Métodos de estudo em Histologia (Cap. 1 - Junqueira e Carneiro 13ª ed.)

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Eduarda Lima (UFCA – T31) 
 
Métodos de estudo em Histologia
- Histologia é o estudo das células e dos tecidos do corpo 
e de como essas estruturas se organizam para constituir 
os órgãos. Em razão das pequenas dimensões, é 
necessário o auxílio de microscópios. 
- Técnica histológica ou histotecnologia: É o conjunto de 
procedimentos que envolvem a preparação de amostras 
(tecidos ou células) para análise sob microscopia de luz. 
 
Preparação de espécimes para 
exame microscópico 
- O procedimento mais usado no estudo de tecidos ao 
microscópio de luz (óptico) consiste na preparação de 
cortes histológicos, pois, na maioria dos casos, os tecidos 
e órgãos são espessos e não possibilitam a passagem 
adequada da luz para a formação de imagem. Por isso, 
antes de serem examinados ao microscópio eles devem 
ser fatiados em secções ou cortes histológicos muito 
delgados que são colocados sobre lâminas de vidro. 
- Os cortes são obtidos por meio de instrumentos de 
precisão, os micrótomos, mas antes os tecidos e órgãos 
precisam passar por uma série de tratamentos. 
- A técnica histológica é dividida nas seguintes fases: 
1. Coleta do material 
2. Fixação 
3. Clivagem 
4. Descalcificação 
5. Processamento 
6. Inclusão 
7. Microtomia 
8. Coloração 
9. Selagem 
10. Observação ao microscópio 
 
 Fixação 
- Logo após a remoção do corpo, células ou fragmentos 
de tecidos e órgãos são submetidos a fixação que tem 
como objetivos: 
→ Evitar a digestão dos tecidos por enzimas 
existentes nas próprias células (autólise) ou em 
bactérias; 
→ Endurecer os fragmentos; 
→ Preservar os tecidos para futuras colorações 
→ Preservar em grande parte a estrutura e a 
composição molecular dos tecidos, para seguir 
sendo o mais próximo da situação “in vivo”. 
- Pode ser realizada por métodos químicos ou físicos 
(menos frequentes). 
- Na fixação química, os tecidos são imersos em soluções, 
chamadas de fixadores, de agentes desnaturantes ou de 
agentes que estabilizam as moléculas ao formar pontes 
com moléculas adjacentes. Um grande fragmento deve 
ser cortado em outros menores antes de ser imerso no 
fixador, tornando mais fácil a penetração, garantindo 
melhor preservação da estrutura. 
- Principais grupos de fixadores: 
→ Agentes Oxidantes (ex: tetróxido de ósmio, ósmio 
crômico); 
→ Agentes Desnaturantes (ex: metanol, etanol, 
ácido acético, acetona); 
→ Fixadores de Mecanismos Desconhecidos (ex: 
ácido pícrico, cloreto de mercúrio, sais de zinco); 
→ Fixadores Aldeídos (ex: formol, paraformaldeído, 
glutaraldeído); 
→ Combinações (ex: carnoy, bouin, B5). 
OBS.: Alternativamente, pode ser utilizada a perfusão 
intravascular do fixador para alcançar o interior dos 
tecidos mais rápido pelos vasos sanguíneos, resultando 
em uma fixação melhor. 
- Um dos fixadores mais usados na microscopia de luz é 
uma solução de formaldeído a 4%, outro fixador muito 
usado é o grutaraldeído. 
 
Eduarda Lima (UFCA – T31) 
 
- Na microscopia eletrônica, em virtude da alta resolução 
oferecida, é necessário maior cuidado na fixação para 
melhor preservar detalhes da ultraestrutura das células 
e da matriz. Para essa finalidade, pode ser feita uma 
fixação dupla, usando uma solução de glutaraldeído 
tamponado, seguida por uma segunda fixação em 
tetróxido de ósmio, que preserva e fornece contraste 
aos lipídios e proteínas, tornou-se o procedimento padrão 
para estudos ultraestruturais. 
- Principais fatores que influenciam a fixação: 
→ Temperatura; 
→ Volume da mistura fixadora (deve ser 20 vezes 
maior que o tamanho do fragmento); 
→ Concentração; 
→ pH da mistura fixadora; 
→ Osmolaridade; 
→ Espessura da amostra; 
→ Tempo de fixação (ex: formaldeído – 06 a 48 
horas). 
ULTRAESTRUTURA: Estrutura detalhada de um 
espécime biológico, como uma célula, tecido ou 
órgão, que pode ser observado em microscopia 
eletrônica. 
 Clivagem 
- Processo de redução de tamanho e espessura dos 
fragmentos fixados. Permitindo de forma mais eficaz a 
penetração do fixador e a melhor difusão dos reagentes 
durante o processamento histológico; 
- A espessura aconselhada é de 3mm, com corte fino 
unidirecional. 
 Descalcificação 
- O tecido ósseo apresenta uma matriz extracelular com 
componentes minerais e orgânicos com consistência 
pétrea que não permitem seu seccionamento e 
consequente visualização ao microscópio de luz; 
- Para observação desse tipo de tecido ou diagnóstico de 
algumas patologias, deve-se proceder a descalcificação; 
- Tipos de descalcificadores: 
→ Ácidos; 
→ Histoquímicos (ex: EDTA); 
→ Soluções descalcificadoras patenteadas; 
→ Resinas de troca iônica; 
→ Descalcificadores eletrolíticos. 
(Os mais usados são a base de ácido – fortes ou fracos) 
- Fatores na escolha do método: 
→ A urgência do material; 
→ O grau de mineralização do tecido; 
→ A coloração a ser empregada; 
→ O tipo de fixador utilizado. 
 
 Processamento 
- Reúne procedimentos que visam substituir a água 
encontrada nos tecidos por um meio mais sólido que 
confiram consistência e dureza para serem cortados; 
- Etapas do processamento de tecidos: 
→ Desidratação: A água que se encontra nos 
tecidos não se mistura com a subst. do 
processamento (ex: parafina), logo, é necessária 
uma completa remoção da água para uma 
completa impregnação pela parafina. (ex de 
agentes desidratantes: etanol). 
→ Clarificação: Consiste na remoção do álcool dos 
tecidos utilizado na desidratação através de um 
agente clarificador (ex: solventes orgânicos - 
xilol); 
→ Infiltração ou impregnação: É a saturação das 
cavidades dos tecidos e das células por uma 
substância que é, geralmente, o meio em que 
estes serão inclusos (temp. ideal da parafina: 
56ºC a 60ºC). 
- Se caracteriza pela difusão de substâncias apropriadas 
para dentro e fora do tecido até atingir o ponto em que 
a concentração dos reagentes e do tecido se torne igual; 
- Quando há presença de vácuo o processamento pode 
ser acelerado; 
- O processamento pode ser realizado manualmente ou 
automático (economiza horas, existem dois tipos: tipo 
carrossel e o de transferência de fluido); 
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- Para a inclusão em parafina, as substâncias 
intermediárias mais usadas são o xilol e o toluol. Quando 
os fragmentos de tecidos são embebidos no solvente 
orgânico, eles ficam transparentes ou translúcidos. Em 
seguida, são colocados em parafina derretida (cerca de 
5ºC acima do ponto de fusão da parafina – 60ºC). O calor 
causa a evaporação do solvente orgânico, e os espaços 
existentes dentro dos tecidos tornam-se preenchidos 
com parafina. Depois de os fragmentos serem retirados 
da estufa, a parafina solidifica e eles se tornam rígidos. 
 
 Inclusão 
- Após o processamento é preciso que a amostra seja 
incluída em um molde com parafina que solidificada 
permitirá a microtomia; 
- A inclusão se baseia em colocar, com o auxílio de uma 
pinça previamente aquecida, os tecidos que foram 
previamente infiltrados em parafina no interior de um 
molde que já contém parafina líquida com a superfície a 
ser seccionada (a ser cortada ao micrótomo) para baixo; 
- Ou seja, consiste no processo em que o tecido é 
colocado em um molde com parafina fundida, após ser 
totalmente infiltrada, proporcionando uma consistência 
rígida; 
- Os fragmentos devem ser colocados na parafina 
enquanto aquecidos, evitando-se a formação de bolhas de 
ar em torno deles. Após o resfriamento, os blocos de 
parafina com o material incluído são obtidos. Para se 
realizar uma boa inclusão, é necessário que o fragmento 
esteja completamente desidratado, clarificado e 
corretamente impregnado; 
- É importante que logo após o término do 
processamento seja efetuada a inclusão, evitando que o 
material se torne quebradiço e retraído pelo efeito da 
temperatura da parafina aquecida; 
- As substâncias mais utilizadas para isso são a parafina 
(microscopia de luz) e algumas resinas de plástico 
(microsc. de luz e eletrônica). 
 
 Microtomia 
- Os blocos de parafinaque contêm os tecidos são então 
levados a um micrótomo; 
- Os mais utilizados são os micrótomos rotativos 
convencionais; 
- De acordo com a regulagem, realiza cortes de 1 a 60 
micrômetros, embora isso dependa do meio de inclusão 
que se encontra o tecido; 
 
- Após serem seccionados, os cortes são colocados para 
flutuar sobre uma superfície de água aquecida e, depois, 
sobre lâminas de vidro, onde aderem e serão, em seguida, 
corados. 
 
 Fixação física por congelação 
- Um modo diferente de preparar secções de tecidos 
ocorre após submeter os tecidos a um congelamento 
rápido. Dessa forma, são fixados por congelação 
tornando-se rígido e prontos para serem seccionados. O 
micrótomo para tecido congelados é o criostato ou 
criomicrótomo. Como não passa pelo procedimento de 
desidratação e inclusão, ele é usado em hospitais/centros 
cirúrgicos para que seja possível analisar, em poucos 
minutos, espécimes obtidos durante procedimentos 
cirúrgicos; 
- Os cortes por congelação também são úteis para o 
estudo histoquímico de enzimas e de outras proteínas em 
cortes histológicos, porque, ao contrário da fixação 
química, o congelamento não inativa a maioria das enzimas 
e mantém muitas proteínas em suas conformações e 
locais originais. Quando se deseja estudar os lipídios 
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também se usa secções congeladas, já que a imersão de 
tecidos em solventes, como o xilol, dissolve essas 
substâncias. 
 
 Coloração 
- Com poucas exceções, os tecidos são incolores. Muito 
corantes se comportam como substâncias de caráter 
ácido ou básico e tendem a formar ligações eletrostáticas 
(salinas) com componentes ionizados dos tecidos. Os 
componentes dos tecidos que se coram bem com 
corantes básicos são basófilos e os que tem afinidade 
por corantes ácido, acidófilos. 
→ Corantes básicos - Exemplos: Azul de toluidina, 
azul de metileno e hematoxilina (existem 4 tipos 
mais conhecidos – Erlich, Delafield, Mayer, 
Harris). Se ligam às estruturas basófilas das 
células e dos tecidos. Os tecidos que reagem com 
corantes básicos contêm ácidos na sua 
composição, como ácidos nucleicos, 
glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas; 
→ Corantes ácidos – Exemplos: Orange G, eosina, 
fucsina ácida. Coram principalmente 
componentes acidófilos dos tecidos, como, por 
exemplo, mitocôndrias, grânulos de secreção, 
proteínas citoplasmáticas e colágeno. 
- Dentre esses, a combinação de hematoxilina e eosina 
(HE) é a mais utilizada. A hematoxilina cora em azul ou 
violeta o núcleo das células e estruturas como porções 
do citoplasma ricas em RNA e a matriz extracelular da 
cartilagem hialina. A eosina cora o citoplasma e o colágeno 
em cor de rosa. 
- O procedimento inteiro desde a fixação até a 
observação de um tecido em um microscópio de luz pode 
demorar de 12h a 2 dias. 
 
Microscopia de Luz 
 
 
 
- Torna possível a obtenção de boas imagens aumentadas 
até 1000 a 1500 vezes. O poder/limite de resolução 
máximo (menor distância entre duas partículas, possibilita 
que elas sejam vistas como dois objetos separados) do 
microscópio de luz é de aproximadamente 0,2 µm. 
Objetos menores ou mais delgados que 0,2 µm (exemplo, 
membrana celular ou um filamento de actina) não podem 
ser distinguidos por esse instrumento. Ou dois objetos 
como, duas mitocôndrias ou lisossomos, serão vistos como 
um só objeto se estiverem separados por menos de 0,2 
µm. 
- Então, o que determina a riqueza de detalhes é o limite 
de resolução máxima e não seu poder de aumento. 
 
Microscopia de contraste de fase e 
de contraste diferencial de 
interferência 
- O microscópio de contraste de fase usa um sistema de 
lentes que produz imagens visíveis de cortes quase 
transparentes/não corados. Outros métodos para 
observar secções desse tipo é a microscopia de 
contraste diferencial (microscopia de Nomarski), que 
produz uma imagem aparentemente tridimensional. Estas 
imagens são sempre vistas em preto, branco e tons de 
cinza. 
 
Microscopia confocal 
- A imagem fornecida pelos microscópios não costuma 
ser composta de um único plano muito delgado do corte, 
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há superposição de vários planos. Para resolver isso foi 
desenvolvido o microscópio confocal, que torna possível 
focalizar um plano muito delgado do espécime. A 
localização dos componentes do espécime pode ser feita 
com mais precisão que ao microscópio de luz. 
 
Microscopia de fluorescência 
- É chamado de fluorescência o fenômeno quando as 
substâncias são irradiadas por luz de um determinado 
comprimento de onda, emitindo luz com um comprimento 
de onda mais longo. Nessa microscopia as secções são 
iluminadas por uma fonte de luz de mercúrio sob alta 
pressão. Dessa forma, as substâncias fluorescentes são 
observadas como objetos brilhantes e coloridos. 
Substâncias fluorescentes que tenham afinidade por 
moléculas encontradas nas células ou na matriz 
extracelular podem ser usadas como corantes 
fluorescentes, como o alaranjado de acridina, que pode 
combinar-se com o DNA e o RNA. 
 
Microscopia Eletrônica 
- Se baseia na interação entre elétrons e componentes 
dos tecidos. Os dois tipos são: 
 Microscopia eletrônica de transmissão: 
- Na teoria, possibilita altíssima resolução (0,1 nm), na 
prática, situa em torno de 3 nm. Torna possível que 
espécimes de partículas e moléculas isoladas sejam 
ampliados até cerca de 400 mil vezes e que cortes 
delgados de células e tecidos sejam ampliados cerca de 
120 mil vezes. 
- A imagem resultante é sempre em preto e branco. As 
áreas claras são denominadas elétron-lucentes ou 
elétron-transparentes, enquanto as áreas escuras, 
elétrons-densa. 
- O microscópio eletrônico usa cortes muito mais delgados 
que os de microscopia de luz. 
 Microscopia eletrônica de varredura: 
- Fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies 
de células, tecidos e órgãos. São obtidas imagens em 
preto e branco de fácil interpretação. 
 
OBS1.: Os termos histoquímica e citoquímica são 
usados para indicar métodos que identificam e 
localizam subst. em células e matriz extracelular, 
seja em cortes histológicos ou em células cultivadas. 
Muitos procedimentos histoquímicos são usados em 
diagnóstico laboratorial de várias doenças. A reação 
de Perts para ferro, as reações de PAS-amilase para 
glicogênio e Alcian blue para glicosaminoglicanos 
são habitualmente aplicadas a biopsias de tecidos de 
pacientes nos quais se quer diagnosticar doenças em 
que se acumulam nos tecidos quantidades elevadas 
de ferro (ex: hemocromatose, hemossiderose), 
glicogênio(glicogenoses), glicosaminoglicanos 
(mucopolissacaridoses) e esfingolipídios 
(esfingolipidoses). 
 
 
OBS2.: A imunocitoquímica é a metodologia que 
possibilita identificar, por meio de anticorpos, 
moléculas em cortes ou em células cultivadas, 
grande utilidade para identificar e localizar 
proteínas e glicoproteínas. O anticorpo se liga 
especificamente à proteína e sua localização pode 
então ser evidenciada por microscopia de luz ou 
eletrônica, dependendo do marcador que foi 
acoplado ao anticorpo. 
 
OBS3.: Técnicas de hibridização: Hibridização ou 
hibridação é a ligação entre duas moléculas de 
cadeia única de ácidos nucleicos (DNA com DNA, 
RNA com RNA ou RNA com DNA) que se reconhecem 
um ao outro se suas sequências forem 
complementares, formando moléculas de cadeia 
dupla. A hibridização possibilita a identificação de 
sequências específicas de DNA ou RNA. 
Hibridização in situ: Quando aplicada diretamente 
a células e cortes de tecidos, esfregaços ou 
cromossomos de células mitóticas, a técnica é 
chamada de hibridização in situ. Essa técnica é 
excelente para averiguar se uma célula tem uma 
sequência específica de DNA (ex: um gene ou parte 
de um gene), ou para definir a localização de um 
gene em um cromossomo ou identificar as células 
nas quais um gene específico está sendo transcrito. 
As técnicas de hibridização são altamente 
específicas e habitualmente utilizadas em pesquisa, 
diagnóstico clínico emedicina forense.