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Histologia: ramo da anatomia que estuda os tecidos animais e vegetais e como eles vão se organizar para formar os órgãos Identificação e caracterização Técnica histológica: a preparação dos tecidos destinados ao estudo à microscopia de luz É necessária a obtenção de fragmentos do tecido que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes É necessário técnicas especificas Formatos celulares As células podem se diferenciar em diversos tipos Características Formato Função Epitélio: de revestimento e granular Revestimento: reveste todos os órgãos internamente e a pele Epitélio simples Só possui uma camada de células Epitélio simples escamoso Mais achatado Epitélio simples cubico Forma de cubo Epitélio simples colunar Forma de coluna Epitélio escamoso Possui várias camadas de células Epitélio estratificado escamoso Mais achatado Epitélio estratificado cubico Não tem o formato perfeito de um cubo por conta das camadas Quadrados Epitélio escamoso colunar Quadrados maiores Epitélio pseudoestratificado Nível dos núcleos são irregulares “Falso estratificado” Tecnicas de preparacao histologica Existem algumas formas de preparar as amostras para serem analisadas no microscópio optico Espalhamento, estiraço, esmagamento, corte histológico, decalque e montagem total Técnica de espalhamento Bata espalhar o material biológico na lâmina de vidro Cobrir a lamínula e observar Podem ser utilizados corantes no processo Analise de urina e algumas etapas do espermograma Técnica de estiraço/esfregaço A partir de uma gota do material, faz-se a extensão no material sobre a lâmina com auxílio de outra lâmina Geralmente utiliza-se corantes Analise de sangue Técnica de esmagamento Geralmente são células unidas, mas que por esmagamento, espalham-se pela lâmina Em alguns casos o material pode ser fervido Analise de tecidos vegetais Corte histológico Células firmemente unidas entre si Torna-se necessário o corte em faias finas o suficiente para que a luz do microscópio possa atravessar Materiais firmes e rígidos Folhas, caules e raízes de plantas Com uma lâmina de barbear Pode-se observar ainda vivos Materiais de origem animal e muitos materiais vegetais Moles demais para permitir cortes manuais finos Observação vivo é praticamente impossível Decalque Contato direto da superfície de corte com uma lâmina de microscopia Núcleos ficam inteiros sobre a lâmina Estudos da quantidade de DNA e fenótipos nucleares Montagem total 1. Coleta Remoção do tecido do organismo, seja ele vivo (biopsia) ou morto (necropsia) Auxilio de bisturi, tesoura ou piça Devem ser respeitados todos os cuidados de biossegurança e aspectos legais envolvidos 2. Fixação Procedimentos para imobilizar as substancias constituintes das células e dos tecidos Maior resistência para suportar as demais etapas Seus componentes internos permanecem preservados Fixadores físicos: congelamento e outros Fixadores químicos: Aldeídos: formaldeído, glutaraldeido, paraformaldeido Oxidantes: tetroxido de ósmio, dicromato de potássio, permanganato de potássio Desnaturantes ou coagulantes: metanol, etanol, acetona, ácido acético 3. Desidratação Retirar a água presente nos tecidos amostrados Utiliza-se principalmente o banho em álcool etílico em concentrações crescentes Começa com álcool 70% e vai até 100% gradualmente 4. Clarificação Prepara o tecido para a adição de parafina ou outra resina plástica Remove o álcool a amostra Torna o material mais claro Utiliza-se o xilol Impregnar a peça em uma solução com solvente de parafina 5. Infiltração A amostra deve ser infiltrada ou impregnada com parafina em estufa a 60 °C Importante para remover todo o xilol dos tecidos Caso necessário, realizar mais um “banho” Não deixar em alta temperatura, pois pode danificar a amostra 6. Inclusão Colocar a amostra em uma substancia de consistência firme, para realizar outro “corte” Inserido em um molde com parafina liquida 7. Microtomia Seccionar a amostra em fatias muito finas e uniformes Espessura geralmente utilizada: 4 a 6 µm Utiliza-se do micrótomo Após esta etapa, os cortes são coletados com uma pinça e colocados sobre lâminas de vidro previamente limpas 8. Coloração Corantes orgânicos Classificados em dois grupos: corantes básicos e ácidos Corantes básicos: possuem carga positiva e coram componentes celulares básicos (basófilos) em azul ou roxo Hematoxilina Corantes ácidos: possuem carga negativa e coram componentes celulares ácidos (acidófilos) em rosa Eosina Um dos corantes mais utilizados é o “Hematoxilina e Eosina” (HE) Existem outros tipos de corantes Sais metálicos e corantes especiais Deve seguir algumas fases: Desparafinização: emprego do xilol Hidratação: concentrações decrescentes de álcool – 100% até água destilada (se o corante for alcoólico, interromper no 70%) Coloração: imersão da amostra em um corante Desidratação: concentrações crescentes de álcool Clarificação: novamente com emprego do xilol 9. Montagem da lâmina Também chamado de selagem Última etapa A amostra deve ser coberta com uma lamínula Empregar alguma substancia de fixação Resinas sintéticas ou bálsamo do canada Tecnicas histoquimicas e citoquimicas Identificação de determinadas substancias ou macromoléculas nas células Dependendo do método para a visualização podem ser formados compostos de diferentes características Microscopia de luz: substancias insolúveis coloridas Microscopia eletrônica: substancias eletro-densas Técnicas citoquimicas Técnica do PAS (ácido periódico reativo de Schiff) Identificar glicogênio, glicoproteínas e glisocaminoglicanos nos tecidos Cora as moléculas ricas em carboidratos em magenta Tecnica de Feulgen Identificar ácidos nucleicos nos tecidos Cora o DNA em vermelho Técnicas histoquímicas Detecção de proteínas, dentre as quais temos as enzimas A identificação das enzimas é realizada de forma indireta Adiciona o tecido um uma solução que contenha o substrato específico Caso exista a enzima no tecido, o substrato específico será convertido em um produto da reação catalisada Deve ser adicionado uma substância marcadora capaz de interagir com o produto da reação catalisada O produto resultante deve ser insolúvel e passível de ser observado por coloração ou elétron-densidade Técnicas imunocitoquimicas Interações muito específicas entre as moléculas a serem identificadas (proteínas e glicoproteínas) com anticorpos Os anticorpos precisam de uma substância marcadora para identificação Essa substancia marcadora geralmente é fluorescente Necessário o uso de um microscópio de fluorescência Imunocitoquimica direta: O AC (anticorpo) marcado liga-se direto na proteína Imunocitoquimica indireta: O AC liga-se em um anticorpo secundário É mais sensível Possui mais etapas de analise Citoesqueleto de fibroblasto