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UNIJUI – UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RS DBQ – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E QUÍMICA CURSO - QUÍMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS INDICE APRESENTAÇÃO........................................................................................................................... 1 INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES........................................................... 2 MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL ....................................................................... 9 ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR..................................... 18 CRESCIMENTO CELULAR ........................................................................................................... 27 CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS............................................................................................ 37 EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES – STARTERS........................................................... 40 SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO.................................................................................................. 48 INTRODUÇÃO AO ESTUDO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA........................................... 54 SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO.............................................................. 66 SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM LEVEDURAS....... 73 PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM BACTÉRIAS.......................................... 77 DIGESTÃO ANAERÓBICA (FERMENTAÇÃO METANOGÊNICA)......................................... 79 TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS.............................................. 89 Prof. Raul Vicenzi 1 APRESENTAÇÃO A Biotecnologia é um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformação ou tratamento de materiais de origem biológica. Spinks (1980) define Biotecnologia como a utilização de organismos vivos ou sistemas biológicos para a produção industrial e seu uso em serviços de saneamento. A tendência atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais essencial, a Microbiologia Industrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos como agentes de degradação e síntese. Por semelhança dos conceitos fundamentais que regem o tratamento biológico de efluentes, o cultivo de células animais e vegetais e a produção de certos medicamentos. Assim, também devido ao seu amplo significado, pode englobar também aspecto igualmente importante da Ciência, Tecnologia e Engenharia de Alimentos. De certa forma, os processos de fermentação representa uma elo que liga as antigas artes de elaboração de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de uma flora microbiana natural com a moderna industria de fermentação de alimentos que utilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A produção em larga escala de proteínas de organismos unicelulares, produção de antibióticos, produção de células animais e vegetais e a produção compostos químicos a partir de matérias-primas renováveis em substituição aos combustíveis fósseis, são exemplos de outras áreas onde os processos fermentativos podem ser utilizados. O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como objetivo principal estudar alguns elementos essenciais e básicos dos processos fermentativos: introdução a microbiologia industrial, sistemas de fermentações, desenho de fermentadores, cinética de crescimento, metabolismo microbiano, esterilização na indústria fementativa, produção de enzimas, cultivos starters. Objetiva, também, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de fermentação: alcoólica, láctica, acética, metanogênica. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 2 INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES O termo Fermentação deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas devido a produção de dióxido de carbono pela ação das leveduras sobre o extrato de frutas ou grãos de malte; Þ Significado bioquímico: relata a geração de energia pelo catabolismo de compostos orgânicos; Þ Produção de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma época e as bebidas alcoólicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China; Þ Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egípcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, após estrusavam e amassavam os grãos lavando-os após para obter a bebida, ainda, utilizavam as leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pães; Þ Leite e derivados lácteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando retido no estômago de terneiros jovens coagulava-se (ação enzimática); Þ Produtos cárneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem já sabia que a carne finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradável Este produto foi o precursor da lingüiça fermentada produzida atualmente. O nome salame provém da cidade de Salamis, destruída a mais de 2000 anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros. Exame microscópico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440 a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma pureza maior nos sedimentos mais recentes. A necessidade de preservar a carne da caça e de animais domésticos abatidos durante o inverno e consumidos no verão (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse soluções para a preservação do produto. Assim, os produtos cárneos fermentados tornaram-se de grande importância no mercado alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma característicos da tecnologia usada. Ø Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscópio, foi o primeiro a examinar em 1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida...... Ø 1856-1857: Louis Pasteur, após investigações detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o açúcar em etanol e CO2 quando em anaerobiose. Ø Pateur também observou muitas outras fermentações: Ex.: observou provavelmente um Penicillium que fermentava D-tartarato de amônio em uma mistura racêmica de D e L-tartarato (tartarato de Na, K); Ø Observou também como uns microrganismos cilíndricos produziam ácido butírico somente em condições anaeróbias e investigou a produção de ácido acético por fermentação; Ø 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo frente a outros e previram suas aplicações terapêuticas; Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 3 Ø 1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu técnicas de cultivo puro assim como outros métodos bacteriológicos clássicos utilizados até hoje; Ø Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentações industriais: · Emprego de fungos e leveduras na modificação de alimentos e bebidas e os estudos microbiológicos pioneiros de Pasteur e Kock. Ø Desenvolvimento de fermentações em superfície ou semi-sólidas surgiu com o desenvolvimento de alimentos orientais e durante as grandes navegações; · Capacidade hidrolítica de determinados fungos em hidrolisar o amido e proteínas na produção de molho de soja, este foi o inicio das fermentações industriais. Ø Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obtenção de proteínas alimentícias microbianas (SCP - proteínas de organismos unicelulares) e de inóculos de microrganismos Ø Produção de vinagre e os estudos de Pasteur sobrea produção de ácidos prepararam o caminho para o desenvolvimento de fermentações que produzissem ácidos orgânicos; Ø O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de técnicas que permitiram estudar as aplicações industriais de espécies microbianas individuais, iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condições assépticas nas fermentações industriais. FERMENTAÇÃO DE ALIMENTOS Fermentação de pão, queijo e cerveja bem como bebidas alcoólicas desenvolveram-se para satisfazer as exigências comerciais modernas de produção em grande escala, com qualidade elevada e constante, custos competitivos e variedade de produtos. Ø Produção de cultivos “Starters” para produtos lácteos e o emprego de enzimas industriais melhoraram a eficiência dos processos, assim como a automação e controle da qualidade na produção de pão e produtos lácteos. · Fermentação de pão em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo; · Uso de amilases microbianas na produção de açúcares fermentescíveis a partir de grãos de amido, proporcionando açúcares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a massa de pão e produzir textura característica). Técnicas de Pasteurização: permitiram a produção de cerveja em escala industrial fazendo com que industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos produzindo em grande escala. Técnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos) Ø Controle da velocidade de inoculação; Ø Viabilidade e condições de armazenamento das leveduras; Ø Controle das condições de oxigênio dissolvido; Ø Controle da concentração de Nitrogênio solúvel e de açúcares fermentescíveis no álcool; Ø Controle da temperatura do processo; Ø Fermentação em processos contínuos; Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 4 Introdução de inovações tecnológicas como: Ø Obtenção de cerveja com elevadas concentrações de mosto; Ø Emprego de cereais não malteados e enzimas microbianas Ø Produção de cervejas com baixos níveis de carboidratos Ø Aplicação de técnicas genéticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e eliminar características indesejáveis. LEVEDURAS DE PANIFICAÇÃO Ø Século XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais; · Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentação variáveis, foram gradualmente sendo substituídas por leveduras procedentes de fábricas de bebidas alcoólicas. Ø 1781 obtém-se as primeiras leveduras de panificação prensadas, obtidas através do processo “Holandês” e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado “Viena” · Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matéria-prima e 30% de álcool. · 1879-1919 - avanços substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa permitindo a obtenção industrial de leveduras para panificação de forma independente de bebidas alcoólicas; · 1879 - Marquardt introduziu a aeração no processo fermentativo de cereais permitindo aumentar o rendimento e diminuindo a produção de álcool a 20%. INOVAÇÕES TECNOLÓGICAS: Adição gradual de açúcar Surge o primeiro processo de retro-alimentação Permite elevar a eficiência do processo ate próximo do máximo teórico sem a formação conjunta de álcool. Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produção de leveduras de panificação usando melaço (todo resíduo dos processos industriais da época) como substrato, com a finalidade de produzir proteína para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produção de SCP. Durante a Segunda Guerra Mundial, também na Alemanha, inicia-se a produção de SCP para consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melaço procedente da produção de papel e polpa de celulose, obtendo-se os açúcares (substrato) a partir da hidrólise ácida da madeira. USA, Suíça, Taiwan e Rússia passam também a utilizar este processo. ÁCIDOS ORGÂNICOS Ø 1881 inicia-se a produção comercial de ácidos orgânicos sendo que até hoje 50% do ácido láctico utilizado a nível industrial é produzido via fermentação usando Lactobacil1us delbrueckii. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 5 · Ácido Cítrico extraído inicialmente a partir do suco de limão e posteriormente sintetizado a partir do glicerol. Ø 1923 - inicia-se a produção de Citrato via fermentação industrial, atualmente estima-se uma demanda aproximada de 450.000 toneladas/mês produzidas exclusivamente por fermentação, inicialmente: · Empregava-se cultivo em superfície de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato). · Após a 2ª Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977 desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente. Outros ácidos orgânicos são produzidos de forma econômica e rentável por fermentação: Ex.: produção de Acido Glucônico e Acido Acético, este obtido pela oxidação do etanol utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o Ácido Acético em escala industrial é produzido somente por via química. ÁLCOOL E CETONAS Ø Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados na produção de glicerol, componente para produção de explosivos, desenvolve a primeiro processo fermentativo de produção de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presença de bissulfito de sódio; Ø Durante a Primeira Guerra na Inglaterra é desenvolvido o processo de fermentação acetona- butanol por via anaeróbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em grande escala que necessitava métodos de cultivos puros para prevenir a contaminação. · Após a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol, produzido por fermentação até os anos 50, sendo substituído pelo n-butanol produzido a partir do petróleo, cujo preço era mais baixo que o preço do amido e dos substratos a base de açúcar utilizados no processo fermentativo. · 1941 - Inicia-se a implementação da indústria da fermentação alcoólica nos USA, após revogar- se a proibição da produção de álcool por bioprocessos, sendo responsável então por 77% do álcool industrial produzido Ø 1973 - A crise do petróleo faz surgir projetos para produção de combustíveis alternativos. · Surge o PROÁLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhões de galões de etanol/ano, a partir da cana-de-açúcar. · Nos USA inicia-se o “Gasohol Program” que destinava-se a produzir álcool a partir do milho, adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um número muito grande de plantas industriais de pequena e grande escala utilizando processos contínuos e descontínuos. AMINOÁCIDOS Glutamato Monosódico e a Lisina são os que se produzem em maiores quantidades, cerca de 500.000 e 80.000 toneladas/mês, respectivamente. A produção de aminoácidos é resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos bioquímicos que regulam a biosíntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se superproduções a partir de mutações e do controle do processo de fermentação. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 6 As novas técnicas passam a: Ø Estimular as células para que usem substratos alternativos; Ø Prevenção ou impedimento de reações laterais; Ø Indução e ativação de enzimas biosintéticas; Ø Redução ou inibição de atividades enzimáticas que poderiam degradar o produto e, finalmente facilitar a excreção do aminoácido pelo microrganismo.Ø As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentação para produção de ácido glutâmico foram as responsáveis pelo grande avanço na produção de aminoácidos por fermentação. · Hoje a maioria dos aminoácidos comerciais são produzidos por fermentação. Assim como a de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor. BIOPOLIMEROS Ø Goma Xantana - biopolímero mais importante atualmente em função do volume de produção, utilizada como gelificante ou estabilizante de suspensões. Produzido por fermentação utilizando a bactéria Xanthomonas campestris. Outras gomas: Ø Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii; Ø Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans; Ø Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum; Ø Gelano produzido pela Pseudomonas elodea Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando problemas nos processos de mistura, transferência de massa e calor em fermentadores. Estes aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentação. POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : poliéster termoplástico acumulado intracelularmente em alguns tipos de bactérias (Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre outras) até um nível de 80% da massa seca celular, sua produção permite a fabricação de plásticos biodegradáveis. VITAMINAS A maioria das vitaminas é produzida por métodos químicos. Entretanto algumas vitaminas podem ser produzidas por fermentação. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, ácido fólico, ácido pantotênico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina. · A síntese química da vitamina B12 é muito complexa sendo que sua produção comercial só é viável por via fermentativa utilizando Pseudomonas. Ø Riboflavina: sua produção por fermentação compete eficazmente com os métodos de síntese e semi-síntese, sendo que 30% da demanda mundial é produzida por fermentação. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 7 · Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentação, período muito inferior aos 5 dias necessários quando se utiliza Ascomycetes. ANTIBIÓTICOS Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou que poderiam ter efeito terapêutico. Ø 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de Staphylococcus aureos, matava as bactérias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia inibir outras bactérias. Ø Após a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se então um processo fermentativo comercial para sua produção. Este fato marcou o início da indústria de antibióticos. Ø Seguiu-se então a descoberta de Ø Estreptomicina a partir de espécies de Streptomyces Ø Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium Com o desenvolvimento a partir de 1940 de técnicas de genética microbiana que implicaram em técnicas de mutação e seleção de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da produção de penicilina de poucas mg/L para até 20g/L de cultivo. Iniciam-se também, nesta época, os estudos sobre a produção de metabólitos secundários, pequenas moléculas como os antibióticos que não têm papel importante no crescimento e manutenção das células. TRANSFORMAÇÕES DE ESTERÓIDES O uso de microrganismo, o domínio das técnicas microbiológicas e fermentativas permitiu fazer transformações enzimáticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avanço na produção de fármacos, como os hormônios esteróides. Ø 1940 - descobriu-se que a cortisona, esteróide secretado pela glândula adrenal, aliviava a dor de pacientes com artrite reumática, o que fez desenvolver-se um processo de síntese química para sua produção que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g; Ø 1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona, produzindo 11á-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da síntese de cortisona caísse para 11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g. Ø 1980 - Introduziram-se modificações no processo e os custos foram diminuindo gradativamente de forma que hoje estes custos estão próximos de U$ 0,46/g. Técnicas semelhantes de biotransformação microbiana permitiram a síntese de outros esteróides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros fármacos importantes na medicina. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 8 ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO 1) Formulação do meio de cultura a ser usado no processo; 2) Esterilização do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares; 3) Produção de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador; 4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condições ótimas para a formação do produto 5) Extração do produto e sua purificação; 6) Disposição dos efluentes produzidos no processo. ÁREAS DE APLICAÇÃO DA FERMENTACÃO INDUSTRIAL A) ALIMENTOS v Massas fermentadas (pão, panetone); v Carnes fermentadas (salame, lingüiça); v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...); v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...); v Leite fermentado (iogurte, queijo ...); v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...); v Condimentos (vinagre, glutamato...) v Aminoácidos (lisina, ácido glutâmico); v Polissacarídeos (dextrano) B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS v Álcool (industrial e carburante); v Antibióticos de uso veterinário; v Biogás; v Hormônios de crescimento vegetal. C) MEDICAMENTOS v Antibióticos; v Vacinas; v Vitaminas; v Hormônios de consumo humano (insulina); v Aminoácidos. D) ÁCIDOS ORGÂNICOS E SOLVENTES v Ácido cítrico; v Ácido acético; v Etanol; v Propanol; v Butanol; v Ácido láctico. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 9 INTER-RELAÇÕES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS As relações existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos são muito importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reações químicas especificas. As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimática pode convenientemente ser manipulada em bio-reatores apropriados. Por outro lado as células microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte sólido, atuam como catalizadores que levam a reações químicas concretas, da mesma maneira que as enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo. Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentações se refere ao cultivo de microrganismos em grande escala. A seleção e aplicação dos princípios da engenharia genética aplicada a microrganismos apropriados permitem manipular o conteúdo enzimático destes em determinadas condições. Também o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocará a indução da enzima necessária para a degradação desse substrato de crescimento dentro da célula. Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzirá a biossíntese da enzima maltase, (uma á - glucosidase) que degrada maltose a glicose, que é necessária para a produção de energia química em forma de ATP dentro da levedura. MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL Introdução – Os produtos comercialmente importantes das fermentações industriais são de 4 categorias: células microbianas, moléculas grandes como enzimas e polissacarídeos, produtos básicos e metabólitossecundários que não são necessários para o crescimento celular. A produção comercial dos produtos de fermentação tem utilizado principalmente diversas espécies de bactérias, leveduras e fungos, ainda que os avanços recentes no desenvolvimento de técnicas de cultivos têm permitido utilizar células mais complexas nos processos de fermentação. Microrganismos Industriais – Na natureza existem duas classes principais de células, ambas utilizadas nos processo de fermentação industrial: procariontes - células bacterianas; eucariontes -leveduras, fungos, células animais e vegetais. Os microrganismos também se diferenciam em função de suas exigências de oxigênio, podendo dividir-se em estritamente aeróbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presença de O2 e os estritamente anaeróbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausência de O2 e os microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situação de aerobiose e anaerobiose. As bactérias utilizadas nos processos fermentativos são principalmente quimiorganotróficos, isto é, podem obter sua energia e seu carbono por oxidação dos compostos orgânicos. As bactérias podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em função de suas resposta a coloração de Gram. A reprodução se dá por divisão assexuada. Os esporos são produzidos usualmente em resposta Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 10 as condições adversas do meio, porque são mais resistentes ao calor e aos compostos tóxicos que as células vegetativas e posteriormente germinam em condições apropriadas. As bactérias são desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintéticos Os fungos (bolores) também são quimiorganotróficos e os mais importantes utilizados nas fermentações se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos gêneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gêneros Thicotherma, Aspergillus, Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos são desprovidos de clorofila ou outros pigmentos fotossintéticos. Sua reprodução pode ser assexuada (esporulação) ou sexuada. As leveduras são fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada (por gemação ou divisão binária) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos industriais é a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produção de álcool e nas panificações. Esta levedura não degrada a lactose, por isso para produzir álcool e biomassa a partir de soro de leite é utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessárias para degradar lactose. Outras leveduras importantes são: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger Os vírus não têm estrutura celular alguma, possui o material genético (DNA ou RNA) contido por uma camada de proteína. Não possuem atividade metabólica e, portanto, não sintetizam protoplasma nem crescem. Em conseqüência disto sua multiplicação não pode ser feita por um processo de divisão, como nos microrganismos celulares. Novos vírus são “produzidos” pelas células nas quais penetram, de acordo com as informações contidas no seu ácido nucléico. São agentes submicroscópicos que infecta as plantas, animais e bactérias. Os vírus bacterianos (bacteriófagos) infectam os processos de fermentação de cepas microbianas e causa sérios problemas, particularmente nos cultivos “starter” utilizados no processamento de alimentos. Células animais e células vegetais também podem ser utilizadas nos processos fermentativos industriais, principalmente para a produção de antibióticos e hormônios vegetais. Necessitam de um meio muito nutritivo e são sensíveis a flutuações de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2 dissolvidos. FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos são as mesmas de todos os seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fonte de material plástico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos: a) os vegetais são fotossintéticos (obtém energia da luz solar) e autotróficos, se nutrem exclusivamente de substâncias inorgânicas; b) os animais são quimiotróficos, pois obtém energia as custas de reações químicas e heterotróficos, por exigirem fontes orgânicas de carbono. Entre os microrganismos há uma grande variedade de tipos intermediários. FONTES DE ENERGIA a) Algumas bactérias realizam fotossíntese, porém não produzem oxigênio. Podem utilizar fontes inorgânicas (liotróficas) ou compostos orgânicos (organotróficas) como doadores de elétrons. b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactérias são quimiossintéticas, obtendo energia as Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 11 custas de reações químicas, nas quais substratos adequados são oxidados com desprendimento de energia. Estes substratos podem ser inorgânicos (litotróficos) ou orgânicos (organotróficos). No primeiro grupo encontramos apenas bactérias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de oxidar enxofre, produzindo ácido sulfúrico, podem ser utilizados na lixiviação de metais, como cobre e urânio. A grande maioria das bactérias e a totalidade de fungos, leveduras e, também, os protozoários são quimiorganotróficos. FONTES DE MATERIAL PLÁSTICO MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE CARBONO Para os autotróficos a única fonte de carbono necessária é o CO2. Para os heterotróficos, há necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintéticas: · Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), Óleos, Metanol, Etanol; · Melaço de cana-de-açúcar – Composição variável (rico em aminoácidos, vitaminas, minerais, vários açúcares); corrigir deficiências (N, P, S); · Extrato de Malte –cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminoácidos. MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE NITROGÊNIO Quanto às necessidades de nitrogênio há três categorias principais de microrganismos: Alguns microrganismos, especialmente bactérias, retiram o nitrogênio diretamente da atmosfera e o converte em nitrogênio orgânico. Muitos fungos e quase totalidade das bactérias utilizam compostos inorgânicos de nitrogênio, como amônio e nitratos. Algumas bactérias exigem fontes orgânicas de nitrogênio. De um modo geral, adicionar aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece o crescimento da maioria dos heterotróficos. o Sais de Amônio, Sais (nitratos); Uréia o Líquido da maceração do milho (± 4% N); o Extrato de levedura e Peptonas (laboratório) o Ar atmosférico ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS Além de nitrogênio, os microrganismos exigem uma série de outros elementos, sob a forma de compostos inorgânicos, alguns em quantidade bem maiores que outros. o Macronutrientes – P, S, K, Mg, Ca, Fe o Micronutrientes – Cu, Zn, Co, B, ... FATORES DE CRESCIMENTO São os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microorganismo, que ele não consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminoácidos, nucleotídios, ácidos graxos, entre outros. Aspecto importante dessa exigência resulta do fato que, quando um microrganismo exige um determinado fator, seu crescimento será limitado pela quantidade desse fator presente no meio. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 12 Dentro de certos limites, o crescimento será proporcional ao teor do composto limitante. Isso permite a elaboração de um método de dosagem de certos compostos, baseados na medida do crescimento microbiano.Essa é a base da dosagem microbiana de uma série de substâncias, principalmente aminoácidos e vitaminas. AGUA A água não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento dos microrganismos. Seu papel é múltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substâncias em solução através da membrana citoplasmática. Exerce função na regulação da pressão osmótica e regulação térmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação, a não ser quando esta é precedida pelo congelamento brusco (liofilização) OXIGÊNIO ATMOSFÉRICO Como a água o oxigênio não é um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrogênio nos processos de respiração aeróbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presença de O2 livre: Aeróbios – exigem oxigênio livre; alguns, porém, em pequenas quantidades não tolerando as pressões normais de O2 atmosférico; Anaeróbios – não toleram a presença de O2 livre; Facultativos – crescem na presença ou ausência de O2. Entre as bactérias encontra-se os três tipos de comportamento. Os fungos (bolores) são estritamente aeróbios, enquanto as leveduras são aeróbias ou facultativas. CLASSIFICAÇÃO DOS MOSTOS SINTÉTICO: composição conhecida quantitativamente e qualitativamente é usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentação. O objetivo é saber a rota de fermentação, saber quanto e quando e quais os substratos que estão sendo utilizados pelos Microorganismos. Tem um alto custo. COMPLEXO: composição não é bem definida, estão enquadrados os meios naturais tais como: caldo de cana, melaço, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais. CARACTERISTICAS DO MOSTO Requerimentos básicos: 1) Proporcionar o máximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado; 2) Produzir a máxima concentração de biomassa ou produto; 3) Permitir o máximo rendimento na formação do produto; 4) Produzir o mínimo de subprodutos indesejáveis; 5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponível durante o ano todo 6) Não sofrer degradação durante a esterilização 7) Não deverá causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente: aeração, agitação, extração, purificação e tratamentos dos efluentes. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 13 SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA a) Açucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescíveis (contém monossacarídeos: Ex.: glicose, frutose, suco de uva, maçã, pêra, etc.). Principal substrato é um monossacarídeo (glicose) e este é metabolizado diretamente até piruvato. As matérias-primas indiretamente fermentescíveis são aquelas que contém dissacarídeos, predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-açúcar e melaço. A composição do melaço de cana-de-açúcar varia em função de fatores como: · qualidade da matéria-prima (variedade, idade, sanidade, maturação, queimada ou não, etc); · métodos de extração do açúcar (moagem, clarificação, cozimento, etc); · condições técnicas das regiões açucareiras; · condições e tempo de armazenamento. b) Amiláceas: contêm em sua composição polissacarídeos (amido) utilizada para produção de vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificação). PREPARO DA MATÉRIA-PRIMA a) Melaço: deve sofrer uma preparação prévia (de 82 ºBrix 18 -20 ºBrix) CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluição do melaço. B M - b = Quantidade de melaço em peso d = volume litros) M b B - M = Quantidade de água em peso d = volume (litros) B = Brix do melaço b = Brix da água (zero) M = Brix desejado (18 –20º) d = densidade Ex.: melaço: 80 ºBrix Água; 0 ºBrix M = 20 ºBrix dmelaço = 1,6284 dágua = 1,0000 80 20 – 0 = 20 Kg melaço = 12,31 Litros 1,6284 20 0 80 – 20 = 60 kg de água = 60 litros 1,0000 Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 14 No tanque de diluição controla-se: pH: entre 4,5 – 5,5 Nutrientes: Sulfato de amônio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimático} b) Caldo de cana-de-açúcar: não necessita diluição pois a cana sofre adição de água por aspersão na moenda para extração do açúcar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20 D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2O a ser adicionada Brix desejado Ex.: Brix do caldo = 20 Volume = 50.000 L Brix desejado = 16º D = 20 x 50.000 – 50.000 = 12.500 L de H2O a ser adicionada para ter 16º Brix 16 Após fazer a diluição corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando ácido sulfúrico, cítrico ou ainda suco de limão (caseiro) e colocam-se os nutrientes. DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA 1) Preparo do mosto: a) Determinação de sólidos solúveis por refratometria - Para cada grau acima de 20 ºC subtrai-se 0,06 por grau; - Para cada grau abaixo de 20 ºC soma-se 0,06 por grau: Ex.: 20 ºBrix a 25ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix – 0,3 = 19,7 ºBrix 20 ºBrix a 15ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix + 0,3 = 20,3 ºBrix Um mosto inicialmente com 76 ºBrix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST. 100 g melaço -------- 76 g SST X g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de água RELACÃO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA. 1 ºBrix corresponde a 0,54 ºBaumé 1 ºBaumé corresponde a 1,8 ºBrix 1 ºBrix corresponde a 0,85 ºBabo BRIX = % de sólidos solúveis existentes em uma solução de sacarose quimicamente pura. Fermentadores Prof. Raul Vicenzi 15 ELEMENTOS DE UM FERMENTÁDOR (BIOREATOR) O coração de qualquer processo fermentativo é sem dúvida o fermentador. Uma definição funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantém um ambiente favorável para que se desenvolva um determinado processo biológico. A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de aço inoxidável brilhante e com uma instrumentação muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais são assim, outros importantes processos biológicos industriais, desenvolvidos em grande escala, são conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados. Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto, embora para processos cujas condições são muito sensíveis será necessário um sistema fechado e muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorável. MEIO AMBIENTE As condições ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob três aspectos diferentes: condições biológicas, químicas e físicas. MEIO BIOLÓGICO Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questão encontram-se presentes, enquanto que os não produtivos, destrutivos ou não desejáveis estejam excluídos do processo. Do ponto de vista de produção é importante também que os microrganismos desejados estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentável. Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema asséptico. A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos vivos, diz-se então esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir o microrganismo desejado denomina-se inoculação. MEIO QUÍMICO Implica na composição do meiode crescimento microbiano, que deverá conter as concentrações adequadas de substratos ou nutrientes microbiológicos, assim como dos precursores sintéticos, livres de substâncias inibidoras e mantidas a um pH adequado. MEIO FÍSICO Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle é muito importante quando se projeta um fermentador. Este parâmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condições ao longo da fermentação, exigem um bom sistema de agitação, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos organismos e de seus agregados. Quando se mantém um ambiente favorável os parâmetros ambientais não têm que necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo. Fermentadores Prof. Raul Vicenzi 16 Fermentação por batelada - características: v Diferentes fases de crescimento; v Diferentes condições ótimas; v Fermentação parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes; v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apareçam de acordo com estas trocas as sucessivas fases de crescimento PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos: v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos estão imersos no meio de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes líquidos. O fermentador mais simples consiste em um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio líquido. Estes fermentadores forma utilizados de geração em geração com muito êxito na indústria cervejeira já que ao formar-se na fase anaeróbica da fermentação, uma capa de espuma que contém CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura durante a fermentação se pode colocar tubos refrigerantes. São muito utilizados no tratamento biológico de águas residuais em fluxo lento, onde a superfície do líquido permite que se dissolva o O2 do ar e libere o CO2. Estes efeitos podem ser acelerados com a agitação do líquido que aumenta a transferência de gases e mantém a homogeneidade. Nos sistemas anaeróbios os próprios gases da fermentação podem proporcionar a agitação, através do desenho do fermentador (cônico/cerveja) ou por meio mecânico (bombas de recirculação). v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se desenvolve sob forma de uma lâmina ou capa disposta sobre uma superfície que está em contato com o meio nutritivo. Em laboratórios se utiliza o “cultivo em superfície” (placas). Inicialmente a produção de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente se utilizada o cultivo em superfície na fermentação do ácido cítrico (Aspergillus niger), que se cultiva em uma superfície com um meio adequado contendo melaço em bandejas de pouca profundidade, colocadas em estantes à temperatura constante e com circulação de ar freqüente. Também e pode desenvolver películas microbianas sobre uma superfície de meio sólida adequada. Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plástico particulado, lâminas de plástico onduladas, através dos quais se faz passar o meio líquido sobre a capa de microbiana da superfície. v Na prática, porém, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso também aparece uma capa sobre a superfície do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos dispersos no meio de cultivo. Fermentadores Prof. Raul Vicenzi 17 Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de recuperação do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo: Esterilizador Refrigeração Com ou sem ruptura celular Formulação Armazena,mento de Matérias-primas Inóculo Volume: 1 a 2 litros Preparação de Meios Fermentador de produção Tanque de Semeadura (pé-de-cuba) Separação de células Etapas de Recuperação do Produto Envasamento e Armazenamento PRODUTO Tratamento de Efluentes Utilização de Subprodutos - água - ar - vapor Água do Processo Ar Estéril Vapor Energia Inóculo Preparado 1:10 Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 18 ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR Introdução A esterilização implica a destruição, inativação ou remoção de toda forma de vida microbiana. Isso quer dizer que a esterilização provoca nos microrganismos uma perda irreversivel da capacidade de reprodução no ambiente considerado. Não implica, entretanto, a inativação total das enzimas celulares, toxinas, etc. Antes de entrarmos na discussão dos métodos, é conveniente fazermos algumas considerações em torno dos mecanismos de esterilização e das características das populações microbianas. O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilização empregado. O efeito final, entretanto, é o mesmo. Deve ocorrer a destruição e/ou inativação da(s) enzimaas) envolvida(s) em processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante bloqueie uma reação enzimática essencial ou destrua uma molécula vital. Na prática, entretanto, agentes com ação tão especifica não encontram aplicação como esterilizantes, por vários motivos: A heterogeneidade da população microbiana; a possibilidade da existência de microrganismos com capacidade de utilizar outras “rotas metabólicas” para vencer o bloqueio estabelecido; a dificuldade do agente em atingir um alvo muito específico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam a utilização de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecífico. Principalmente no caso da esterilização de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos capazes de danificar generalizadamente a célula, em vez de se procurar um ponto específico de sua estrutura metabólica. Outra consideração importante, no caso da esterilização de equipamentos, é a cessação do efeito esterilizante no final do processo de esterilização. Em outras palavras, o agente ou condição esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilização. Terminada a esterilização, não deve haver ação residual. No caso de fermentação industrial, por exemplo, uma possível ação residual pode ser tão ou mais prejudicial que a presença de certos contaminantes. Essas considerações ajudam a apontar os processos físicos como os métodos de escolha na esterilização de equipamentos. MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO Físicos Químicos Calor: - Seco: Flambagem ; ar quente - Úmido: vapor fluente, vapor sob pressão; tindalização. Radiação: - Ultravioleta - Ionizantes (RX e ã) Filtração : Membranas Líquidos, Gases e vapores Esterilizantes gasosos: Óxido de etileno (mais eficiente que os demais; utilizado em câmaras de esterilização) Formaldeído – mais comum â-propiolactona- carcinogência Ácido peracético Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 19 A escolha do método depende das características dos produtos a serem esterilizado e do custo do processo. Quando se usa agentes químicos: tempo de contato Quando se usa calor: tempo e a temperatura de contato OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto MECANISMOS DE ESTERILIZACÃO Se bem que os métodos usuais de esterilização tenham uma ação generalizada sobre a célula, o mecanismo pelo qual isso é conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do calor, sabe-se, desde os tempos deKoch, que o mecanismo de destruição dos microrganismos pelo calor seco não é o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor. Exceto em casos em que haja uma destruição física do microrganismo, como é o caso da flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilização não está bem elucidado. Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolização da célula são aparentes e poderiam ser interpretadas como oriundas da atuação de forças osmóticas. A adsorção de corantes pelas células, a incapacidade de reprodução e, no caso de microrganismos móveis e a perda da motilidade, são características que auxiliam na constatação da perda de viabilidade de células individuais. Enquanto que a inativação pelo calor seco é, essencialmente, um processo oxidativo, o uso de vapor causa uma coagulação das proteínas celulares com prejuízo para a organização estrutural do microrganismo, afetando a sua competência fisiológica. TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessário para destruir esporos bacterianos de fermentação simples em meio com concentração inicial de 1,6 x 105 esporos/mL TEMPERATURA (ºC) TEMPO (minutos) 100 1200 105 600 110 190 115 7 120 19 125 7 130 3 135 1 Tempo de esterilização corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela temperatura específica e não ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de aquecimento e resfriamento. DESNATURAÇÃO DE PROTEÍNAS Além das estruturas primária, secundária e terciária, as moléculas de proteína podem ser constituídas por mais de uma cadeia de polipeptídios. A conformação estrutural da molécula protéica Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 20 é estabilizada por ligações covalentes e não-covalentes. Essas ligações reduzem a flexibilidade das cadeias polipeptídicas, garantindo sua disposição de uma forma ordenada, compacta e, conseqüentemente, de baixa entropia, em vez de uma associação ao acaso. Entre as ligações covalentes, o tipo de ocorrência mais geral é a ligação dissulfeto As ligações não-covalentes podem ser pontes de hidrogênio, ligações hidrofóbicas e iônicas. As ligações hidrofóbicas são as que mais contribuem para a estabilização da estrutura protéica, pois de um modo geral, 40% dos resíduos de aminoácidos de uma proteína possuem ramificações não-polares. Uma alteração estrutural da molécula de proteína é, normalmente, acompanhada de uma perda de atividade biológica, pois a ação de enzimas pode ser explicada por uma perturbação conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima. Considerando-se que as células de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60% de seu peso seco em proteínas, e considerando-se, ainda, as funções metabólicas e/ou estruturais desempenhadas por essas proteínas na célula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeito que agentes ou condições capazes de desorganizar estruturalmente as proteínas poderão exercer sobre a célula. ALTERAÇÃO DNA Se, de um lado, agentes que atuam sobre as proteínas são capazes de comprometer diretamente a competência fisiológica, agentes capazes de causar alterações no material genético do microrganismo podem provocar o aparecimento de mutações letais. Donde a possibilidade de se utilizarem, na esterilização, substâncias ou condições que apresentem maior afinidade pelo ácido desoxirribonucléico (DNA). - Agentes químicos como propionolactona, ácido nitroso, etc., agem sobre o material genético das células, causando alterações que terão conseqüências sobre as características fisiológicas do microrganismo. - Radiações – Fazendo-se incidir uma radiação sobre microrganismos, os componentes celulares poderão absorver energia radiante. O efeito letal das radiações é uma demonstração da presença, na célula viva, de moléculas capazes de absorvera energia radiante. Proteínas e ácidos nucléicos, constituintes essenciais da matéria viva possuem estruturas que absorvem principalmente luz ultravioleta. As alterações fotoquímicas que ocorrem, em virtude da absorção de luz ultravioleta, são muito prejudiciais ás células. POPULAÇÃO MICROBIANA Ao tratar de esterilização, temos de levar em conta, também, as características dos microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamento apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio que não as abrigue e proteja da ação do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos estar certos de que o agente esterilizante será capaz de atuar sobre as células microbianas em condições favoráveis e por tempo suficiente, então o problema de esterilização será relativamente simples. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 21 FIGURA 1 - Esterilização de um meio de cultura em autoclave a 121 ºC por 20 minutos. O tempo total de esterilização é 100 minutos. ESTERILIZAÇÃO POR AGENTES FÍSICOS CALOR SECO Ø calor seco mata os microrganismos por oxidação dos componentes celulares. O ar seco não é um bom condutor de calor e sua ação não é tão enérgica quanto a do vapor. Por esse motivo é necessário uma temperatura e tempo maiores de esterilização. Ø o emprego do calor seco ou ar quente, é recomendado quando o contato direto ou completo do vapor sobre pressão com o material é indesejável ou improvável, que é o caso de vidraria, óleos, pós e substâncias similares. A esterilização pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma temperatura tal que, durante o período de aquecimento, haja inativação dos microrganismos presentes. A maior resistência demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um endurecimento da camada mais externa da célula por meio de coagulação das protemas, dificultando a penetração do calor no interior da célula propriamente dita e ulterior coagulação das proteínas plasmáticas. Devido à muito menor capacidade de penetração do calor seco, é necessário aquecer o equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais prolongado, o que torna esse método inadequado quando materiais como papel, algodão, plásticos, etc., estão presentes. Populações homogêneas de esporos apresentam uma relação linear de inativação com relação ao tempo de exposição a 125 ºC. A não-linearidade que ocorre com populações naturais, pode ser atribuída a uma heterogeneidade da população. As relações não-lineares obtidas com populações naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com resistências térmicas diferentes, isolados daquelas mesmas populações. Aliás, essa heterogeneidade das populações Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 22 naturais pode ser devida não só à presença de esporos de espécies diferentes como também a diferentes graus de resistência térmica entre esporos de uma mesma espécie. A temperatura empregada tem sido 125 ºC e é comum cotar-se a resistência térmica de um microrganismo em relação ao D125. A desorganização molecular que ocorre nas células, devido à exposição a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos: a) ativação direta das moléculas pela energia térmica, com alteração conformacional por quebra de ligações intramoleculares e intervenção subseqüente de outras moléculas; b) reação de moléculas complexas com oxigênio, água ou vapor de água (no caso de esterilização pelo calor úmido). A exigência básica da esterilização pelo calor seco é que todo o material seja sujeito à temperatura esterilizante. As únicas causas possíveis de fracasso na esterilização são o controle defeituosoda temperatura; a não penetração do calor; e a presença de microrganismos com resistência térmica superior á esperada. CALOR ÚMIDO Ø calor úmido mata os microrganismos por desnaturação protéica, ou seja: pela coagulação das proteínas e enzimas celulares, e também a fusão dos lipídeos da membrana celular; Ø quanto maior a temperatura menor o tempo necessário; Ø Para destruir esporos temos que submeter este vapor de água a uma pressão positiva para alcançarmos as temperaturas de trabalho; Sempre que possível usa-se vapor para a esterilização, pelo seu alto conteúdo de calor por unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e controlável; por ser de fácil produção e distribuição; e porque, mesmo sendo de aquecimento rápido, a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser controladas. TABELA 2 - Relação entre a pressão de vapor de água em diferentes pressões Pressão de vapor da água (atm) Temperatura 0 100,0 0,34 109,0 0,68 115,0 1,00 121,0 1,36 126,5 Obs.: - Para assegurar a temperatura pela pressão de trabalho precisamos ter certeza de que todo o ar foi expulso, primeiro porque o ar não é bom condutor de calor, logo o calor não penetra no material a ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma pressão é inferior a temperatura do vapor aquecido a mesma pressão. Causas da inativação térmica de bactérias pelo calor úmido Os mecanismos propostos para explicar a influência letal do calor úmido sobre as bactérias são: (a) coagulação de proteínas; (b) inativação de enzimas; (c) desorganização dos lipídeos celulares; (d) desorganização do aparelho genético; (e) ruptura do RNA. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 23 A morte das células expostas ao calor é exponencial. A base bioquímica desse fenômeno é difícil de ser explicada em termos de acontecimentos específicos na célula. O calor úmido age sobre vários componentes celulares e, na célula, pode-se observar uma série de efeitos. Inativação térmica dos esporos Os esporos são dotados de uma camada interna de mucopeptídeo recoberta por uma capa protéica rica em cisteína. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistência dos esporos: impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratação do material protéico, com estabilização conseqüente da maior interaproximação dos radicais hidrofóbicos e imobilização iônica. A inativação dos esporos em presença de vapor de água deve-se à atividade da água e não propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de temperatura, característicos da inativação térmica de esporos. só podem ser devidos a processos de coagulação de proteínas ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR RADIAÇÕES UV E IONIZANTES Os princípios básicos da utilização da radiação UV são a redução de microrganismos presentes no ar e a destruição de células depositadas na superfície do equipamento e expostas à radiação. A radiação UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os níveis de contaminação. A ação de radiações ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um uma inibição do poder de multiplicação dos mesmos. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUÍMICOS Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50ºC. Os fatores que influenciam na eficiência da esterilização são: tempo de contato, temperatura, pH, matéria orgânica, estabilidade ao oxigênio umidade, etc. detergentes, líquidos (ácidos e álcalis, glutaraldeído, formaldeído, iodófors, ácido peracético) Gases e vapores (ozônio, brometo de metila, formaldeído, â-propionolactona, óxido de etileno, ácido peracético) ESTERILIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA De acordo com um conceito bem amplo, a esterilização de um meio é a operação que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscópicas, saprófita ou não, existentes no meio considerado. O grau de esterilização dos meios de fermentação varia conforme o processo a que se destina. Algumas vezes é totalmente dispensável (fermentação láctica de hortaliças e polvilho; tratamento biológicos de resíduos); realizada de forma incipiente (fermentação alcoólica; produção de leveduras para panificação; fermentação acética do vinagre); realizada com alto grau de exigência (produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre é necessário (devido ao uso de culturas puras) · Em plantas industriais o calor úmido é a principal forma de se efetuar a esterilização. Pode Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 24 ser feita nos próprios recipientes destinados a fermentação (processo descontínuo) ou em separado (processo contínuo) Ø ESTERILIZAÇÃO EM BATELADA: · Vários meios de cultura são esterilizados no fermentador a 121 ºC (para destruir esporos), o tempo é calculado em função dos constituintes do mosto(pH, material em suspensão, etc) e do tamanho do fermentador. · Esterilizar ás válvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o fermentador · Método indireto - injetar vapor no fermentador através de camisa ou da serpentina; · Método direto - injetar vapor direto na solução nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditivos químicos OBS.: O vapor gerado pela indústria normalmente contém substâncias potencialmente tóxicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de geração de vapor. Com injeção direta de vapor no meio de cultura o volume deste aumentará, pois uma parte do vapor se condensa aumentando o volume do líquido dentro do fermentados. Vantagem a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente, evitando perigos de contaminações; Desvantagem a) Manutenção de temperaturas altas por períodos longos, favorecendo possíveis alterações no meio; b) Consumo elevado de vapor e água de resfriamento; c) Problemas de corrosão pelo contato do equipamento com o meio aquecido. d) Elevado tempo ocioso do equipamento; e) interações químicas com nutrientes Ø ESTERILIZAÇÃO CONTINUA · As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas pela esterilização contínua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operação; Fornece meio esterilizados para fermentadores de vários tamanhos · Etapa preliminar obrigatória nos processos fermentativos contínuos, também tem valor nos processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilização e a área física necessária para o processo, devido a relação exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor o tempo necessário para a destruição de todos os microrganismos quando temperaturas maiores são utilizadas; · Na esterilização em batelada são necessários 30 a 60 minutos a 121 ºC, a esterilização contínua normalmente é realizada em 30 a 120 segundos a 140 ºC; · Meio de cultura torna-se diluído pois a condensação do vapor aumenta o volume do líquido, para resolver este problema o meio aquecido é bombeado através de uma válvula de expansão e o condensado é removido por uma bomba de vácuo até que o meio de cultura fique com a mesma concentração de antes da esterilização. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 25 · Pode se feita pela injeção direta de vapor ou por meio de trocadores de calor. · Em certos casos a pasteurização já pé suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana. É uma operação rápida utilizando temperaturas próximas de 100 ºC seguida de resfriamento.Em meio ácidos equivale a uma esterilização · Para pequenas quantidade de meio pode-se lançar mão da tindalização. FIGURA 2 - Esquema de esterilização contínua do meio de cultura em trocadores de calor DESTRUIÇÃO DE NUTRIENTES A esterilização do meio pelo calor acarreta alterações na sua composição química. A experiência mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilização de um dado meio, menor será a destruição de nutrientes e, conseqüentemente, melhores serão os resultados da fermentação posterior. Esta menor destruição de nutrientes é uma conseqüência de fato – observada experimentalmente – de ser a energia de ativação de destruição térmica dos microrganismos maior do que a de destruição térmica dos nutrientes. Essa afirmativa é de importância prática, tanto na esterilização de meios de fermentação como na esterilização de alimentos. ESTERILIZAÇÃO DO AR As fermentações aeróbias, com o microrganismo em suspensão, constituem os processos fermentativos de maior importância industrial atualmente. Em tais fermentações a quantidade de ar introduzida no sistema é grande e é perfeitamente aceitável, que haja grande preocupação quanto a esterilização do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser tomados principalmente nas horas iniciais da fermentação. - A maior parte dos processos fermentativos é conduzido com agitação vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estéril. - O número de partículas e microrganismos depende da localização da indústria, do movimento do ar e do tratamento prévio que o ar foi submetido. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 26 MÉTODOS PARA ESTERILIZAÇÃO DO AR Calor seco - normalmente antieconômica ou de difícil realização; Radiações – Apenas as radiações UV poderiam ter aplicação prática, porém pouco usada devido ao grande tempo de exposição. Pode ser usada em pequenas instalações (laboratórios, pesquisa). Atua mais como desinfetante. Filtração –É sem dúvida o processo mais importante por ser o de maior aplicação na industria. Filtros feitos de lã de vidro, acetato de celulose, etc Os filtros pode ser de dois tipos principais: Filtros que apresentam poros - retenção mecânica dos microrganismos (cartuchos de membranas de ésteres de celulose, nylon); Filtros de camadas de material fibroso (lã-de-vidro, ) - Atua na combinação de vários efeitos físicos: inércia, bloqueio, difusão, separação por gravidade e atração eletrostática. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 27 CRESCIMENTO CELULAR O crescimento dos microrganismos é uma parte integral de quase todos os processos de fermentação. Sabe-se que as bactérias se reproduzem por divisão binária, produzindo duas células de mesmo tamanho, entretanto a reprodução de muitas leveduras se dá por gemação;os mofos crescem por extensão das hifas e a morfologia de seu micélio pode variar em função do meio ambiente. quando um fungo cresce na superfície de um meio sólido produz uma rede miceliana , cuja natureza reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as células fúngicas podem crescer unidas a partículas de nutrientes suspensas na forma de micélio filamentoso difuso ou como massa densa. A morfologia e crescimento influem na velocidade de crescimento e na formação de produtos Quando um microrganismo é inoculado em um meio de volume e composição conhecidos, o cultivo passa por uma série de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculação, existe uma fase de latência, em que o microrganismo se adapta as condições do meio. Após um certo período de tempo em que a velocidade de crescimento das células aumenta gradualmente, as células crescem a uma velocidade constante máxima ; esta fase se denomina exponencial ou logarítmica. À medida que o crescimento continua, os nutrientes se vão esgotando e os produtos vão sendo excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa, devido freqüentemente ao esgotamento de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto tóxico; esta fase se denomina estacionária. FIGURA 3 – Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontínuo FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTO A velocidade de crescimento varia com o tipo de célula microbiana e também em função das condições físico-químicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a biomassa aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de duplicação médio para as células animais e vegetal são substancialmente maiores que os de mofos e leveduras, que por sua vez são maiores que das bactérias. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 28 O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre 25 e 35 ºC. Dentro deste espaço o crescimento aumenta com o aumento da temperatura até um valor máximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte microbiana. O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimática. A maioria dos microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4. A velocidade de crescimento da célula microbiana depende da atividade de água (Aw) e da umidade relativa. As bactérias necessitam uma Aw �0,95 enquanto os mofos podem crescer em valores de atividade de água menores, de até 0,7 como mínimas. Como em qualquer reação química, a velocidade de crescimento depende da concentração de nutrientes químicos, e pode ser descrita pela equação de Monod. Os valores típicos de Ks para as diversas fontes de carbono estão compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3 . As células podem crescer a velocidades próxima as ìmax quando a fonte de carbono limitante é maior que 10 Ks ou 10 a 100 mg/dm3. As concentrações de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento devido ao efeito osmótico que tem uma influencia maior sobre as bactérias do que sobre os mofos Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento celular, é freqüentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado. Biomassa produzida (g) ãx/s = ------------------------------ ãx/s =coeficiente de rendimento de biomassa Substrato consumido (g) METABOLISMO MICROBIANO O crescimento microbiano depende da capacidade da célula para utilizar os nutrientes de meio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e também os principais compostos de baixo peso molecular, necessário para a atividade celular. O metabolismo intermediário inclui as reações que transformam os compostos de carbono e nitrogênio que entram na célula em novo material celular ou em produtos que são excretados. A síntese desses compostos necessita energia e a maioria das células utilizada nas fermentações, são heterotróficas e obtém sua energia a partir da quebra de compostos orgânicos. Nos processos respiratórios ou aeróbios, os microrganismos são capazes de oxidar completamente alguns dos substratos a CO2 e H2O, obtendo o máximo de energia para a conversão dos substratos remanescentes em nova massa celular. No metabolismo fermentativo ou anaeróbio, as células são menos eficazes para converter os substratos orgânicos em material celular e usualmente excretam intermediários degradados parcialmente. O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estágios. Após a inoculação de uma cultura em um meio nutriente existe um período durante o qual o crescimento parece não ocorrer; este período refere-se à fase lag e pode ser considerado como uma fase de adaptação. Seguindoum período durante o qual a taxa de crescimento das células aumenta gradualmente, as células crescem a uma taxa constante, este período é conhecido como fase exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as células entram fase estacionária. Após um Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 29 longo período de tempo o número de células viáveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou declínio. Tanto quanto esta cinética de crescimento, o comportamento de uma cultura pode ser descrito de acordo com os produtos, os quais são gerados durante os estágios da curva de crescimento. Quando um microrganismo é inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da divisão celular, e portanto a produção de biomassa, varia de acordo com uma seqüência característica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inóculo e otimizando as condições físicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a duração da fermentação contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mínima é aconselhável. FIGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em batelada. Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes essenciais estão em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do metabolismo energético, em calor, ou em compostos requeridos para a reprodução de novas células. Durante a fase exponencial de crescimento a divisão celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a ser máxima e os produtos gerados são essencialmente para o crescimento das células e incluem: aminoácidos, nucleotídeos, proteínas, ácidos nucléicos, lipídios, carboidratos, etc. Estes produtos são conhecidos como os primeiros produtos do metabolismo ou METABOLITOS PRIMÁRIOS e a fase a qual eles são produzidos (fase log ou exponencial) como trofofase. Também se inclui nesta categoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metabólito mais primário. Muitos produtos do metabolismo primário são considerados economicamente importantes e são produzidos por fermentação. Durante a desaceleração e na fase estacionária, algumas culturas microbianas sintetizam compostos os quais não são produzidos durante a trofofase e os quais parecem não ter nenhuma função óbvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como METABÔLITOS SECUNDÁRIOS e a fase na qual eles são produzidos (equivalente à fase estacionária) como idiofase. É importante salientar que os metabólitos secundários ocorrem em cultivos contínuos a Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 30 baixas taxas de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e também, da fase onde não tem crescimento celular. TABELA 3. Produtos do metabolismo primário microbiano e sua significância comercial. Metabolismo Primário Significância Comercial Etanol Ingrediente ativo em bebidas alcoólicas, usado como combustível em motores quando misturado ao petróleo Ácido Cítrico Vários usos na indústria alimentar Ácido glutâmico Intensificador de Flavor Lisina Suplemento alimentar Nucleotídeos Intensificador de Flavor Fenilalanina Precursor do Aspartame - Adoçante Polissacarídeos Aplicação na indústria alimentar Vitaminas Suplementa Alimentar Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995. Os metabólitos secundários são compostos que não são necessários para a biossíntese celular, não tendo um papel direto no metabolismo energético. A biossíntese destes compostos está intimamente ligada com o metabolismo primário das células que os produzem, já que normalmente seus precursores são metabólitos primários ou modificados, como ácidos orgânicos, aminoácidos, derivados de açúcares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado para os metabólitos secundários é “são os compostos não essenciais para o crescimento exponencial” (Wiseman, A.) Os metabólitos secundários mais importantes do ponto de vista comercial são os antibióticos, entre eles a Penicilina, cuja produção anual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalóides representam o resto dos metabólitos secundários de importância industrial. Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que é a idiofase que prevalece sobre a trofofase, a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos. METABOLISMO ENERGÉTICO A energia necessária aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos fototróficos), ou pela oxidação de substâncias químicas (organismos quimiorganotróficos). Nos dois casos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligação química, biologicamente utilizável. Trata-se essencialmente da ligação anidridofosfórica do trifosfato de adenosina (ATP), formada pela fosforilação do difosfato de adenosina (ADP). ORGANISMOS QUIMIORGANOTRÓFICOS A maioria das bactérias, leveduras e mofos são incapazes de efetuar a fotossíntese, utilizam a energia liberada no decorrer das reações químicas de oxidação. São chamadas quimiorganotróficas. As reações de oxidação podem ser efetuadas de vários modos: Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 31 - Perda de elétron: Fe++ Fe+++ + e- + energia - Desidrogenação: R-CH2OH R-CHO + 2H+ + 2e- + energia - Hidratação-desidrogenação: R-CHO + H2O R-COOH + 2H+ 2e- + Energia - Descarboxilação-desidrogenação: R-CO-COOH + H20 R-COOH + CO2 + 2H+ + 2e- + Energia Em todos os casos há perda de elétrons freqüentemente acoplada a uma perda de prótons. Estes elétrons e prótons, após transferência mais ou menos longa, feita por intermédio de uma cadeia de oxiredução, vão reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotróficos tiram sua energia da oxidação de substâncias orgânicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamente encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotróficos. A grande maioria dos microrganismos que intervém na biotecnologia faz parte deste grupo. ACEPTOR FINAL DE ELÉTRONS O sistema de transporte de elétrons é mais ou menos complexo e recorre as enzimas (desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) que são intermediários aceptores de elétrons (e de prótons); trata-se de um seguimento de reações acopladas com oxiredução. No final desta cadeia, elétrons (e prótons) servem para reduzir um aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxigênio molecular, composto mineral oxidado ou composto intermediário do metabolismo. Existe, também, um mecanismo de eliminação de elétrons e prótons próprio de numerosas bactérias anaeróbias, sob a forma de hidrogênio, devido a hidrogenase. Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que há respiração (fala-se às vezes, de via oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o que acarreta a formação de metabólitos, diz-se que há fermentação. A fermentação traz geralmente o nome da(s) substância(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produção for complexa. RESPIRAÇÃO AERÓBIA Existem vários mecanismos de respiração aeróbia. O fato comum entre eles é que o aceptor final de prótons é o oxigênio do ar e não podem intervir senão quando os microrganismos são cultivados em condições de aerobiose. Para cada par de prótons transformados em água, há formação de 3 moléculas de ATP, podendo às vezes haver uma oxidação direta. Esta via leva a formação de peróxido de hidrogênio (H202) que é tóxico para
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