Sequesnciamento de DNA - Aula 7

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Sequenciamento de DNA 
Profa. Dra. Mariana Melo 
Faculdade Maurício de Nassau 
Definição 
• Sequenciamento de DNA = determinar a 
sequência de pares de base de uma molécula 
de DNA 
Histórico 
• Estrutura do DNA 
– Watson & Crick, 1953 
 
• Sequenciamento 
– Maxan & Gilbert, 1977 
• Método da degradação química 
– Sanger, 1977 
• Método do dideoxinucleotídeo 
Métodos clássicos 
de 
sequenciamento 
Método da degradação química 
• Método baseado na alteração química da 
molécula de DNA, com posterior 
sequenciamento baseado na clivagem em 
nucleotídeos específicos 
 
• Também chamado de método enzimático ou 
método de Maxam & Gilbert 
Método da degradação química 
Método do dideoxinucleotídeo 
• Método baseado na síntese de DNA a partir de 
nucleotídeos modificados – os 
dideoxinucleotídeos, que provocam a interrupção 
da síntese 
 
– Separação dos fragmentos gerados por eletroforese 
– Identificação do último nucleotídeo adicionado 
durante a síntese 
 
• Também chamado de método de Sanger 
Método do dideoxinucleotídeo 
Método do dideoxinucleotídeo 
Sequenciamento semi-automático 
• Substituição de marcadores radioativos por 
marcadores fluorescentes 
 
• Fluorófos 
 
• Eletroforese com utilização de ddNTP 
(dideoxinucleotídeos) fluorescentes 
ou 
• Eletroforese com corantes fluorescentes 
colocados no poço no próprio gel 
 
Sequenciamento Automático 
• Utilização de ciclos de amplificação 
Sequenciamento Automático 
• Primer anela-se a apenas uma das fitas do 
DNA 
 
• Utilização de ddNTP marcados com 
fluorescência 
 
• Resultado: mistura de fragmentos de DNA 
terminado em ddNTPs fluorescentes que 
podem ser detectados 
Sequenciamento Automático 
Vídeo: http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=1966 
Sequenciador de DNA 
Outras técnicas de sequenciamento 
• Pirosequenciamento 
 
• Sequenciamento por hibridização 
 
• Espectrometria de massa 
 
 
Aplicações do sequenciamento 
• Análise genômica 
 
• Analise filogenética 
 
• Biologia da conservação 
 
• Epidemiologia