Passo a p[1]..

Prévia do material em texto

Passo a passo para o seqüenciamento do DNA
Isso é muito legal saber pra quem tem aula prática com o Gonçalo, mas também ajuda nos outros.
Pergunta: como desvendar a seqüência gênica e, eventualmente, as funções desempenhadas pelos genes presentes nesta seqüência , partindo-se apenas de fungos e de um banco de dados?
Procedimentos: 
O fungo foi cultivado previamente em meio de cultura líquido.
O fungo foi macerado em um cadinho com nitrogênio líquido, a fim de se romper sua parede celular.
Foram adicionados, a um ependorf, juntamente com o extrato de células do fungo, quinhentos microlitros de detergente CTAB. Esperou-se algumas horas até que o detergente agisse sobre a membrana plasmática e a carioteca, rompendo-as e liberando o conteúdo celular. Nessa etapa foi também adicionado o EDTA, que impede a ação de DNAases sobre o DNA.
Adicionou-se quinhentos microlitros de fenol-clorofórmio, um solvente orgânico, que separa em camadas o DNA e as substâncias que não são de nosso interesse.
Centrifugou-se tudo a dez mil RPM durante dois minutos.
Nessa etapa, houve a formação de três fases, estando o DNA concentrado na fase superior. A ela foi adicionada uma solução salina, a fim de quebrar a coesão entre as moléculas de água.
Adicionou-se etanol gelado, que desfaz a rede formada pela água, e álcool 70% logo depois (os 30% de água no álcool são para dissolver o sal que precipitou no fundo do ependorf, tornando o precipitado de DNA menos salino).
Por fim, centrifugou-se novamente a mistura de forma idêntica à anterior. Assim, o DNA foi extraído.
É necessário agora fragmentar o DNA aleatoriamente e seqüenciá-lo. 
Processo físico de fragmentação: sonificação (fragmentação por ultrasons)
Tratamento dos fragmentos com polimerases e exonucleases (ao mesmo tempo) para separá-los antes de individualizá-los para injetá-los nas bactérias.
Adiciona-se os fragmentos tratados aos vetores (plasmídeos).
O plasmídeo apresenta uma região poli-linker do gene repórter, local onde agem as enzimas de restrição.
Os plasmídeos são, então, tratados com enzimas de restrição, que os tornam lineares (as enzimas dividem o gene repórter, isto é, cada ponta do DNA plasmidial passa a conter uma parte do gene repórter).
A esses plasmídeos lineares se acrescenta os fragmentos de DNA quebrados por sonificação e a proteína ligase, que permite a ligação entre os plasmídeos e os fragmentos de DNA.
Injeção dos plasmídeos ligados (que foram misturados aos fragmentos de DNA e se ligaram a eles) em bactérias através de eletroporação, na qual uma corrente elétrica despolariza a membrana plasmática, permitindo assim a entrada do DNA.
Estas células que passaram por eletroporação crescem em meio de cultura. Se o gene repórter dividido no plasmídeo for o da β-galactosidase e se as bactérias estiverem em meio de cultura contendo galactose, a obtenção de colônias brancas indica que o plasmídeo se ligou a um fragmento de DNA (o gene repórter não se recompôs depois que o plasmídeo se fechou novamente) e a obtenção de colônias azuis indica que o plasmídeo não se ligou ao fragmento de DNA (o gene repórter se religou).
As bactérias brancas, que são as de interesse por terem incorporado o fragmento de DNA do fungo, são colocadas para crescem em overnight em meio líquido.
Centrifuga-se o meio de cultura líquido e acrescenta-se tampão Tri-EDTA (que conserva o DNA) a fim de se ressuspender a bactéria.
Adição da enzima Top-isomerase, que realiza a compactação dos plasmídeos (eles se “enrolam”).
Há adição de detergente SDS, que degrada as membranas das bactérias, e de NaOH, para separar a dupla fita de DNA que compõe cada cromossomo bacteriano. Entretanto, a concentração utilizada não é suficiente para separar a dupla fita dos plasmídeos, pois esta é mantida por ligações muito mais fortes que o DNA normal.
Adiciona-se acetato, que retira a água do meio, e ácido acético, que diminui o pH.
Após centrifugação, retira-se o sobrenadante. O DNA plasmidial é precipitado com álcool (etanol 100%, 2x o volume da solução); o álcool diminui a concentração de sal na solução.
Após uma nova centrifugação, o DNA plasmidial é ressuspendido com água e “lavado” com álcool 70%, que retira o sal do DNA.
Seca-se o DNA
Neste DNA plasmidial há uma seqüência lateral totalmente conhecida e um enxerto desconhecido. Um primer é ligado a este enxerto através de uma Taq-polimerase especial, retirada de organismos que habitam fontes termais e que, portanto, resiste melhor a altas temperaturas. A partir disso, pode-se realizar a amplificação do DNA, ou PCR.
No PCR ocorre:
Desnaturação do DNA (100ºC)
Anelamento do primer (à temperatura mais baixa)
Adição de Taq-polimerases, deoxinucleotídeo (em maior proporção) e dideoxinucleotídeo (em menor proporção)
Em cada ciclo de PCR, o fragmento de DNA é completado com deoxinucleotídeos ou dideoxinucleotídeos. Com diversos ciclos de PCR, muitos fragmentos de DNA incorporam os dideoxinucleotídeos, os quais impedem a adição de mais nucleotídeos.
Os fragmentos que incorporaram os dideoxinucleotídeos são seqüenciados. O seqüenciador é como se fosse uma câmara de eletroforese grande, com uma câmera que capta a fluorescência produzida quando um feixe de laser esbarra em um fragmento de DNA contendo o dideoxinucleotídeo. Cada case emite uma fluorescência diferente. O resultado produzido é um eletroferograma.
Esta técnica, contudo, apresenta limitações. O máximo de pares de bases que podem ser seqüenciadas é 700 e, após muitos ciclos de seqüenciamento, ocorre a sobreposição das porções já seqüenciadas. 
A clusterização é uma técnica que permite, por sobreposição, “montar” um fragmento de DNA a partir de várias porções que foram seqüenciadas.
Após o seqüenciamento do fragmento completo, esta seqüência gênica obtidaé comparada a outras seqüências já desvendadas e que se encontram disponíveis em bancos de dados, como o BLAST, por exemplo.