Processamento histológico

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DISCIPLINA DE BIOLOGIA CELULAR E EMBRIOLOGIA 
PROFESSORES: Cristiano Chagas e Erika Freitas 
O processamento histológico 
Para vermos um tecido animal ao microscópio óptico, antes temos que preparar este 
material. A primeira coisa a se ter em mente é que queremos ver o tecido e as células que o 
compõem com a morfologia a mais parecida possível com a do tecido vivo. A segunda é que o 
material deve ser fino o suficiente para que a luz o atravesse ao olharmos este material ao 
microscópio. Por fim, temos que considerar que as células e seus componentes são, na grande 
maioria das vezes, incolores, o que não nos permite diferenciar os componentes do tecido e 
das células. 
Assim, vamos ver como resolvemos estas questões: 
1) Fixação 
Quando retiramos um tecido de um organismo vivo, ele perde o seu suplemento de O2 e 
as células morrem em pouco tempo. Quando elas morrem, sua morfologia se altera 
dramaticamente, porque ocorre autólise, mecanismo no qual as enzimas dos lisossomos da 
própria célula degradam seus componentes. 
Para evitar a total destruição da célula, podemos lançar mão de métodos de fixação. Fixar 
um tecido ou uma célula significa: matar rapidamente, conservando a morfologia. Certas 
substâncias químicas fazem isso. Quando colocamos um tecido em formol, por exemplo, as 
proteínas e enzimas da célula perdem sua atividade. Assim, matamos as células e ao mesmo 
tempo evitamos a autólise, conservando a morfologia da célula e do tecido. 
Várias substâncias podem se usadas como fixadores, como o próprio formol (o mais 
utilizado), que se trata de formaldeído diluído em água a 4%; o etanol, a acetona e algumas 
outras substâncias também podem ser usadas como fixadores. Uma coisa importante a 
respeito da fixação é que ela deve ser feita o mais rápido possível a retirada do tecido do 
organismo vivo. 
2) Etapas do processamento e inclusão em parafina 
Para podermos ver o material ao microscópio, a luz deve atravessá-lo, mas, além disso, se 
tivermos muitas camadas de células, a observação pode ficar muito confusa. O ideal é que se 
tenha um corte de espessura equivalente ao tamanho de uma célula. Como conseguir isso? 
Vamos ao processa mento histológico. A primeira coisa a fazer é retirar toda a água das células 
e do tecido, ou seja, desidratar o material biológico. Fazemos isso banhando o tecido em 
concentrações crescentes de etanol (de 70 a 100%). A água se dissolve nele e, assim, e o álcool 
substitui a água. O segundo passo é retirar o álcool. Para isso usamos um hidrocarboneto 
chamado xilol ou xileno. Banhamos o material a ser analisado nesta substância que irá 
dissolver o etanol e substituí-lo, impregnando as células e todo o tecido, processo chamado de 
diafanização. Depois impregnamos o material com parafina. Como o xilol, a parafina também 
é um hidrocarboneto apolar. Os banhos com álcool e xilol servem para possibilitar a 
 
 
impregnação com parafina. A parafina não se mistura com a água, portanto, retiramos a água; 
mas a parafina não se mistura bem com o álcool também e usamos o xilol para retirar o álcool 
e serve como excelente solvente para a parafina. A parafina é utilizada a cerca de 62ºC, o que 
a deixa líquida. Assim ela impregna o material biológico. 
Após isso fazemos a inclusão do material em parafina. Mergulhamos o material em 
parafina, usando uma pequena forma. Depois deixamos a parafina endurecer e temos um 
bloco de parafina dentro do qual o material biológico está. 
Usamos um aparelho chamado micrótomo para cortar o material no bloco de parafina. 
Fazemos fatias muito finas, entre 3 e 10 micrômetros , para termos uma única camada de 
células no corte. Colocamos este corte em uma lâmina de vidro e fazemos a coloração de 
nosso interesse. 
A seguir, temos um protocolo básico de processamento histológico. Pode haver variações 
pequenas, a depender do tipo de material e da rotina do laboratório. 
Protocolo: 
- Retirar o material biológico do organismo e colocá-lo imediatamente em formalina a 10%, 
assegurando-se de que o volume do fixador seja de cerca de 20 vezes o volume do espécime. 
Deixar cerca de 24 horas. 
- Retirar o material da formalina e colocar em etanol 80%, deixando imerso por 1 hora. 
- Fazer mais três banhos, de 1 hora cada, em etanol absoluto. 
- Fazer três banhos em xilol, de 30 minutos cada. 
- Fazer dois banhos de parafina a 62ºC, de 30 minutos cada. 
- Incluir o material em parafina e deixar a parafina à temperatura ambiente para que 
endureça. 
- Fazer o corte histológico. 
Atividade: 
Pesquise imagens referentes ao bloco de parafina e inclusão, micrótomo e corte histológico. 
Cole estas imagens nesta página. 
 
 
 
3) Coloração 
A grande maioria dos tecidos é quase incolor, o que dificulta seu estudo pela microscopia 
óptica. Para isso, existem dezenas de corantes que são usados de acordo com o que se 
pretende visualizar no tecido. 
Os grupamentos ou radicais químicos responsáveis pela cor na maioria dos corantes 
recebem o nome genérico de cromóforos. 
A hematoxilina e a eosina (HE) são os corantes mais comumente usados em histologia. 
A eosina é um corante ácido e a hematoxilina, embora não seja um corante básico, tem 
propriedades muito semelhantes às dos corantes básicos. Sabe-se que os corantes ácidos ou 
básicos se ligam por interação eletrostática aos radicais iônicos de sinais opostos presentes 
nos tecidos, corando-os. 
Então, vamos definir o que são corantes básicos e corantes ácidos: 
• Corantes Básicos: apresentam um grupamento catiônico (com carga positiva) 
que reage com grupos aniônicos dos componentes do tecido, isto é, grupos 
fosfato dos ácidos nucléicos (DNA e RNA), os grupos sulfato das 
glicosaminoglicanas e os aminoácidos ácidos (aspártico e glutânicos) das 
proteínas. Exemplos: verde de metila, azul de metileno e azul de toluidina. 
• Corantes Ácidos: apresentam um grupamento aniônico (com carga negativa) 
que reage com grupos catiônicos dos componentes teciduais, quais sejam, 
proteínas com predominância de aminoácidos básicos (lisina, arginina e 
histidina). Exemplos: eosina, fucsina ácida, azul de anilina e alaranjado 
(Orange) G. 
 
Embora a ligação eletrostática seja o principal fator da ligação primária do corante ao 
tecido, não é o único e por isso os corantes ácidos podem ser usados em combinações em 
certas colorações para corar diferentes constituintes do tecido, de forma seletiva. Por 
exemplo, na coloração tricrômico de Mallory são utilizados o azul de anilina para corar 
colágeno, fucsina ácida para o citoplasma e alaranjado G para observação de hemácias. A 
coloração seletiva dos componentes teciduais por corantes ácidos não é devida às 
propriedades específicas do corante ou do tecido, mas aos fatores relativos, como tamanho e 
grau de agregação por parte do corante e permeabilidade e grau de “compactação” por parte 
do tecido. 
Os corantes básicos também podem ser empregados em combinações, mas estas não 
são usadas como as combinações ácidas, já que esses corantes costumam dissociar-se do 
tecido durante as lavagens subsequentes em soluções aquosas. Diferentemente dos 
verdadeiros corantes básicos, a hematoxilina é usada em combinações de coloração como 
mordente já que quando em água, ela não se dissocia do tecido, ficando firmemente aderida. 
 
 
Qualquer componente do tecido que reaja com um corante básico é chamado basófilo 
e diz-se que ele demonstra basofilia. Os componentes do tecido que se coram com corantes 
básicos são a heterocromatina e os nucléolos do núcleo, alguns componentes citoplasmáticos 
como o ergastoplasma e alguns materiais extracelulares, como a matriz da cartilagem. 
Os componentes teciduais que se coram com corantes ácidos são chamados acidófilos 
e diz-se que exibem acidofilia. A maioria dos filamentos citoplasmáticos são estruturas 
acidófilas. 
Alguns corantes ao reagir com um determinado componente do tecido muda de cor 
num fenômeno denominadometacromasia. Esse fenômeno é interpretado como reflexo da 
presença de numerosas cargas aniônicas próximas no tecido, condição que prevalece na 
substância fundamental da cartilagem e nos grânulos dos mastócitos. Exemplo de corante: o 
azul de toluidina. 
A grande maioria dos corantes são diluídos em água ou em álcool, razão pela qual é 
necessário retirar a parafina e hidratar os cortes. Este procedimento é feito com uma série de 
passagens em xilol (desparafinização), em concentrações decrescentes de álcool e em água. 
Após a hidratação, os cortes são submetidos à coloração de acordo com o 
procedimento escolhido e em seguida, irão percorrer o caminho inverso, isto é, serão 
desidratados e passarão por banhos de xilol para que seja obtida uma montagem permanente 
da lâmina histológica. O processo de montagem consiste em colocar uma gota de resina 
líquida (Entelan ou bálsamo do Canadá) sobre o corte histológico e cobri-lo com uma lamínula. 
Após algum tempo a resina seca e obtém-se uma lâmina que poderá durar anos. 
Protocolo da Coloração HE: 
- Desparafinização: 2 banhos de xilol (10 min cada banho) 
- Hidratação: 
• Álcool Absoluto (100%) – 5 min 
• Álcool 95% - 5 min 
• Álcool 80% - 5 min 
• Álcool 70% - 5 min 
• Água destilada 
- Corar com Hematoxilina de Ehlich por 5 a 15 min (o tempo deve ser estabelecido para cada 
corante que for preparado) 
- Lavar em água de torneira por cerca de 10 min 
- Corar com solução aquosa de eosina a 0,5% por 5 min 
- Lavar rapidamente em água destilada 
- Desidratação: 
 
 
• Álcool 70%– 1 min 
• Álcool 80%- 1 min 
• Álcool 95% - 1 min 
• Álcool Absoluto (100%) - 5 min (3x) 
• Água destilada 
- Diafanização: xilol por 5 min 
- Montagem com resina