser considerados de diferentes formas de acordo com suas exigências, podem ser: macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento. Macronutrientes: são nutrientes que são exigidos em grandes quantidades, nutrientes chaves para as funções celulares. Carbono- certa de 50% do peso seco de uma célula é composto de carbono, então ele é utilizado não só para a formação dos componentes estruturais da célula como fonte de energia. 1. Quando a célula necessita de fontes de carbono para seus constituintes: - Fonte inorgânica, como o CO2 atmosférico, a célula então é autotrófica. - Fonte orgânica, como por exemplo, baseada em carboidratos/lipídios/ proteínas que é o nosso caso, a célula então é heterotrófica. 2. Quando ela necessita de energia para catabolizar, para fazer funções celulares: -Se os compostos químicos forem orgânicos ou inorgânicos a célula é quimiotrófica. ( Qual a diferença de uma célula que utiliza compostos orgânicos ou inorgânicos? Se a célula utilizar compostos como fonte de energia orgânicos, ela vai ser uma célula quimiorganotrófica. Se utilizar um composto inorgânico é uma célula chamada quimiolitotrófica.). - Se a célula usa a luz é uma célula fototrófica, como por exemplo, bactérias, plantas etc. Segue a tabela que ele leu no áudio para resumir: Qual a importância de se estudar as bactérias quimioheterotróficas? - Na maioria das vezes são os microrganismos mais presentes; - Muitos são de importância médica, há várias bactérias que são patogênicas; - Tem importância industrial, não só na indústria alimentícia, mas também na degradação de poluentes como, por exemplo, pesticidas, plásticos e hidrocarbonetos. Várias bactérias são utilizadas para conter essa poluição ambiental; - Elas tem grande versatilidade de metabolismo, algumas bactérias usam exclusivamente glicose outras podem usar vários tipos de carboidratos e compostos orgânicos como a Pseudomonas que utiliza diferentes carboidratos, aminoácidos, hidrocarbonetos, pesticidas. -Essas bactérias quimioheterotróficas para obter esses compostos orgânicos, elas necessitam assimilar esses compostos espontaneamente (?). Então elas podem utilizar vários polímeros extracelulares, como por exemplo, o amido, a celulose, o glicogênio e o ácido hialurônico. Só que para isso ela precisa secretar algumas enzimas, enzimas essas que vão degradar os compostos em partículas menores, como por exemplo, a amilase, a celulase e a hialuronidase, ai sim a célula vai conseguir obter esses nutrientes. Segue tabela para facilitar a explicação: Nitrogênio - é outra classe de macronutrientes tão importante quanto o carbono. Ocupa cerca de 10 a 15% do peso seco de uma célula. Ele é presente em diversos compostos celulares como proteínas, carboidratos e ácidos nucleicos e que também podem ser utilizados não só como componentes estruturais, mas também para obtenção de energia. - Fontes inorgânicas de nitrogênio: N2, NO3-, NO2-, NH4. - Fontes orgânicas de nitrogênio: ureia, aminoácidos, peptídeos. Para se obter nitrogênio desses peptídeos é necessário enzimas hidrolíticas, enzimas extracelulares que vão degradar esses peptídeos em moléculas menores. Enxofre- outro macronutriente também utilizado como componente estrutural de proteínas e também para obtenção de energia. É obtido, assim como o nitrogênio de fontes orgânicas e inorgânicas. - Fontes inorgânicas de enxofre: SO42-, H2S. - Fontes orgânicas de enxofre: aminoácidos sulfurados (cisteína, metionina). * Nutrientes importantes em menor escala: Potássio- é requerido na síntese de várias enzimas, também é utilizado na síntese de proteínas. Magnésio- estabilização de ribossomos, membrana ac. Nucleicos e atividade enzimática. Cálcio- estabilização de paredes celulares e papel na termoestabilidade de endósporos. Ferro- componente de citocromos e ptns de transporte de elétrons. Fosfato- síntese de ac. Nucleicos e fosfolipídios. Micronutrientes ou elementos de traço: são requeridos em poucas quantidades. Esses elementos podem ser obtidos na água ou em outros componentes. São eles: - Zinco: cofator para várias enzimas -Cobalto: vitamina B12 -Manganês - Vn Fatores de crescimento: compostos essenciais, que não são sintetizados pelos microrganismos. Não são utilizados para obtenção de energia, são utilizados em outros processos para a célula. Exemplos: aminoácidos, nucleotídeos e vitaminas. Em culturas de laboratório, tem certos microrganismos ou culturas animais que se você não acrescer esses fatores de crescimento elas não crescem, elas dependem muito desses fatores de crescimento. Dentre eles nós temos uma tabela com várias vitaminas: -Alguns microrganismos necessitam muito desses fatores de crescimento, porque muitos não sintetizam, outros sintetizam. - Quanto à necessidade desses fatores de crescimento, o organismo pode ser: 1. Prototrófico: quando o microrganismo não necessita desses fatores de crescimento porque ele tem grande capacidade biossintética, como, por exemplo, os microrganismos do solo e da água. 2. Auxotrófico: quando o microrganismo precisa de fatores de crescimento por ter menor capacidade biossintética e são mais exigentes nutricionalmente, como, por exemplo, microrganismos de alimentos, mucosas e sangue. No geral são microrganismos patogênicos. Entendendo quais são os componentes de um meio de cultura vamos entender o que é propriamente um meio de cultura. Meios de cultura: são soluções nutricionais com grande quantidade de água e vários nutrientes essenciais para determinados tipos de microrganismos. Eles tem que ter pelo menos uma formulação básica com fontes de carbono nitrogênio e sair minerais. - Meio mínimo: é um meio relativamente básico que tem condições minimamente necessárias para o crescimento do microrganismo. Não apresenta fatores de crescimento e são utilizados para o crescimento de microrganismos prototróficos. - Meio definido: são meios em que você sabe exatamentea composição do meio, quando você vai fazer o meio você tem os compostos exatamente separados, como, por exemplo, se você colocar cinco gramas de glicose você esta sabendo quanto de glicose tem no meio assim como para sacarose, sódio etc. Ele é ideal para microrganismos auxotróficos de metabolismo conhecido porque a partir do momento que você conhece o metabolismo do microrganismo você sabe as exigências nutricionais dele. Então você pode acrescentar no meio de cultura todos os nutrientes fundamentais e básicos para que esse microrganismo prolifere. - Meio complexo: não tem uma composição química definida, geralmente são meios que tem vários extratos como, por exemplo, extratos peptídicos. Como exemplo, tem meios que levam fusão de várias coisas como cérebro e coração de carneiro, então você não sabe exatamente a quantidade de cada composto que tem ali. Exemplos: meios que usam sangue, extrato de levedura, extrato de carne, peptona, leite. Esses meios são utilizados para microrganismos auxotróficos que precisam de uma composição mais abrangente de nutrientes, ou seja, são mais exigentes nutricionalmente. Figura que ele usou como exemplo: Esses meios de cultura não só podem ser utilizados para o crescimento, mas também para diferenciação dos microrganismos. Nas aulas práticas de provas bioquímicas usamos meios seletivos ou diferenciais. - Meio seletivo: tem substâncias que vão inibir seletivamente o crescimento de certos microrganismos, eles vão fornecer o crescimento de alguns tipos de microrganismos em detrimento de outros. - Meio diferencial: contém indicadores que vão permitir a diferenciação dos microrganismos. Ex: ágar eosina-azul de metileno (EAM), ele é tanto seletivo quanto diferencial. Ele é seletivo porque possui o azul de metileno que vai impedir o crescimento de gram positivos, favorecendo o crescimento de bactérias gram negativas. E ele é diferencial porque ele não tem glicose aqui ele tem sacarose e outro carboidrato e dependendo da bactéria que vai estar aqui vai metabolizar ou não produzindo ou não ácidos, se tiver pouca produção de ácido a colônia vai ficar quase transparente (1ª da esquerda pra direita), se tiver uma produção mais intermediária fica dessa cor (2ª da esquerda pra direita) e se tiver muita produção de ácido elas ficam nesse verde mais metalizado. Esse meio é muito utilizado para o crescimento de enterobactérias, porque dependendo da bactéria a gente vai ver um perfil diferente de colônia. Existem bactérias que não crescem em nenhum meio de cultura, na verdade há uma estimativa de que apenas 5% dos microrganismos são cultivados em laboratório. Então a grande maioria não é cultivável, não conhecemos a grande maioria das bactérias. Porque elas não crescem? Porque há falta de um meio de cultura universal, há necessidade de grandes quantidades de fatores de crescimento, geralmente são patógenos intracelulares obrigatórios, é preciso o uso de culturas de células, animais de laboratórios e ovos embrionários. Ex: Treponema pallidum, causador da sífilis, que tem uma exigência nutricional muito grande. Outro exemplo de cultura é a cultura de células animais que precisam de muito cuidado de manuseio, ela são muito mais “frescas” do que muitos microrganismos. As células são muito exigentes nutricionalmente Condições físicas: são condições que juntamente com os nutrientes são necessárias para o cultivo de microrganismos. Temperatura: é a condição mais importante para o cultivo de microrganismos. A faixa de temperatura ideal é de 25 a 40ºC. A temperatura é importante porque quanto menor a temperatura, menor a atividade enzimática dessas enzimas e são as enzimas que catalisam as reações bioquímicas dentro da célula, então se você não tem enzima metabolicamente ativa você vai ter reações metabólicas desaceleradas ou nulas. Então quanto maior a temperatura, mais energia cinética você vai fornecer e maior é a atividade dessas enzimas. Gráfico que ele usou pra explicar (se quiserem ouvir no áudio esta em 26:15): - Classificação quanto à temperatura de crescimento: *Ele explica o gráfico no áudio mais depois fala de cada um. Psicrófilos- geralmente tem um crescimento abaixo de 20ºC, com crescimento ótimo em 15º. São geralmente bactérias e arqueas do Ártico, Antártica e oceanos. Eles tem uma limitação porque necessitam da presença de água no estado líquido, porque tendo água eles conseguem sobreviver e se proliferar. Mesófilos- tem um crescimento entre 20 e 40ºC, que é geralmente o que a gente trabalha em laboratório. São geralmente microrganismos patogênicos, que sobrevivem a 36ºC que é nossa temperatura corpórea. E alguns desses microrganismos mesófilos podem crescer em temperaturas baixas de 0 até 4ºC, só que obviamente a temperatura ótima é entre 20 e 40ºc, esses microrganismos são chamados de pscicrotolerantes e são muito presentes, por exemplo, na deterioração de alimentos. Termófilos- são muito comuns de áreas de atividade vulcânica. Tem um crescimento de 40 a 80ºC, são geralmente bactérias e arqueas do solo. Hipertermófilos-são extremófilos, que podem crescer acima de 80°C, alguns crescem até acima de 100ºC. São geralmente arqueas de fontes termais e gêiseres. Tabela resumindo as temperaturas mínimas, ótimas e máximas de algumas bactérias: Adaptações a baixas temperaturas: - As enzimas desses microrganismos tem proteínas com estrutura predominante em α-hélice, enquanto microrganismos mesófilos tem proteínas em estrutura beta-pragueada. Essa estrutura em α-hélice que torna a proteína/enzima mais maleável, que em baixas temperaturas é importante porque quando você reduz à temperatura as enzimas tendem a ter uma menor atividade enzimática, então quando você tem estruturas em α-hélice ela fica mais maleável e consegue ter atividade nessas baixas temperaturas. - Essas enzimas também tem um maior número de aminoácidos polares, o que é bom em ambiente altamente polar no citoplasma. - A membrana plasmática desses microrganismos possui muitos ácidos graxos insaturados, no geral a membrana celular de bactérias tem ácidos graxos saturados, só que baixas temperaturas você precisa de ácidos graxos insaturados para manter a membrana mais fluida e as atividades celulares continuarem. Adaptações a altas temperaturas: - No geral, as enzimas dos microrganismos de altas temperaturas e os normais não tem muita diferença, com exceção na localização de alguns aminoácidos, esses aminoácidos vão permitir que essas proteínas não se desnaturem que elas tenham essa conformação dobrada ali de forma mais estável. - As proteínas possuem aminoácidos hidrofóbicos no interior da estrutura, dando uma forma, mas enrijecida a ela quando o ambiente está muito termolábel. - Esses microrganismos tem alto teor de GC nos seus ácidos nucleicos e quando maior o teor de GC mais energia é preciso para quebrar as ligações. - Contrariamente aos microrganismos que vivem em baixas temperaturas, os hipertermófilos possuem muitos ácidos graxos saturados o que permite a membrana ficar mais rígida frente a essas altas temperaturas que poderiam derreter a membrana. - Além disso, nós temos a presença em arqueas, por exemplo, de uma membrana que é diferente que não é uma bicamada lipídica e sim uma monocamada, e essa monocamada possui cadeias de isopreno que são ligadas por ligações do tipo éter ao glicerol, são ligações mais rígidas. Uma monocamada é muito mais difícil de desestruturar do que uma bicamada lipídica. pH: quanto ao pH do meio os microrganismos podem ser acidófilos, neutrófilosou alcalifílico. Acidófilos- sobrevivem em pH abaixo de 6,5. Fungos, bactérias e arqueas são bem adaptados a essas condições de pH. São presentes em certos alimentos e mucosas. Neutrófilos- crescem em ambiente de pH neutro, entre 6,5 e 8,5. São geralmente células mamíferas, protozoários e bactérias patogênicas. Alcalifílicos-crescem em pH acima de 8,5. São microrganismos que vivem em solos e lagos com altas quantidades de carbonato, são geralmente bactérias e arqueas. Tem uma aplicação industrial muito importante, porque elas produzem enzimas extracelulares, por exemplo, utilizadas na indústria de detergentes, essas enzimas vão atuar melhor nesse ambiente alcalino. - Figura dizendo a presença de determinados microrganismos em determinados alimentos/ambientes de acordo com o pH. - Figura resumindo os pHs mínimos, ótimos e máximos de alguns microrganismos. Da mesma forma que os microrganismos desenvolveram habilidades para superar temperaturas altas e baixas, eles também desenvolveram algumas habilidades para se manter em ambientes de pH diferentes. No geral, o pH dos microrganismos nas células é mais pra neutralidade, geralmente de 5 a 9, sempre vão ter alguns com pH menos de 4,5 e outros de quase 10. Esses extremos são importantes de ser respeitados porque os RNAs, eles não sobreviviam em condições básicas e os DNAs em condições ácidas, então para manter esse pH mais próximo da neutralidade as células dependem de vários fatores. Então, por exemplo, se você tem uma bactéria que não sobreviva em ambiente ácido, ela vai então colocar H+ para fora, hidrogênio esse que vai acidificar seu pH interno, ela possui também outros cofatores que também colocam H+ pra fora e também nas suas proteínas do complexo respiratório elas vão jogar muito H+ pra fora que é o que é feito na cadeia transportadora de elétrons. Num desafio alcalino, então, ocorre o contrário as proteínas de transporte vão colocar sódio pra fora e H+ pra dentro. O2(potencial de oxi-redução): outro fator importante é a presença ou não de oxigênio. - Microrganismos aeróbios obrigatórios: há necessidade da presença de O2, que é o melhor aceptor final de elétrons da cadeia respiratória na respiração aeróbia. No entanto, esse metabolismo do O2 ele não é só bom pelo aceptor de elétrons, mas também é ruim porque produz diversos compostos, espécies reativas de oxigênio que são muito tóxicas para a célula. Dentre essas espécies nós temos o superóxido, o peróxido de hidrogênio e radicais hidroxil. Para conseguir remover esses radicais livres há a presença de 3 enzimas na célula, uma delas é a catalise-a peroxidase e a superóxido dismutase(SOD). Então são essas enzimas que vão, como por exemplo a catalase, degradar o peróxido de hidrogênio(altamente prejudicial) em água(H2O) e O2, assim como a peroxidade, a superóxido dismutase(SOD) e em alguns microrganismos elas podem até atuar em conjunto. Imagem de exemplo: -Microrganismo aeróbio microaerófilo: necessitam de pequenas quantidades de O2, bem menos que os aeróbios obrigatórios. Presença de moléculas sensíveis a altos níveis de O2. -Microrganismo anaeróbio: tem sobrevivência apenas na ausência de O2. Eles podem tolerar o oxigênio e alguns não, pode ser letal. Nos aerotolerantes, eles toleram pequenas quantidades de O2, mas não utilizam o oxigênio eles removem esse O2 pela oxidação de compostos orgânicos, como glicose para ácido glicônico. E nos anaeróbios restritos o O2 é letal porque eles não possuem aquelas enzimas( SOD, peroxidase e catalase) para remover os compostos tóxicos. - Microrganismo facultativo: ele pode ter crescimento tanto na presença quanto na ausência de O2, porque possui um metabolismo bastante versátil. E se ele cresce também na presença de O2 ele tem que ter alguns mecanismos de defesa que é a presença de SOD, peroxidase e catalase. Tabela que ele leu no áudio( se quiserem ouvir está em 49:06): Experimento que ele usou pra explicar qual tipo de microrganismo está presente em cada tubo: No experimento foram usados 5 tubos com meio de cultura com Tioglicolato(que remove o oxigênio, transformando-o em água), Resazurina(indicador redox, quando se tem a presença de oxigênio o meio muda ficando com o aspecto rosa) e pequena quantidade de ágar. Se você inocula as bactérias nesses tubos, que tipo de bactérias seriam essas? a) Aeróbio- pois só tem oxigênio na parte de cima então ela vai crescer próximo da superfície onde está o oxigênio. b) Anaeróbio- o crescimento é longe do oxigênio. c) Aeróbio facultativo-pois cresce tanto na presença de O2 quanto na ausência. No entanto, ele vai crescer um pouco mais perto da superfície, onde tem oxigênio porque gera mais energia para a célula. d) Microaerófilo- porque ele metaboliza pouco com poucas quantidades de oxigênio. e) Anaeróbio aerotolerante-crescem o meio todo porque eles toleram o oxigênio. Para se trabalhar com bactérias anaeróbias é preciso condições especiais, uma delas é usar o meio Tioglicolato que “sequestra” o oxigênio, a outra é trabalhar com jarras de anaerobiose e câmara de anaerobiose, esses aparatos removem o O2 e o substituem por H2 e CO2, ou seja, transformando aquele ambiente altamente aeróbio em um ambiente anaeróbio. Osmolaridade: outro fator importante é a osmolaridade, ou seja, a quantidade de soluto que tem no meio. Esses microrganismos podem ser: Halotolerantes: toleram até 7,5 a 10% de sódio. Halófilos: toleram até 30% de NaCL. Podem ser discretos( requerem até 6% de sal) ou moderados( até 15%). Halófilos extremos: vivem em concentrações de sal de 30% ou mais. -A osmolaridade é importante porque a partir da quantidade de soluto no meio você vai saber qual a disponibilidade de água livre no meio. Essa disponibilidade de água é chamada de atividade de água(Tw). A importância dessa água livre é que a célula depende de água pra exercer suas funções, dentre elas a atuação de suas enzimas. Essa atividade de água é calculada através de uma razão e essa razão sempre varia de 0 a 1, onde, por exemplo, a água pura(sem soluto algum) você teria então uma atividade de água de 1 e outros produtos como, por exemplo, cereais você teria uma disponibilidade de água de 0,7. - Isso é importante por conta dos transporte de membrana, como a osmose, que é a passagem da água do meio menos concentrado para o mais concentrado, para equilibrar as concentrações. Isso é importante porque as células podem viver em meio isotônico(concentrações iguais de soluto no meio externo e interno), meio hipotônico(onde há uma entrada de água na célula, o que pode romper a membrana) ou meio hipertônico(onde a tendência da célula é perder água). No caso dos meios hipertônicos, onde há perda de atividade de água, alguns microrganismos desenvolveram maneiras de contrabalancear isso: adicionando solutos para dentro da célula, como o HCL, ou então produzindo algumas substâncias como glicina, manitol, betanina que é característica de algumas bactérias. Algumas arqueas produzem heteropolissacarídeo sulfatado que se ligam a alta concentração de sódio presente externamente. Figuras para exemplificar osmose:
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