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Métodos empregados no estudo de células e tecidos

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 Histologia: ramo da anatomia que estuda os
tecidos animais e vegetais e como eles
vão se organizar para formar os órgãos
 Identificação e caracterização
 Técnica histológica: a preparação dos
tecidos destinados ao estudo à microscopia
de luz
 É necessária a obtenção de fragmentos
do tecido que serão coletados em lâminas
muito finas e transparentes
 É necessário técnicas especificas
Formatos celulares
 As células podem se diferenciar em
diversos tipos
 Características
 Formato
 Função
 Epitélio: de revestimento e granular
 Revestimento: reveste todos os
órgãos internamente e a pele
Epitélio simples
 Só possui uma camada de células
 Epitélio simples escamoso
 Mais achatado
 Epitélio simples cubico
 Forma de cubo
 Epitélio simples colunar
 Forma de coluna
Epitélio escamoso
 Possui várias camadas de células
 Epitélio estratificado escamoso
 Mais achatado
 Epitélio estratificado cubico
 Não tem o formato perfeito de um
cubo por conta das camadas
 Quadrados
 Epitélio escamoso colunar
 Quadrados maiores
Epitélio pseudoestratificado
 Nível dos núcleos são irregulares
 “Falso estratificado”
Tecnicas de preparacao
histologica
 Existem algumas formas de preparar as
amostras para serem analisadas no
microscópio optico
 Espalhamento, estiraço, esmagamento,
corte histológico, decalque e montagem
total
Técnica de espalhamento
 Bata espalhar o material biológico na lâmina
de vidro
 Cobrir a lamínula e observar
 Podem ser utilizados corantes no processo
 Analise de urina e algumas etapas do
espermograma
Técnica de estiraço/esfregaço
 A partir de uma gota do material, faz-se a
extensão no material sobre a lâmina com
auxílio de outra lâmina
 Geralmente utiliza-se corantes
 Analise de sangue
Técnica de esmagamento
 Geralmente são células unidas, mas que
por esmagamento, espalham-se pela
lâmina
 Em alguns casos o material pode ser
fervido
 Analise de tecidos vegetais
Corte histológico
 Células firmemente unidas entre si
 Torna-se necessário o corte em faias finas
o suficiente para que a luz do microscópio
possa atravessar
 Materiais firmes e rígidos
 Folhas, caules e raízes de plantas
 Com uma lâmina de barbear
 Pode-se observar ainda vivos
 Materiais de origem animal e muitos
materiais vegetais
 Moles demais para permitir cortes
manuais finos
 Observação vivo é praticamente
impossível
Decalque
 Contato direto da superfície de corte com
uma lâmina de microscopia
 Núcleos ficam inteiros sobre a lâmina
 Estudos da quantidade de DNA e fenótipos
nucleares
Montagem total
1. Coleta
 Remoção do tecido do organismo, seja
ele vivo (biopsia) ou morto (necropsia)
 Auxilio de bisturi, tesoura ou piça
 Devem ser respeitados todos os
cuidados de biossegurança e aspectos
legais envolvidos
2. Fixação
 Procedimentos para imobilizar as
substancias constituintes das células e
dos tecidos
 Maior resistência para suportar as
demais etapas
 Seus componentes internos
permanecem preservados
 Fixadores físicos: congelamento e
outros
 Fixadores químicos:
 Aldeídos: formaldeído, glutaraldeido,
paraformaldeido
 Oxidantes: tetroxido de ósmio,
dicromato de potássio, permanganato de
potássio
 Desnaturantes ou coagulantes:
metanol, etanol, acetona, ácido acético
3. Desidratação
 Retirar a água presente nos tecidos
amostrados
 Utiliza-se principalmente o banho em
álcool etílico em concentrações
crescentes
 Começa com álcool 70% e vai até
100% gradualmente
4. Clarificação
 Prepara o tecido para a adição de
parafina ou outra resina plástica
 Remove o álcool a amostra
 Torna o material mais claro
 Utiliza-se o xilol
 Impregnar a peça em uma solução
com solvente de parafina
5. Infiltração
 A amostra deve ser infiltrada ou
impregnada com parafina em estufa a
60 °C
 Importante para remover todo o xilol
dos tecidos
 Caso necessário, realizar mais um
“banho”
 Não deixar em alta temperatura, pois
pode danificar a amostra
6. Inclusão
 Colocar a amostra em uma substancia
de consistência firme, para realizar
outro “corte”
 Inserido em um molde com parafina
liquida
7. Microtomia
 Seccionar a amostra em fatias muito
finas e uniformes
 Espessura geralmente utilizada: 4 a 6
µm
 Utiliza-se do micrótomo
 Após esta etapa, os cortes são
coletados com uma pinça e colocados
sobre lâminas de vidro previamente
limpas
8. Coloração
 Corantes orgânicos
 Classificados em dois grupos:
corantes básicos e ácidos
 Corantes básicos: possuem carga
positiva e coram componentes
celulares básicos (basófilos) em azul ou
roxo
 Hematoxilina
 Corantes ácidos: possuem carga
negativa e coram componentes
celulares ácidos (acidófilos) em rosa
 Eosina
 Um dos corantes mais utilizados é o
“Hematoxilina e Eosina” (HE)
 Existem outros tipos de corantes
 Sais metálicos e corantes especiais
 Deve seguir algumas fases:
 Desparafinização: emprego do xilol
 Hidratação: concentrações
decrescentes de álcool – 100% até
água destilada (se o corante for
alcoólico, interromper no 70%)
 Coloração: imersão da amostra em
um corante
 Desidratação: concentrações
crescentes de álcool
 Clarificação: novamente com
emprego do xilol
9. Montagem da lâmina
 Também chamado de selagem
 Última etapa
 A amostra deve ser coberta com uma
lamínula
 Empregar alguma substancia de fixação
 Resinas sintéticas ou bálsamo do
canada
Tecnicas histoquimicas e
citoquimicas
 Identificação de determinadas substancias
ou macromoléculas nas células
 Dependendo do método para a
visualização podem ser formados
compostos de diferentes características
 Microscopia de luz: substancias
insolúveis coloridas
 Microscopia eletrônica: substancias
eletro-densas
Técnicas citoquimicas
 Técnica do PAS (ácido periódico reativo
de Schiff)
 Identificar glicogênio, glicoproteínas e
glisocaminoglicanos nos tecidos
 Cora as moléculas ricas em
carboidratos em magenta
 Tecnica de Feulgen
 Identificar ácidos nucleicos nos
tecidos
 Cora o DNA em vermelho
Técnicas histoquímicas
 Detecção de proteínas, dentre as quais
temos as enzimas
 A identificação das enzimas é realizada de
forma indireta
 Adiciona o tecido um uma solução
que contenha o substrato específico
 Caso exista a enzima no tecido, o
substrato específico será convertido
em um produto da reação catalisada
 Deve ser adicionado uma substância
marcadora capaz de interagir com o
produto da reação catalisada
 O produto resultante deve ser
insolúvel e passível de ser observado por
coloração ou elétron-densidade
Técnicas imunocitoquimicas
 Interações muito específicas entre as
moléculas a serem identificadas (proteínas
e glicoproteínas) com anticorpos
 Os anticorpos precisam de uma substância
marcadora para identificação
 Essa substancia marcadora geralmente é
fluorescente
 Necessário o uso de um
microscópio de fluorescência
 Imunocitoquimica direta:
 O AC (anticorpo) marcado liga-se
direto na proteína
 Imunocitoquimica indireta:
 O AC liga-se em um anticorpo
secundário
 É mais sensível
 Possui mais etapas de analise
Citoesqueleto de
fibroblasto