Relatório Citologia- MICROSCOPIA OPTICA

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CITOLOGIA 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA: 
INTRODUÇÃO AS FERRAMENTAS DA 
BIOLOGIA CELULAR 
 
 
 
 Professora responsável: Ana Paula Camargo 
 
Alunos: Nicolas Gomes Rodrigues 
 
 
 
 
Abril/2015 
 
 
 
 
 
 
 
Ferramentas da Biologia Celular : Microscopia 
 
Como em todas as ciências experimentais, a pesquisa em biologia celular depende de 
técnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e a função celular. 
Avanços muito importantes na compreensão das células têm sucedido diretamente o 
desenvolvimento de novas técnicas, que permitiram novos meios de investigação.O 
exame das metodologias experimentais disponíveis para a biologia celular é essencial 
para a compreensão tanto da situação atual como do direcionamento futuro dessa área de 
avanço rápido da ciência. 
A fixação do material é essencial para preservar a morfologia e a composição química 
dos tecidos e das células. Consiste na morte destas de maneira tal que as estruturas que 
tinham em vida conservem-se com um mínimo de artifícios. 
Para poder ser observado ao microscópio, o tecido deve ser cortado em lâminas 
delgadas por meio de instrumentos chamados micrótomos. Esta técnica exige que o tecido 
tenha sido incluído em um material qiue lhe confira certa consistência. Se o tecido tiver 
de ser corado com os métodos convencionais, é incluído em parafina ou celoidina. Para 
poder ser infiltrado pelo material de inclusão, o tecido deve ser desidratado. 
 
Microscopia Ótica 
 
Já que a maioria das células é muito pequena para ser vista a olho nu, o estudo das 
células depende fortemente do uso de microscópios. Na realidade, a descoberta das 
células resultou do desenvolvimento do microscópio: Robert Hooke inventou o termo 
“célula” após suas observações de um pedaço de cortiça com um microscópio ótico 
simples, em 1665. 
O microscópio ótico permanece como um instrumento básico dos biólogos celulares, 
com o aperfeiçoamento técnicos permitindo a crescente visualização de detalhes da 
estrutura celular. Os microscópio óticos atuais são capazes de ampliar objetos até mil 
vezes. Já que a maioria das células tem entre 1 e 100 µm de diâmetro, elas podem ser 
observadas por microscopia ótica, como também o podem algumas das organelas 
subcelulares maiores, como núcleo, cloroplastos e mitocôndrias. Entretanto, o 
microscópio ótico não é suficientemente poderoso poderoso para revelar detalhes finos 
da estrutura celular, já que a resolução – a habilidade de um microscópio de distinguir 
objetos separados por distâncias pequenas – é mais importante do que a ampliação. 
Imagens podem ser ampliadas tanto quanto desejado (por exemplo, por projeção em uma 
tela grande), mas a ampliação não aumenta o nível dos detalhes que podem ser 
observados. 
O poder do microscópio ótico foi consideravelmente expandido pelo uso de câmaras 
digitais e computadores para análise e processamento das imagens. Os sistemas 
eletrônicos de análise e processamento de imagens podem melhorar substancialmente o 
contraste das imagens obtidas com o microscópio ótico, permitindo a visualização de 
pequenos objetos que de outro modo não seriam detectados. Por ecemplo, a microscopia 
de contraste de interferência diferencial intensificada por vídeo permite a visualização do 
movimento das organelas através dos microtúbulos, que são filamentos protéicos do 
citoesqueleto com um diâmetro de apenas 0,025 µm. Entretanto, esta amplificação não 
ultrapassa o limite teórico da resolução do microscópio ótico, de aproximadamente 0,2. 
A microscopia ótica tem sido usada no nível de análise molecular por métodos de 
marcação de molécular por métodos de marcação de moléculas especificas, e assim elas 
podem ser visualiazadas no interior das células.7 
 
 
 
A microscopia de fluorescência é um método muito sensível e amplamente usado 
para o estudo da distribuição intracelular de moléculas. Um corante fluorescente é usado 
para marcar a molécula de interesse dentro de células fixadas ou vivas. 
A microscopia confocal combina a microscopia de fluorescência com a análise 
eletrônica de imagens para obter imagens com contraste e detalhes aumentados. 
A microscopia de escitação multifóton é uma alternativa para a microscopia confocal 
que pode ser usada em células vivas. A amostra é iluminada com um comprimento de 
onda de luz que, para excitar o corante fluorescente, necessita da absorção simultânea de 
dois ou mais fótons. 
 
A Microscopia Eletrônica 
 
 Em razão do limite da resolução do microscópio ótico, a análise de detalhes da 
estrutura celular requer o uso de técnicas microscópicas mais potentes – por exemplo, a 
microscopia eletrônica, que foi desenvolvida na década de 1930 e foi usada pela primeira 
vez para a análise de amostras biológicas por Albert Claude, Keith Porter e George Palade 
durante os anos de 1940 e 1950. O microscópio eletrônico pode alcançar uma resolução 
muito maior que a obtida pelo microscópio ótico porque o comprimento de onda dos 
elétrons é menor do que o da luz. 
 Existem dois tipos de microscopia eletrônica, a de transmissão e varredura. A 
microscopia eletrônico de transmissão é similar à observação de células coradas com o 
microscópio de campo claro. As amostras são fixadas e coradas com sais de metais 
pesados, que fornecem contraste através da dispersão de elétrons. Um feixe de elétrons é 
passado através da amostra e focado para formar uma imagem em uma tela fluorescente. 
A microscopia eletrônica de varredura, é usada para dar uma imagem tridimensional das 
células. O feixe de elétrons não passa através da amostra. Em vez disso, a superficie da 
célula é coberta com um metal pesadol, e um feixe de elétrons é usado para varrer a 
superficie da amostra. 
 
A seguir estão listadas as principais partes de um microscópio de luz convencional. 
 
 Parte Mecânica Base, suporte ou pé: Sustenta todo o conjunto do 
microscópio, sua forma é variada, podendo ser retangular ou oval. 
 Braço, coluna ou estativa: Sustenta o tubo do microscópio e se articula com 
a base. 
 Tubo ou Canhão: Suporte das lentes oculares e abriga um prisma. 
 Revólver ou porta-objetivas: Suporte de objetivas, fixado à extremidade 
inferior do tubo, que serve para facilitar a substituição de uma objetiva por 
outra, colocando-as por rotação em posição de observação. 
 Platina: Mesa em miniatura que apresenta um orifício central para a 
passagem da luz, é o local onde se coloca a lâmina, que fica presa por meio 
de pinças ou presilhas, e é desloca da lâmina na platina é efetuado pelo 
charriot (sistema de botões de deslizamento). A platina pode apresentar 
também um sistema de escalas, para a marcação de pontos para o estudo. 
 Macrométrico: Botão giratório que permite movimentos mais amplos da 
platina em direção às objetivas ou vice-versa, localiza-se lateralmente na 
coluna do microscópio. É utilizado na focalização inicial do material de 
estudo na lâmina. 
 
 
 
 Micrométrico: Botão giratório que permite movimentos mais delicados da 
platina em direção às objetivas, ou vice-versa; utilizado para a focalização 
final do objeto. Localiza-se próximo ao macrométrico ou acoplado a ele. 
Atua no ajuste final da focalização do material de estudo na lâmina. Alguns 
microscópios apresentam apenas um parafuso, representando macro e 
micrométrico. 
 Sistema de Iluminação Fonte de luz: Localizada na base do microscópio. 
Fornece os raios luminosos necessários para a observação do material, pode 
ser difusa, pela presença de vidro fosco. 
 Condensador: Conjunto de lentes, situado abaixo da platina, que concentra 
a luz difusa da fonte para a iluminação uniforme do objeto em estudo.O 
botão do condensador, localizado lateralmente, é utilizado para sua 
movimentação. 
 Diafragma: Localizado no plano focal posterior do condensador, regula a 
intensidade do feixe luminoso que chega ao objeto, possibilitando maior 
nitidez da imagem. Alguns microscópios apresentam diafragma na própria 
fonte de luz. 
 Filtros: Normalmente de vidro colorido, servem para absorver parte do 
espectro de radiações luminosas, permitindo utilizar faixas estreitas de 
comprimentos de ondas selecionados. São muito utilizados para aumentar o 
contraste de determinadas estruturas celulares. 
 Sistema Óptico de Observação Lentes Oculares: Sistema de lentes próximas 
ao olho do observador (mono, bi ou trinocular). Aumenta a imagem do 
objeto obtida pelas objetivas. O aumento das lentes oculares em geral é de 8 
ou 10 vezes, e a inscrição Kpl (Kompens Plan), quando presente, indica a 
especificação de correção para campos de visão maiores e planos. 
 Lentes Objetivas: Situadas próximas ao objeto formam uma imagem real e 
invertida do mesmo. Existem vários tipos de objetivas: acromática, fluorita, 
planacromática, apocromática e planapocromática. As objetivas trazem 
inscrições que especificam suas características, por exemplo: 
 
As objetivas podem permitir observação a seco, ou seja, entre a lâmina ou lamínula 
e a objetiva existe apenas o ar; ou de imersão, quando se utiliza entre a lamínula e a 
objetiva um fluido transparente, de índice de refração o mais próximo o possível da lente. 
As objetivas de 100x são sempre de imersão. Em geral são utilizados água, glicerina ou, 
mais comumente, óleo de cedro ou sucedâneo sintético. 
 
Cuidados com o Microscópio 
 
 Verificar o equipamento (microscópio) e materiais a serem utilizados em 
aula; 
 Limpar a lâmina a ser visualizada (com papel fino); 
 Verificar a objetiva, iniciar com a objetiva de menor aumento 
(panorâmica); 
 Ligar corretamente o microscópio (verificar a voltagem); 
 Verificar a intensidade de luz; 
 Verificar charriot, ajustando ao campo de observação; 
 Colocar a lâmina na platina (lamínula na parte superior); 
 Realizar a iluminação de Köhler (ver a seguir); 
 
 
 
 Focalizar o material com os botões macro e micrométrico; 
 Ajustar o campo de visão com o uso do charriot; 
 Ajustar as oculares (distância interpupilar e o foco diferencial para 
binoculares); 
 As mudanças de objetivas devem ser feitas sempre rotando o revólver, 
não as lentes; 
 A cada mudança de objetiva verificar a iluminação e o foco; 
 Ao término do uso do microscópio deixar a objetiva de menor aumento 
selecionada (panorâmica), abaixar a platina, remover a lâmina; 
 Caso tenha sido utilizado meio de imersão limpe com delicadeza a 
objetiva (papel fino). 
 
Iluminação de Köhler 
 
O objetivo da iluminação de Köhler é obter a melhor visualização possível do 
objeto, ajustando a intensidade de luz incidente e sua distribuição uniforme, com a 
centralização da fonte de luz. Segue a descrição resumida do passo a passo da iluminação 
de Köhler: 
 
 Utilizar primeiramente a objetiva de 10x; 
 Posicionar o material a ser observado; 
 Levantar completamente o condensador (com o uso do respectivo botão); 
 Fechar o diafragma de campo e o do condensador em 2/3; 
 Abaixar lentamente o condensador até que se visualize nitidamente o 
diafragma de campo (forma a imagem de um octógono, as bordas devem ser 
bem nítidas); 
 Centralizar a imagem observada com o uso dos dois parafusos pequenos 
frontais no condensador; 
 Abrir o diafragma de campo até a imagem do octógono desaparecer; 
 Ajuste o contraste com a abertura do diafragma de campo para a 
visualização ideal da imagem 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
ROBERTIS, Eduardo de; HIB, José. Bases da Biologia Celular e Molecular. 4. ed.- Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 2006. 
COOPER, Geofrey M; HAUSMAN, Robert E. A Célula: uma abordagem molecular. 3. ed. – Porto 
Alegre: Artmed, 2007. 
MELLO,MLS; VIDAL,BC. Práticas de Biologia Celular, Ed. Edgard Blucher Ltda, 1980.