Histologia - Técnicas de histologia - Microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de luz óptica - BBV UFRJ

Prévia do material em texto

Histologi� .
Medicina - UFRJ
Miriã Carino
Técnica� d� histologi� .
● Microscopia de luz
● Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Colet� � processament� d� materiai�
● Coleta de materiais
● Fixação (preservar a estrutura o mais semelhante possível de
quando em vida)
�xadore�
● Microscopia de luz: formol a 10 % (formaldeído). O material fica no
formol a 10% por 24h, que é o tempo suficiente para que haja a
devida penetração do formal na estrutura tecidual. Os
fragmentos de tecido costumam ser maiores que os da MET. O
ideal é que o material não seja muito espesso porque o
formaldeído não tem uma capacidade de penetração muito alta.
● Microscopia eletrônica (requer um grau de preservação mais
apurado):
○ Glutaraldeído - fixador para proteínas. 24 horas.
○ Tetróxido de ósmio (pós-fixador) - fixador para lipídeos
(preservação das membranas). 1-1 ½ hora.
O tamanho do material geralmente é de 2 a 3 mm.
Micr�copi� d� l�z .
Processament�
É uma sequência de etapas onde o objetivo final é a formação de
blocos de parafina que envolvem todo o material destinado para ser
devidamente cortado. Substituir a água dos tecidos (que os deixa
moles) pela parafina, que conforme penetra nas células os tornam
rígidos o suficiente para serem devidamente cortados.
● Microscopia de luz:
○ O material é rapidamente lavado para a retirada do excesso
de formol.
○ Desidratação: retirada de água dos tecidos com o auxílio de
álcool em concentração crescente (70%, 80%, 90% e quase
100%) - uma hora em cada e total de 5 horas (é colocado
duas vezes no álcool 100%)
○ Clarificação ou diafanização: como o álcool e a parafina
não se misturam, temos que substituir o álcool por algo em
que a parafina se misture. Essa substância é o chamado
xilol (xileno). São dados 2 banhos (cada um de 1 hora,
renovando o xilol) de xilol para a retirada do álcool e
permitir a penetração de parafina.
○ Impregnação por parafina: imersão do material em parafina
líquida a 58°C em estufa. O xilol vai evaporando e a parafina
vai se penetrando no citoplasma e nos espaços
intercelulares. (2 banhos de 1 hora cada, renovando a
parafina)
○ Inclusão em parafina: feitura do bloco de parafina que será
cortado posteriormente. Nós retiramos os fragmentos de
tecido e órgãos e os colocamos em formas metálicas. Com a
superfície que desejamos observar virada para baixo,
despejamos a parafina líquida à temperatura ambiente por
cima, e a parafina se solidifica.
○ Microtomia: obtenção de corte histológicos
○ Secagem em estufa de um dia para outro
○ Colorações: misturas de substâncias coloridas (corantes)
com afinidades variadas ou seletivas pelos componentes
teciduais e celulares, para evidenciação destes
componentes ao microscópio óptico
■ Hematoxilina: corante básico com afinidade por
estruturas ácidas (ex: núcleo, regiões do citoplasma
ricas em RE granulado).
■ Basofilia: afinidade por corantes básicos devido à
natureza ácida.
■ Eosina: corante ácido, com afinidade por estruturas
básicas (ex: a maioria dos citoplasmas, componentes
da matriz extracelular)
■ Acidofilia: afinidade por corantes ácidos devido à
natureza básica.
● Etapas da coloração
○ Desparafinização (com xilol)
○ Hidratação (com álcoois em concentrações decrescente até
chegar a água destilada)
○ Hematoxilina - de 3 a 5 minutos
○ Enxágue com água corrente
○ Eosina - de 1 a 2 minutos
○ Enxágue com água corrente
○ Desidratação
○ Clarificação (com xilol)
○ Montagem com meio de montagem: bálsamo do Canadá
(esperar 2 meses a secagem para usar) ou Entellan (uso
imediato mas é caro)
Imunocitoquímic� / imun�-histoquímic�
É uma técnica onde são utilizados anticorpos que se ligam a
componentes essencialmente presentes na estrutura celular ou
tecidual. E esses anticorpos são marcados por outros anticorpos
dotados de materiais coloridos associados.
● Anticorpo primário: contra a molécula que se quer marcar
● Anticorpo secundário: contra o anticorpo primário, geralmente
associado a um fluoróforo (substância fluorescente) ou cromóforo
(substância colorida).
Micr�copi� eletrônic� d� transmissã� .
Processament�
● Desidratação: com acetonas (30% até 100%)
● Impregnação: resinas epóxi (penetram após o preparo prévio e
desidratação da estrutura, enrijecendo os tecidos)
● Inclusão: resinas epóxi (em estufas que endurecem as resinas)
● Microtomia: ultramicrótomo - aparelho para obtenção de cortes
ultrafinos (entre 50-60 nm de espessura)
Contrastaçã�
Utiliza-se metais pesados como acetato de uranila e citrato de
chumbo.
Deposição de maior quantidade de materiais contrastantes em
locais de maior concentração de componentes estruturais nas células
ou no tecido - dispersão/desvio dos elétrons - áreas elétron-densas
(mais escuras)
Deposição de menor quantidade de materiais contrastantes em
locais de menor concentração de componentes estruturais nas células
ou no tecido - transpassagem dos elétrons - áreas elétron-lucentes ou
elétron-lúcidas (mais claras)