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Métodos de estudo em Histologia (Cap. 1 - Junqueira e Carneiro 13ª ed.)

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Eduarda Lima (UFCA – T31) 
 
Métodos de estudo em Histologia
- Histologia é o estudo das células e dos tecidos do corpo 
e de como essas estruturas se organizam para constituir 
os órgãos. Em razão das pequenas dimensões, é 
necessário o auxílio de microscópios. 
- Técnica histológica ou histotecnologia: É o conjunto de 
procedimentos que envolvem a preparação de amostras 
(tecidos ou células) para análise sob microscopia de luz. 
 
Preparação de espécimes para 
exame microscópico 
- O procedimento mais usado no estudo de tecidos ao 
microscópio de luz (óptico) consiste na preparação de 
cortes histológicos, pois, na maioria dos casos, os tecidos 
e órgãos são espessos e não possibilitam a passagem 
adequada da luz para a formação de imagem. Por isso, 
antes de serem examinados ao microscópio eles devem 
ser fatiados em secções ou cortes histológicos muito 
delgados que são colocados sobre lâminas de vidro. 
- Os cortes são obtidos por meio de instrumentos de 
precisão, os micrótomos, mas antes os tecidos e órgãos 
precisam passar por uma série de tratamentos. 
- A técnica histológica é dividida nas seguintes fases: 
1. Coleta do material 
2. Fixação 
3. Clivagem 
4. Descalcificação 
5. Processamento 
6. Inclusão 
7. Microtomia 
8. Coloração 
9. Selagem 
10. Observação ao microscópio 
 
 Fixação 
- Logo após a remoção do corpo, células ou fragmentos 
de tecidos e órgãos são submetidos a fixação que tem 
como objetivos: 
→ Evitar a digestão dos tecidos por enzimas 
existentes nas próprias células (autólise) ou em 
bactérias; 
→ Endurecer os fragmentos; 
→ Preservar os tecidos para futuras colorações 
→ Preservar em grande parte a estrutura e a 
composição molecular dos tecidos, para seguir 
sendo o mais próximo da situação “in vivo”. 
- Pode ser realizada por métodos químicos ou físicos 
(menos frequentes). 
- Na fixação química, os tecidos são imersos em soluções, 
chamadas de fixadores, de agentes desnaturantes ou de 
agentes que estabilizam as moléculas ao formar pontes 
com moléculas adjacentes. Um grande fragmento deve 
ser cortado em outros menores antes de ser imerso no 
fixador, tornando mais fácil a penetração, garantindo 
melhor preservação da estrutura. 
- Principais grupos de fixadores: 
→ Agentes Oxidantes (ex: tetróxido de ósmio, ósmio 
crômico); 
→ Agentes Desnaturantes (ex: metanol, etanol, 
ácido acético, acetona); 
→ Fixadores de Mecanismos Desconhecidos (ex: 
ácido pícrico, cloreto de mercúrio, sais de zinco); 
→ Fixadores Aldeídos (ex: formol, paraformaldeído, 
glutaraldeído); 
→ Combinações (ex: carnoy, bouin, B5). 
OBS.: Alternativamente, pode ser utilizada a perfusão 
intravascular do fixador para alcançar o interior dos 
tecidos mais rápido pelos vasos sanguíneos, resultando 
em uma fixação melhor. 
- Um dos fixadores mais usados na microscopia de luz é 
uma solução de formaldeído a 4%, outro fixador muito 
usado é o grutaraldeído. 
 
Eduarda Lima (UFCA – T31) 
 
- Na microscopia eletrônica, em virtude da alta resolução 
oferecida, é necessário maior cuidado na fixação para 
melhor preservar detalhes da ultraestrutura das células 
e da matriz. Para essa finalidade, pode ser feita uma 
fixação dupla, usando uma solução de glutaraldeído 
tamponado, seguida por uma segunda fixação em 
tetróxido de ósmio, que preserva e fornece contraste 
aos lipídios e proteínas, tornou-se o procedimento padrão 
para estudos ultraestruturais. 
- Principais fatores que influenciam a fixação: 
→ Temperatura; 
→ Volume da mistura fixadora (deve ser 20 vezes 
maior que o tamanho do fragmento); 
→ Concentração; 
→ pH da mistura fixadora; 
→ Osmolaridade; 
→ Espessura da amostra; 
→ Tempo de fixação (ex: formaldeído – 06 a 48 
horas). 
ULTRAESTRUTURA: Estrutura detalhada de um 
espécime biológico, como uma célula, tecido ou 
órgão, que pode ser observado em microscopia 
eletrônica. 
 Clivagem 
- Processo de redução de tamanho e espessura dos 
fragmentos fixados. Permitindo de forma mais eficaz a 
penetração do fixador e a melhor difusão dos reagentes 
durante o processamento histológico; 
- A espessura aconselhada é de 3mm, com corte fino 
unidirecional. 
 Descalcificação 
- O tecido ósseo apresenta uma matriz extracelular com 
componentes minerais e orgânicos com consistência 
pétrea que não permitem seu seccionamento e 
consequente visualização ao microscópio de luz; 
- Para observação desse tipo de tecido ou diagnóstico de 
algumas patologias, deve-se proceder a descalcificação; 
- Tipos de descalcificadores: 
→ Ácidos; 
→ Histoquímicos (ex: EDTA); 
→ Soluções descalcificadoras patenteadas; 
→ Resinas de troca iônica; 
→ Descalcificadores eletrolíticos. 
(Os mais usados são a base de ácido – fortes ou fracos) 
- Fatores na escolha do método: 
→ A urgência do material; 
→ O grau de mineralização do tecido; 
→ A coloração a ser empregada; 
→ O tipo de fixador utilizado. 
 
 Processamento 
- Reúne procedimentos que visam substituir a água 
encontrada nos tecidos por um meio mais sólido que 
confiram consistência e dureza para serem cortados; 
- Etapas do processamento de tecidos: 
→ Desidratação: A água que se encontra nos 
tecidos não se mistura com a subst. do 
processamento (ex: parafina), logo, é necessária 
uma completa remoção da água para uma 
completa impregnação pela parafina. (ex de 
agentes desidratantes: etanol). 
→ Clarificação: Consiste na remoção do álcool dos 
tecidos utilizado na desidratação através de um 
agente clarificador (ex: solventes orgânicos - 
xilol); 
→ Infiltração ou impregnação: É a saturação das 
cavidades dos tecidos e das células por uma 
substância que é, geralmente, o meio em que 
estes serão inclusos (temp. ideal da parafina: 
56ºC a 60ºC). 
- Se caracteriza pela difusão de substâncias apropriadas 
para dentro e fora do tecido até atingir o ponto em que 
a concentração dos reagentes e do tecido se torne igual; 
- Quando há presença de vácuo o processamento pode 
ser acelerado; 
- O processamento pode ser realizado manualmente ou 
automático (economiza horas, existem dois tipos: tipo 
carrossel e o de transferência de fluido); 
Eduarda Lima (UFCA – T31) 
 
- Para a inclusão em parafina, as substâncias 
intermediárias mais usadas são o xilol e o toluol. Quando 
os fragmentos de tecidos são embebidos no solvente 
orgânico, eles ficam transparentes ou translúcidos. Em 
seguida, são colocados em parafina derretida (cerca de 
5ºC acima do ponto de fusão da parafina – 60ºC). O calor 
causa a evaporação do solvente orgânico, e os espaços 
existentes dentro dos tecidos tornam-se preenchidos 
com parafina. Depois de os fragmentos serem retirados 
da estufa, a parafina solidifica e eles se tornam rígidos. 
 
 Inclusão 
- Após o processamento é preciso que a amostra seja 
incluída em um molde com parafina que solidificada 
permitirá a microtomia; 
- A inclusão se baseia em colocar, com o auxílio de uma 
pinça previamente aquecida, os tecidos que foram 
previamente infiltrados em parafina no interior de um 
molde que já contém parafina líquida com a superfície a 
ser seccionada (a ser cortada ao micrótomo) para baixo; 
- Ou seja, consiste no processo em que o tecido é 
colocado em um molde com parafina fundida, após ser 
totalmente infiltrada, proporcionando uma consistência 
rígida; 
- Os fragmentos devem ser colocados na parafina 
enquanto aquecidos, evitando-se a formação de bolhas de 
ar em torno deles. Após o resfriamento, os blocos de 
parafina com o material incluído são obtidos. Para se 
realizar uma boa inclusão, é necessário que o fragmento 
esteja completamente desidratado, clarificado e 
corretamente impregnado; 
- É importante que logo após o término do 
processamento seja efetuada a inclusão, evitando que o 
material se torne quebradiço e retraído pelo efeito da 
temperatura da parafina aquecida; 
- As substâncias mais utilizadas para isso são a parafina 
(microscopia de luz) e algumas resinas de plástico 
(microsc. de luz e eletrônica). 
 
 Microtomia 
- Os blocos de parafina