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ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 0 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ ADJANNA KARLA LEITE ARAÚJO ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO INDUZIDO POR Ouratea sp. FORTALEZA – CEARÁ 2010 ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 1 ADJANNA KARLA LEITE ARAÚJO ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO INDUZIDO POR Ouratea sp. FORTALEZA-CE 2010 FORTALEZA – CEARÁ 2010 Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro Co-orientadora: Profª. Drª. Regina Célia Bressan Queiroz de Figueiredo ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 2 A663a Araújo, Adjanna Karla Leite Aspectos morfológicos do processo de cicatrização induzido por Ouratea sp. / Adjanna Karla Leite Araújo – Fortaleza, 2010. 177 p. ; il. Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. 1. Ouratea sp. 2. Batiputá. 3. Óleos vegetais. 4. Pele. 5. Cicatrização. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. CDD: 636.089 ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 3 ADJANNA KARLA LEITE ARAÚJO ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO INDUZIDO POR Ouratea sp. Aprovada em: ____/____/_______. BANCA EXAMINADORA __________________________________________________________ Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro (Orientadora) Universidade Estadual do Ceará – UECE __________________________________________________________ Profª. Drª. Virgínia Cláudia Carneiro Girão Universidade de Fortaleza – UNIFOR __________________________________________________________ Profª. Drª. Érika Freitas Mota Universidade Federal do Ceará – UFC Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 4 “Aos inesquecíveis animais utilizados nos experimentos, que olham questionando o que ocorre, que sentem dor, medo e não compreendem, que não entendem a dor, a perda da liberdade, que lambem as mãos do algoz confundindo-o com um amigo”. Dedico este trabalho. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 5 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fundação Instituto Oswaldo Cruz- PE. À Professora Doutora Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro. À Professora Doutora Regina Célia Bressan Queiroz de Figueiredo. Aos colaboradores. À banca examinadora. À minha família. Aos amigos. ... ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 6 Resumo O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do óleo de Ouratea sp. (Batiputá) sobre a cicatrização de feridas cutâneas em modelos experimentais in vivo. O óleo vegetal foi adquirido comercialmente em Fortaleza, Ceará, Brasil, e analisado química e microbiologicamente. As feridas cutâneas foram induzidas no dorso de camundongos distribuídos em três grupos: Grupo I tratado com NaCl a 0,9%; Grupo II tratado com óleo de Helianthus annus (grupo de referência) e Grupo III tratado com óleo de Ouratea sp. Todos os animais receberam 100 µL de cada tratamento aplicado na lesão, diariamente, por 12 dias consecutivos. Fragmentos das lesões foram coletados nos dias 2, 7 e 12 para avaliações histológicas e morfométricas. As avaliações dos parâmetros macroscópicas e a mensuração da área da lesão foram realizadas diariamente. O óleo de Ouratea sp. apresentou como principais constituintes os ácidos linoléico (40,88%) e oléico (28,29%). O óleo de Ouratea sp. apresentou efeito cicatrizante semelhante ao óleo de H. annus (p>0,05) e induziu inflamação em relação ao Grupo tratado com NaCl a 0,9% (p<0,05). O óleo de Ouratea sp. iniciou o processo de retração da área da lesão no 4º dia, enquanto que o óleo de H. annus e NaCl a 0,9% iniciaram o processo de retração da área da lesão no 7º e 6º dia, respectivamente (p<0,05). O tratamento com o óleo de Ouratea sp. apresentou uma colagenização mais acentuada quando comparado aos outros tratamentos (p<0,05). Estes efeitos podem estar associados aos altos níveis de ômega-6 e ômega-9 presentes nesse óleo. Concluiu-se que o óleo de Ouratea sp. auxiliou e acelerou o processo de cicatrização, mostrando potencial terapêutico sobre as lesões cutâneas, comprovando, desta forma, o seu uso popular como agente cicatrizante. Palavras-chave: Ouratea sp., Batiputá, Óleos vegetais, Cicatrização, Pele. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 7 Abstract The aim of this study was to evaluate the oil effects of Ouratea sp. on skin healing in experimental models in vivo. The vegetable oil was purchased commercially in Fortaleza, Ceará, Brazil, and analyzed chemically and microbiologically. The wounds were induced on the backs of mice divided into three groups: Group I treated with NaCl 0.9%; Group II treated with oil of Helianthus annus (reference group) and Group III treated with oil of Ouratea sp. All animals received 100 µL of each treatment applied to the lesion daily for 12 consecutive days. Lesion fragments were collected on days 2, 7 and 12 for histological and morphometric evaluations. The evaluations of the macroscopic parameters and the measurement of lesion area were performed daily. Ouratea sp. oil presented as the main constituents linoleic (40.88%) and oleic (28.29%). Ouratea sp. oil showed healing effect similar to oil of H. annus (p> 0.05), and induced inflammation in relation to the group treated with NaCl 0.9% (p <0.05). Ouratea sp. oil began the process of shrinkage of the lesion area on day 4, while the H. annus oil and NaCl 0.9% started the process of shrinkage of the lesion area in the 7th and 6th, respectively (p <0.05). The treatment with Ouratea sp. oil showed a more marked collagen when compared to other treatments (p <0.05). This effect may be associated to the high levels of omega-6 and omega-9 present in this oil. It was concluded that Ouratea sp. oil presents a great therapeutic potential in a model of cutaneous wound healing. Keywords: Ouratea sp., Batiputá, Vegetables oils, Wound healing, Skin. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Fatores de crescimento envolvidosno processo cicatricial de lesões cutâneas. Tabela 2 Composição química qualitativa e quantitativa do óleo de Ouratea sp. Tabela 3 Avaliação macroscópica durante os dias de tratamento. Tabela 4 Avaliação histológica comparativa do efeito cicatrizante dos tratamentos administrados nas feridas – Aspectos qualitativos. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Camadas e estruturas da pele. Figura 2 Cadeias polipeptídicas - Formação da fibra colágena. Figura 3 Esquema de uma lesão cutânea. Figura 4 Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas. Figura 5 Fases sequenciais do processo de cicatrização. Figura 6 Evolução do nº relativo de células nas fases da cicatrização. Figura 7 Ouratea sp. Figura 8 Procedimento cirúrgico para realização da lesão. Figura 8A Molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm). Figura 8B e C Divulsionamento da pele. Figura 8D Ferida realizada. Figura 9A Bancada para Microtomia. Figura 9B e C Visão em detalhes do processo histológico. Figura 9D Processo de coloração das lâminas. Figura 10A Equipamento utilizado para realização da morfometria. Figura 10B e C Visão em detalhes do software utilizado. Figura 11 Paquímetro Digital. Figura 12 Cromatograma de íons totais (TIC) do óleo de Ouratea sp. Figura 13 Aspectos Macroscópicos das lesões. Figura 14 Avaliação microscópica das lesões, Coloração H/E. Figura 15 Efeito dos tratamentos sobre a área da lesão (cm2) ao longo dos dias. Figura 16 Porcentagem da deposição de colágeno durante o tratamento. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 10 LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS EGF Fator de crescimento epidérmico FGF Fator de crescimento de fibroblastos TGF-β Fator de crescimento transformante beta TGF- α Fator de crescimento transformante alfa TNF-α Fator de necrose tumoral alfa VEGF Fator de crescimento endotelial vascular PGDF Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta KGF Fator de Crescimento de Queratinócitos IL1α Interleucina 1alfa IL2 Interleucina 2 ILβ Interleucina beta PMN Polimorfonucleares FC Fator de crescimento NO Óxido Nítrico C3a Complemento 3a C5a Complemento 5a RLO Radicais livres de oxigênio MAF Fator ativador de macrófagos MBP Proteína Básica Principal CL células de Langerhans kg Quilograma g grama L Litro m Metro mg Miligrama min Minuto mL Mililitro µL Microlitro mm Milímetro µm Micrômetro h Hora IM Intramuscular He Gás hélio µg Micrograma p.o. pós-operatório PBS Solução salina fosfato- tamponada M Molar pH Pontes de Hidrogênio H/E Hematoxilina/Eosina TM Tricrômico de Masson ANOVA Análise de variância TIC Cromatograma de íons totais SPU Sistema de Protocolo Único COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CPqAm Centro de pesquisas Aggeu Magalhães FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz PADETEC Parque de desenvolvimento Tecnológico ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 11 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 12 2.REVISÃO DE LITERATURA 14 2.1 Morfologia e Fisiologia da Pele 14 2.1.1 Epiderme 14 2.1.2 Derme 16 2.1.3 Colágeno 18 2.2 Processo de Cicatrização 19 2.2.1 Fase Hemostática 22 2.2.2 Fase Inflamatória 23 2.2.3 Fase Proliferativa 24 2.2.4 Fase de Remodelação 25 2.3 Plantas Medicinais 27 2.3.2 Ouratea sp. 29 3. JUSTIFICATIVA 31 4. HIPÓTESE CIENTÍFICA 32 5. OBJETIVOS 33 5.1 Objetivo Geral 33 5.2 Objetivos Específicos 33 6. MATERIAL E MÉDOTOS 34 6.1 Óleo Vegetal 34 6.1.1Análise Fitoquímica 34 6.2 Animais 34 6.2.1 Procedimento cirúrgico 35 6.2.2 Tratamento da lesão 36 6.2.3 Análises Histológicas 36 6.2.4 Análise Morfométrica 37 6.2.5 Análise Macroscópica 37 6.2.6 Contração da área da lesão 37 6.3 Análise Estatística 38 7. RESULTADOS 39 7.1 Análise química do óleo de Ouratea sp. 39 7.2 Avaliação Macroscópica 40 7.3 Análises Histopatológicas 41 7.4 Contração da Área da Lesão 43 7.5 Análise Morfométrica 44 8. DISCUSSÃO 45 9. CONCLUSÃO 49 10. PERSPECTIVAS 50 11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51 ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 12 1 INTRODUÇÃO A pele exerce funções consideradas vitais para os animais, tais como: proteção mecânica contra a entrada de micro-organismos, a regulação térmica e proteção contra a perda corpórea de água, eletrólitos e macromoléculas. Neste sentido, as dermatopatias assumem papel importante na clínica médica veterinária e estão inseridas entre as principais patologias que acometem os animais. O tecido epitelial que constitui a pele apresenta uma grande coesão entre suas células, mas é sensível a solução de continuidade, que pode ocorrer devido a algum tipo de acidente tais como: mordeduras de animais, cortes produzidos por objetos, intervenções cirúrgicas, queimaduras, ou ainda aqueles provocados por enfermidades como alergias (picada de pulgas) e endocrinopatias (hipotireoidismo), expondo o tecido conjuntivo subjacente (Nitz et al., 2006). O processo de cicatrização é caracterizado pela sucessão complexa de eventos celulares e moleculares que interagem e se sobrepõem para a reconstrução tecidual em resposta à lesão. Este processo envolve os eventos da inflamação, proliferação celular, deposição de matriz extracelular, remodelação do tecido, colagenização e epitelização (Carvalho et al., 2002). No entanto, os mecanismos moleculares e bioquímicos envolvidos na regulação da reparação tecidual ainda não estão completamente elucidados (Carvalho, 2002; Park e Barbul, 2004; Mendonça, 2009). Com as possibilidades de uma solução de continuidade de qualquer origem, infeccionar, desenvolver excesso de tecido conjuntivo, gerar uma contratura da pele ou até mesmo tornar-se uma ferida crônica, é de grande importância uma cicatrização rápida e controlada, diminuindo os possíveis efeitos negativos que possam acometer o paciente, bem como o tempo de morbidade desse indivíduo (Smith et al., 2000). Neste sentido, protocolos terapêuticos são utilizados para favorecer o processo cicatricial, como resultados de intensas pesquisas para desenvolver os melhores agentes promotores da cura. A fitoterapia acompanha a humanidade desde os tempos primitivos e, o homem durante toda sua evolução, utilizou-se de plantas para a cura dos seus males e injúrias, mesmos que empiricamente. Acredita-se que 70% dos medicamentos derivados de plantas tenham sido desenvolvidos com base no conhecimento folclórico (Garcia et al., 2003). Algumas pesquisas científicas que têm como base a comprovação da identidade botânica, composição química de compostos vegetais e análises de princípios ativos, ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 13 tem tornado possível a identificação e caracterização de vários princípios químicos que representam não apenas um novo grupo de substâncias, mas a descoberta de novas intervenções terapêuticas, inclusive nas doenças de origem cutânea como feridas , cortes ou queimaduras (Ferreira, 2008; Govindrajan et al., 2007). Entre as plantas utilizadas pelas populações por possuírem efeito cicatrizante destacam-se: Amburana cearensis (Allemão) A. C. Sm. (Cumarú), Kalanchoe brasiliensis Cambess (Courama), Cajanus cajan (L.) Millsp (Feijão cuandu), Ximenia americana L. (Ameixa), Astronium urundeuva (Allemão) Engl. (Aroeira-do-sertão), Helianthus annus Linné (girassol). Plantas pertencentesao gênero Ouratea, apresentam propriedades antimicrobiana e anti-inflamatória e, têm sido utilizadas na medicina popular no tratamento de doenças da pele. Apesar do seu uso tradicional, esta planta, ainda não possui sua eficácia comprovada cientificamente. Neste sentido, o presente trabalho tem tem como objetivo avaliar o potencial de cicatrização do óleo de Ouratea sp. em modelo experimental murino, e espera-se contribuir para aumentar os conhecimentos sobre a ação farmacológica observada na utilização empírica do óleo de Ouratea sp. no tratamento das afecções cutâneas. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Morfologia e Fisiologia da pele O tecido epitelial, a depender do órgão no qual se localiza, desempenha várias funções no organismo, tais como: proteção do corpo, absorção e secreção de substâncias do meio e percepção de sensações. Os tecidos epiteliais são classificados em dois tipos principais: epitélio glandular e epitélio de revestimento. O epitélio glandular é especializado na produção e eliminação de secreções e, o epitélio de revestimento tem como principal função a proteção das estruturas internas do organismo (Kumar et al., 2005). Dentre os tecidos epiteliais de maior importância encontra-se a pele, considerada o maior órgão do corpo, recobrindo toda a sua superfície externa. A pele pode ser considerada como primeira linha de defesa do organismo, constituindo uma barreira mecânica, promovendo proteção imunológica, termorregulação e secreção. Esta estrutura é dividida em duas camadas distintas, a epiderme e a derme que estão firmemente unidas entre si (Santos et.al., 2000). A camada subcutânea adiposo subcutânea, situada abaixo da derme também conhecido como hipoderme também tem a mesma origem embrionária da derme, porém não faz parte dela (Fig.1). A hipoderme aumenta o isolamento da pele e é responsável pela união da pele com os órgãos adjacentes e a protege das lesões causadas por pressão ou estiramento (De Almeida, 2009). 2.1.1 - A epiderme A epiderme é constituída por um epitélio estratificado pavimentoso, queratinizado caracterizado por células dispostas em várias camadas. A epiderme serve como barreira que protege o organismo contra o estresse ambiental, tais como: invasão por micróbios, perda de água e injúrias mecânicas e térmicas. Para desempenhar esse papel, a epiderme conta com uma variedade de apêndices, incluindo unhas, folículos pilosos, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas (De Almeida, 2009). A epiderme é subdividida em cinco camadas ou estratos. A partir da camada mais interna para a superfície encontram-se: o estrato basal, o estrato espinhoso, o estrato granuloso, o estrato lúcido e o estrato córneo. Estes estratos refletem a ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 15 progressão das células germinativas, encontradas na base, para células corneificadas diferenciadas, presentes na superfície (De Almeida, 2009). O estrato basal também chamado de germinativo é uma camada contínua de célula e pode ser considerado como um local onde as células são diferenciadas e altamente proliferativas. Suas células são prismáticas ou cúbicas e repousam sobre a membrana basal a qual separa a epiderme da derme. O estrato espinhoso é formado por células poligonais cúbicas ou ligeiramente achatadas – células de Malpighi, as quais possuem mais queratina do que as da camada basal. As células de Malpighi formam junções celulares ricas em desmossomos e ao migrarem para a camada espinhosa tornam-se progressivamente mais achatadas e começam a produzir grânulos intracelulares. Possuem pequenas expansões citoplasmáticas que contem tonofibrilas as quais propocionam resistência ao atrito. O estrato granuloso é formado por células achatadas que possuem grânulos de queratina e como substância extracelular, lipídeos e proteínas (colágeno). Algumas células do estrato granuloso possuem grânulos revestidos por membrana denominados corpos lamelares que são revestidos principalmente por lipídeos, os quais conferem a impermeabilidade da pele. O estrato lúcido é constituído por uma camada acidófila, cujas células não mais possuem organelas e apresentam núcleo picnótico, não é visível em toda região do corpo e está presente apenas em áreas nas quais a pele é mais espessa, como as regiões palmo- plantares. O estrato córneo é a camada mais externa constituídas por células mortas e achatadas e citoplasma repleto de queratina (De Almeida, 2009). A epiderme deve se renovar constantemente ao longo de sua vida para manter a homeostase e para reparar danos após ferimentos. A capacidade regenerativa do epitélio e sua homeostase dependem do balanço entre a proliferação e diferenciação/apoptose de seu principal tipo celular, os queratinócitos (Pincelli e Marconi, 2010), os quais produzem a queratina, uma proteína resistente e permeável responsável pela proteção (barreira física). Tradicionalmente essas células têm sido consideradas constituintes inertes das camadas múltiplas da epiderme, no entanto estudos atuais têm reconhecido o papel ativo destas células na renovação epidérmica desempenhado também papel chave na defesa imune da pele, sob condições de homeostase, acredita-se que células progenitoras dos queratinócitos se dividem e terminam por diferenciar-se e construir as camadas sobrepostas da epiderme. Em oposição a esse processo coordenado de equilíbrio estão os sinais de ferimentos e inflamação. Ambos alteram o destino dos queratinócitos e sua resposta ao ambiente através de alterações nas suas moléculas de ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 16 adesão e receptores de superfície, disparando uma resposta inflamatória imediata em termos de secreção de citocinas e peptídeos antimicrobianos. Quando não controladas essas respostas podem levar a lesões severas da pele, incluindo as desordens inflamatórias crônicas (Suter et al. 2009). Entre outras células presentes na epiderme temos as células de Langerhans (CL), as quais são células dendríticas residentes da epiderme nas mucosas e na pele. Na pele as CL funcionam como sentinelas, com função de captar, processar e apresentar antígenos aos linfócitos T. Estes últimos quando ativados multiplicam-se e produzem citocinas e outros mediadores responsáveis pela defesa do organismo contra essas invasões (Cunningham et al. 2010). Os melanócitos são células dendríticas encontrados na camada basal da epiderme e são responsáveis pela produção de melanina, substância pigmentar que é produzida e armazenada em estruturas citoplasmática denominadas melanossomas. Os melanossomas maduros acumulam-se na periferia celular, e são subsequentemente transferidos via processos dendríticos aos queratinócitos vizinhos, onde desempenharão papel importante na fotoproteção contra os raios ultravioletas, conferindo também cor a pele, aos pelos e cabelos (Schiaffino, 2010). Menos abundantes na epiderme, estão as células de Merkel as quais formam terminações nervosas livres e especializadas conhecidas como corpúsculo de Merkel. Estas células estão em íntima associação com as terminações nervosas e possuem vesículas citoplasmáticas que funcionam como mecano-receptores (Dângelo et. al. 1988). 2.1.2 – Derme A derme está localizada logo abaixo da epiderme conferindo e permitindo uma base firme para sua sustentação. Apresenta uma complexa organização, com um tecido conjuntivo rico em vasos, glândulas sebáceas e sudoríparas, folículos pilosos e corpúsculos tácteis. O controle do fluxo sanguíneo dos plexos vasculares presentes na derme é feito por estímulos oriundos do hipotálamo e das fibras nervosas simpáticas, e além da nutrição,proporcionam o mecanismo de termorregulação. As terminações nervosas sensoriais mantêm o indivíduo em contato com o meio ambiente (Arnold et al., 2002). A derme pode ser dividida em duas camadas: a camada papilar/subepitelial mais superficial, na qual são encontradas as papilas dérmicas, as fibras conjuntivas frouxas e as fibras elásticas que estão perpendiculares à junção dermoepidérmica, sendo esta ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 17 camada bastante vascularizada. E a camada reticular que é mais profunda, mais densa, na qual são encontradas as fibras conjuntivas não-remodeladas e as fibras elásticas em plexos. Feixes de fibras colágenas e elásticas estão localizados na substância fundamental amorfa a qual é constituída por glicosaminoglicanas formando o tecido conjuntivo dérmico (De Almeida, 2009). Diferentes tipos celulares compõem a derme, tais como: fibroblastos e fibrócitos, células imunológicas - macrófagos, mastócitos e leucócitos sangüíneos, particularmente neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos (Arnold et al., 2002). Os fibroblastos são células fusiformes, com núcleo oval e que participam da síntese dos componentes da matriz extracelular permitindo e promovendo a formação do tecido de granulação, levando a reepitelização, garantindo a manutenção da integridade do tecido conjuntivo. Portanto são as principais células envolvidas no processo de cicatrização (Carvalho, 2002; Amadeu et al., 2003; Pagnano et al., 2008). Os fibroblastos são capazes de sintetizar fibras colágenas, elastina, fibronectina, glicosaminoglicanas e proteases, sendo também responsáveis pelo debridamento e remodelamento fisiológicos da célula (Hildebrand et al., 2005). Os fibrócitos são encontrados em vários tecidos, tanto em condições fisiológicas quanto patológicas (Bucala et al., 1994). Eles são considerados importantes no processo cicatricial por contribuírem no mecanismo de formação do granuloma, na atividade antigênica, na produção de colágeno e da matriz extracelular. Participam também na remodelagem da pele e nos processos inflamatórios, através da produção de fatores de crescimento e fatores angiogênicos, (Abe et. al.; Metz, 2002; Quan, 2004). Estas células são derivadas de precursores da medula óssea e contribuem para a presença de miofibroblastos no tecido cicatricial (Mori et al., 2005). A hipoderme é a camada mais profunda do tecido epitelial e composta principalmente por células adiposas (tecido conectivo gorduroso). É um depósito de gordura de reserva, um isolante térmico e protege o organismo mecanicamente (Harris, 2005). ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 18 2.1.3 – Colágeno Os colágenos pertencem a uma família de proteínas da matriz extracelular (MEC) que desempenha um papel importante na manutenção da estrutura de vários tecidos e também possuem outras importantes funções, como por exemplo: adesão celular, quimiotaxia, migração (Heino et al., 2009). A relação dinâmica entre as células e o colágeno regula a remodelagem do tecido durante o crescimento, diferenciação, morfogêneses e cicatrização bem como estão envolvidos em várias patologias (Heino et al., 2009). Todas as moléculas de colágenos consistem em três cadeias polipeptídicas chamadas cadeias α, e contém no mínimo um domínio composto por sequências repetitivas de gly–X–Y. A presença de glicina (gly–X–Y) é essencial para empacotamento dessa estrutura helicoidal (Fig 2). O X e o Y pode ser qualquer aminoácido, porém a prolina é normalmente encontrado na posição X enquanto a posição Y é frequentemente ocupada pela 4-hidroxiprolina. Estas últimas são particularmente importante para estabilidade da proteína. Os colágenos são uma das mais abundantes proteínas no corpo, constituindo 30% de massa protéica. As superfamílias dos colágenos podem ser subdividas com base na forma de associação ou outras características sendo numeradas de I a XXVII de acordo com sua ordem de descobrimento. Alguns colágenos são restritos em determinados tipos de tecido: por exemplo, tipo II e X e XI são exclusivamente encontrado nas cartilagens; a família do tipo IV nas membranas basais; e tipo XVII nos hemidesmossomas da pele. Por outro Fig1: Camadas e estruturas da pele. Fonte: Banco de Imagens Free (Stock.Xchng version 6.00, 2010). ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 19 lado, alguns tipos de colágenos são encontrados na maioria das MECs. As fibrilas do colágeno frequentemente consistem de mais que um tipo de colágeno (Myllyharju et. al. 2004). 2.2 Processo de Cicatrização A cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve a organização de células, sinais químicos e remodelamento MEC com objetivo de reparar tecido lesionado. Por sua vez, o tratamento de feridas busca o fechamento rápido da lesão de forma a restabelecer a integridade do tecido lesionado. Diante disso é imprescindível a compreensão do processo biológico da cicatrização de feridas e regeneração tecidual (Mendonça, 2009). Com o rompimento tecidual nos animais vertebrados logo se inicia o processo de reparo ou cicatrização (Potter e Perry, 2003; Ferreira et al., 2008). Uma ferida pode ser definida como qualquer lesão que leve a uma descontinuidade cutânea (Fig 3), existindo várias causas, entre as quais as mais frequentes são: o trauma (mecânico, físico ou químico), a isquemia, a pressão no local e devido a procedimentos cirúrgicos (Strodtbeck, 2001). Baseado na natureza do processo de reparação, as feridas podem ser classificadas como agudas ou crônicas. Sua classificação constitui importante forma de sistematização necessária para o processo de avaliação. Feridas agudas são injúrias causadas por corte ou incisão cirúrgica que completam o processo de cicatrização dentro do tempo esperado. Em contraste, estão às feridas crônicas que são injúrias teciduais aonde a cicatrização ocorre de forma lenta Fig.2: Cadeias polipeptídicas - Formação da fibra colágena. Stock.Xchng version 6.00, 2010). ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 20 devido a repetidos insultos ao tecido e também a um processo patológico secundário que interfira na organização e duração do processo cicatricial. (Strodtbeck, 2001, Blanes, 2002). Outra classificação refere-se às estruturas comprometidas, e consiste na descrição anatômica da profundidade da ferida, que engloba: a ferida superficial (limitada à epiderme), a ferida com perda parcial (limitada à epiderme e porção superior da derme) e a ferida com perda total (quando há destruição da epiderme, derme, tecido subcutâneo, podendo invadir músculos, tendões e ossos). Este sistema é adotado para estadiar alguns tipos de feridas crônicas, como as úlceras por pressão e as queimaduras (Santos, 2000). O processo de cicatrização é didaticamente dividido nas seguintes fases: a) hemostática; b) inflamatória; c) proliferativa ou de granulação e d) de remodelação da matriz extracelular (Fig 4 e 5). Diferentes tipos de células, matriz extracelular, proteínas e seus receptores estão envolvidos no processo biológico da cicatrização, o qual é mediado por citocinas e fatores de crescimento (Tabela 1). A liberação de vários fatores de crescimento na ferida, como fator de crescimento derivado plaqueta-PDGF, fator de crescimento epidérmico-EGF, fator de crescimento básico de fibroblastos-FGF, fator de crescimento transformante beta-TGF-β1, e o fator de crescimento transformante alfa-TGF-α, afetam o recrutamento, a ativação, a migração e a diferenciação de células no leito da ferida (Ferreiraet al., 2008). Entre as proteínas da matriz envolvidas neste processo estão a fibronectina, laminina, tenascina e colágeno. Estas proteínas são de extrema importância por estarem envolvidas na fase inicial da cicatrização das feridas, pois interagem entre si e apoiam a adesão de fibroblastos com as células endoteliais (Pereira et al., 2005). Fig. 3: Esquema de uma lesão cutânea. Fonte: Banco de Imagens Free (Stockxchng version 6.00, 2010). ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Fig. 4: Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas. in Molecular Medicine Fig. 5: Fases sequenciais do processo de cicatri http://patologiafacil.blogspot.com . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas. Fonte: Experts Reviews olecular Medicine©. Fases sequenciais do processo de cicatrização em função do tempo em dias. http://patologiafacil.blogspot.com , 2010. . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 21 Experts Reviews em função do tempo em dias. Fonte: ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 22 2.2.1 Fase Hemostática Esta fase inicia-se no momento da injúria e permanece por algumas horas. A primeira resposta dos vasos sanguíneos à lesão é a vasoconstricção mediada por componentes vasoativos (catecolaminas), limitando, desta forma, a hemorragia e o subsequente extravasamento de fluido e proteína. A vasoconstricção é seguida por uma fase de vasodilatação e um aumento da permeabilidade vascular, onde se acredita que a histamina seja o mediador bioquímico responsável (Mandelbaum et al., 2003). Com o aumento da permeabilidade vascular, há o extravasamento de fluidos e proteínas para o espaço extravascular. Consequentemente ocorre a diapedese de células. Neste ponto, fatores de coagulação liberados pelas células lesadas, ativam a via extrínseca da coagulação e da agregação plaquetária, expondo o colágeno da pele lesada o qual ativará a via intrínseca da coagulação (Theoret, 2004). Fator de Crescimento Fonte Efeito Fator de Crescimento de Fibroblastos (FGF) 1, 2 e 4 Macrófagos, cél. endoteliais Proliferação dos fibroblastos e angiogênese Fator de Crescimento Transformante-α (TGF-α) Macrófagos, queratinócitos Reepitelização Fator de Crescimento Transformante- β1 e β2 (TGF-β1 e β2) Plaquetas, macrófagos Quimiotaxia de fibroblastos e macrófagos; síntese da MEC; secreção de inibidores da protease Fator de Crescimento Epidermal (EGF) Plaquetas Reepitelização Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta (PGDF), isoformas AA, AB e BB Plaquetas, macrófagos, queratinócitos Quimiotaxia de fibroblastos e macrófagos, proliferação de fibroblastos e síntese da MEC Fator de Crescimento de Queratinócitos (KGF) Fibroblastos da derme Proliferação de queratinócitos Interleucina 1α e β (IL1α e ILβ) Neutrófilos Ativa a expressão do FC em macrófagos, queratinócitos e Fibroblastos Tabela 1: Fatores de crescimento (FC) envolvidos no processo cicatricial de lesões cutâneas (Aukhil, 2000). ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 23 A indução das plaquetas pela trombina resulta na liberação, por degranulação de uma variedade de fatores de crescimento e substâncias vasoativas, tais como: PDGF, TGF- α e β, FGF, EGF e VEGF, tromboglobulina, fator plaquetário-4, serotonina, bradicinina, prostagladinas, prostaciclinas, troboxanos e histamina. A degranulação das plaquetas também inicia a cascata do complemento com a formação de C3a e C5a, potentes anafilotoxinas que promovem a liberação da histamina pelos basófilos e mastócitos. Além de glicoproteinas adesivas como a fibronectina e trombospondina, as quais são importantes constituintes da matriz extracelular provisória (Strodtbeck, 2001; Mandelbaum et al., 2003; Midwood et al., 2004). Com a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea formam um coágulo de células e fibrina que promovem a hemostasia, forma-se um selo temporário sobre o sítio da injúria e prevenindo a eventual entrada de microrganismos, além de formar um suporte para a migração celular a qual é na realidade uma matriz extracelular provisória sobre a qual fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos ingressam na ferida. Esta matriz é composta por proteínas adesivas como: fibrina, fibronectina, trombospondina, vitronectina e fator de Willebrand, fornecendo resistência limitada à ferida (Stashak, 2004; Theoret, 2004). Com o passar do tempo, essa matriz provisória é substituída por um tecido de granulação rico em fibronectina que fornece um leito vascularizado para deposição de colágeno (Midwood et al., 2004). Isto serve como processo inicial e amplificador para a próxima fase da cicatrização (Ferreira et al., 2007). 2.2.2 Fase Inflamatória A fase inflamatória é caracterizada pela resposta vascular e celular, cuja intensidade depende da gravidade da injúria. O início da fase inflamatória e sua intensidade estão correlacionados com a boa irrigação e perfusão sanguínea (Theoret, 2005). Seu início se dá pela liberação de vários mediadores a partir de células e capilares danificados (plaquetas ativadas, citocinas e fatores de crescimento) que possibilitam a passagem de células para o local da lesão. Os principais componentes celulares de uma ferida são os leucócitos polimorfonucleares (PMN) e os macrófagos (Strodtbeck, 2001). Os neutrófilos fornecem proteção à ferida contra a contaminação por meio da fagocitose de detritos celulares e bactérias (Midwood et al., 2004). Quando ativados, ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 24 secretam radicais livres de oxigênio (RLO) e enzimas lisossômicas como proteases, colagenases e elastases que ajudam a combater uma possível infecção. Além de sua função fagocitária, os neutrófilos possuem ação pró-inflamatória exercida através da liberação de citocinas que ativam fibroblastos e queratinócitos. Caso a ferida não esteja severamente infectada, em poucos dias o número de neutrófilos diminui devido à fagocitose por macrófagos. Depois de um ou dois dias, monócitos teciduais infiltram-se no local da lesão e se diferenciam em macrófagos finalizando a fase inflamatória (Werner e Grose, 2003; Martin, 2005). Uma vez no local da lesão os macrófagos realizam intenso processo de debridamento. De maneira similar aos neutrófilos exercem atividade microbiana através da fagocitose e da liberação de oxigênio, de óxido nítrico (NO) e de peróxido de hidrogênio (Halper et al., 2003). Os fatores mitogênicos e citocinas sintetizadas e liberadas pelos macrófagos são: PDGF, FGF, VEGF, TGF-α e β e o fator-1 de crescimento insulina-like que são necessários para estimular a formação do tecido de granulação e, podem influenciar as fases tardias da cicatrização, como: neovascularização, granulação, fibroplasia e epitelização (Santos, 2000). Quanto aos linfócitos, o seu papel na cicatrização ainda não está bem definido e permanece controverso. Aproximadamente seis a sete dias após a injúria, o número de linfócitos que aparece na ferida é desproporcionalmente menor que na circulação. Os linfócitos secretam linfocinas importantes, incluindo: IL-2, MAF (Fator de Ativação de Macrófagos) e fatores quimiotáticos, além de aumentar o estágio inicial da cicatrização através da estimulação de macrófagos, células endoteliais e fibroblastos. Entretanto, sugere-se que os linfócitos T podem regular a atividade fibroblástica exuberante a qual poderia, caso esta regulação não existisse, ocorrer tardiamentena reparação cicatricial (Mencia-Huerta, 1993). A participação de eosinófilos no processo cicatricial está, aparentemente, associada à produção da Proteína Básica Principal (MBP) a qual age na degradação do tecido (Mencia-Huerta, 1993). 2.2.3 Fase Proliferativa Na reparação do tecido conjuntivo ocorre a formação do tecido de granulação, com proliferação endotelial e de fibroblastos (fibroplasia). Estes últimos são atraídos por estímulos químicos em direção ao leito da ferida, produzindo matriz extracelular e ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 25 angiogênese. Estas células são as principais células envolvidas na cicatrização e surgem por volta do segundo ou terceiro dia após o trauma. Esses eventos são necessários para permitir e promover a reepitelização, no entanto paralelamente a esta fibroplasia, ocorre intensa proliferação vascular (Desmoulière et al, 2005). Macroscopicamente o tecido de granulação apresenta-se com aspecto granuloso e avermelhado. Muitos fibroblastos adquirem alguns aspectos morfológicos e bioquímicos de células musculares lisas, onde essas modificações darão origem aos miofibroblastos (Desmoulière et al, 2005). Estes produzem MEC a qual fornecerá a força mecânica para atividade contrátil, responsável pelo fechamento das feridas após as lesões, processo conhecido como contração da ferida (Tomasek et al., 2002; Gabbiani 2003). Nas feridas, quando ocorre perda total da derme, a epitelização se faz apenas das suas margens, pois não há anexos cutâneos remanescentes. A atividade mitótica do fibroblasto praticamente desaparece em torno do 15º dia, passando a secretar as proteínas presentes no tecido de granulação, produzindo componentes da substância fundamental e o colágeno. A substância fundamental é formada por água, eletrólitos e glicosaminoglicanos, com aspecto semelhante a um gel estando distribuído entre fibras do tecido conjuntivo (Carvalho, 2002). A formação do epitélio é outro fenômeno que ocorre na fase de proliferação, na qual a epitelização faz-se pelo aumento de tamanho, da divisão e da migração das células da camada basal da epiderme por sobre a área de reparação do tecido conjuntivo subjacente (Carvalho, 2002). Adicionalmente, ocorre a fibrose com intensa participação dos fibrócitos. (Abe et al., 2001; Metz, 2002; Quan, 2004). Durante a cicatrização, os fibrócitos podem ser recrutados do tecido adjacente não lesado revertendo-se para o estado de fibroblasto e reativando sua capacidade de síntese (Mori et al., 2005). 2.2.4 Fase de Remodelação ou Maturação Nesta fase ocorrem eventos importantes, como: deposição, agrupamento, remodelação do colágeno e regressão endotelial, ocorre também a diminuição de todos os elementos celulares, inclusive as células inflamatórias (Fig 6). A maturação da ferida tem início durante a terceira semana e caracteriza-se por um aumento da resistência, sem aumento na quantidade de colágeno. A remodelação do colágeno inicia-se na formação do tecido de granulação e mantém-se por meses após a reepitelização. Nessa ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 26 fase ocorre uma tentativa de recuperação da estrutura tecidual normal e, alterações dos elementos da matriz extracelular (Singer, et. al., 1999; Toscano, et. al., 2004). Ocorre, concomitantemente, reorganização da matriz extracelular, que se transforma de provisória em definitiva, cuja intensidade fenotípica, observada nas cicatrizes, reflete a intensidade dos fenômenos que ocorreram, bem como o grau de equilíbrio ou desequilíbrio entre eles. (Gabbiane, et. al., 2003). No entanto, se ocorrer o desequilíbrio desta relação favorecerá o aparecimento de cicatrizes hipertróficas e quelóides. Com a diminuição progressiva dos vasos neoformados, a cicatriz torna-se-á menos espessa, passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (Tazima et al, 2008). Durante a fase inflamatória a liberação de fatores de crescimento por fibroblastos, macrófagos e neutrófilos ativam os queratinocitos localizados nas margens e no interior do leito da ferida. Os eventos dessa fase são regulados por três principais agentes: fatores de crescimento, integrinas e metaloproteases (Santoro et. al., 2005). Dentre os fatores de crescimento destacam-se o PDGF, que induz a proliferação de fibroblastos com consequente produção da matriz extracelular durante a contração da ferida e reorganização da matriz. O KGF7, que é considerado o principal regulador da proliferação dos queratinócitos, assim como o TGF-β, principal responsável pelo estímulo inicial da migração das células epiteliais (Santoro et. al., 2005). A ativação de receptores de integrinas pelos queratinócitos permite a interação com uma variedade de proteínas da matriz extracelular na margem e no leito da ferida. Por outro lado, a expressão e ativação de metaloproteases promovem a degradação e modificação das proteínas da matriz extracelular no sitio da ferida, facilitando a migração celular. A própria atividade proteolítica dessas enzimas pode liberar fatores de crescimento ligados a matriz extracelular, de forma a manter constante o estímulo a proliferação e migração dos queratinocitos, acelerando o processo de reepitelização (Santoro et. al., 2005). Esta fase de maturação perdura por toda a vida da ferida, embora o aumento da força tênsil se estabilize, após um ano, em 70 a 80% da pele intacta (Tazima et al, 2008). ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por 2.3 Plantas Medicinais As plantas medicinais representam a principal fonte de medicamentos utilizada medicina tradicional em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que utiliza o maior número de espécies diferentes. Em geral, o conhecimento popular é adquirido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com a natureza, observando-a de perto no seu dia mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação sistemática e constante (Hamilton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma Ata, em 1978, na qual foi constatado que, no âmbito sanitário, 80% da população mundial utiliza essas plantas ou preparações delas as mais diversas enfermidad No Brasil, cerca de um quinto da população consome 63% dos medicamentos disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural especialmente nas plantas, a única fonte de recurso terapêutico. privilegiado neste aspecto, aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo ( 2007). Destas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no Figura 6: Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais da cicatrização. Fonte: Biologia da ferida e cicatrização, 2008. . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por As plantas medicinais representam a principal fonte de medicamentos utilizada em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que utiliza o maior número de espécies diferentes. Em geral, o conhecimento popular é rido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com a de perto no seu dia-a-dia, e explorando suas potencialidades, mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação sistemática e constante lton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma Ata, em 1978, na qual foi constatado que, no âmbito sanitário, 80% da população ntas ou preparações delas como única fonte de tratamento para as mais diversas enfermidades (Silva, 2003). No Brasil, cerca de um quinto da populaçãoconsome 63% dos medicamentos disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural especialmente nas plantas, a única fonte de recurso terapêutico. O Brasil é privilegiado neste aspecto, pois abriga 55 mil espécies de plantas, compreendendo aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo ( tas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais da cicatrização. Fonte: Biologia da ferida e cicatrização, 2008. . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 27 As plantas medicinais representam a principal fonte de medicamentos utilizada em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que utiliza o maior número de espécies diferentes. Em geral, o conhecimento popular é rido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com dia, e explorando suas potencialidades, mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação sistemática e constante lton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma- Ata, em 1978, na qual foi constatado que, no âmbito sanitário, 80% da população única fonte de tratamento para No Brasil, cerca de um quinto da população consome 63% dos medicamentos disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural, O Brasil é um país abriga 55 mil espécies de plantas, compreendendo aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (Di Stasi, tas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 28 mercado mundial de produtos farmacêuticos, cosméticos e agroquímicos, perspectivas de altos ganhos na economia (Guarrera e Marignoli, 2005). Diante da carência financeira, a fitoterapia é uma alternativa viável para a maioria da população. Se por um lado existe a necessidade de intensificação de estudos potenciais em botânica, visando a descoberta ou comprovação de plantas usadas popularmente, por outro é preciso reverter os conhecimentos adquiridos em benefícios das pessoas e, obter um maior envolvimento da classe médica. Desta forma, diante da importância da fitoterapia e da escassez de pesquisas em Medicina Veterinária, torna-se necessário estudar e aprofundar os efeitos terapêuticos das plantas inseridas no contexto agro-ecológico e social da população (Joshi e Joshi, 2000). A fitoterapia tem sido aplicada há séculos empiricamente, mas atualmente vem recebendo maior atenção dos campos acadêmicos e em estudos científicos. Diversas enfermidades são tratadas ou aliviadas pela utilização de plantas, dentre elas destacam- se as doenças de pele, incluindo-se as feridas. Sendo assim, é de suma importância que novos trabalhos na área sejam desenvolvidos, a fim de aperfeiçoarem os recursos e tecnologias existentes no tratamento de feridas, como também para torná-los mais baratos e acessíveis, principalmente para a classe econômica menos favorecida (Dos Santos, 2009). Assim, apesar da predominância de substâncias sintéticas no arsenal terapêutico, nos últimos anos tem-se verificado a retomada e valorização de práticas terapêuticas consideradas por muitos profissionais de saúde como populares ou não- científicas, inclusive a lenta reincorporação das ervas medicinais como alternativa ou complemento terapêutico. Sendo vários os fitoterápicos testados e usados no processo de cicatrização de feridas cutâneas que se mostraram promissores (Dos Santos, 2009). Muitas plantas contendo óleos fixos são relatadas por suas propriedades cicatrizantes relacionadas a ácidos graxos insaturados como, ômega-3, ômega-6 e ômega-9 presentes em sua constituição (Oliveira et al., 2010; da Silva Quirino et al., 2009). Habeeb et. al, 2007 demonstraram, por exemplo que os óleos fixos de Aloe vera (babosa) apresentam atividade cicatrizante, sendo atribuída as seus polissacarídeos. Este óleo também favorece a formação do colágeno fornecendo força e integridade a derme. A fração glicoprotéica é o maior componente do Aloe vera que está envolvida com a cicatrização por promover a proliferação celular, a migração e o crescimento dos fibroblastos da derme (Eshghi et al., 2010). O óleo de Helianthus annus (girassol) também tem se mostrado uma alta atividade cicatrizante. Esta planta é rica em ácido ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 29 linoléico (ômega- 6) o qual é um ácido graxo essencial e precursor do ácido aracdônico, atuando indiretamente, nas prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos os quais são importantes mediadores inflamatórios e essenciais no processo de cicatrização das feridas (Eurides, 2006). Além do H. Annus,pode-se citar a Rosa aff. Rubiginosa (rosa mosqueta) com grandes quantidades de ácido linoléico e seus derivados (Eggers et. al., 2000), possuindo atividade cicatrizante substancial. (Szentmihályi et al., 2002). Assim, a importância da utilização de plantas no tratamento é evidenciada por estes estudos e pela necessidade de se buscar alternativas para a cicatrização de lesões na pele, já que os curativos disponíveis, sintéticos ou biossintéticos, utilizados são bastante onerosos (Di Stasi, 2007). 2.3.2 Ouratea sp. A família Ochnaceae pertence à ordem Theales e compreende cerca de 28 gêneros e 400 espécies de ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo. No Brasil, são conhecidos aproximadamente 9 gêneros com um total de 105 espécies (Jolly, 1988). São plantas essencialmente arbóreas ou arbustivas e, recebem denominações específicas dependendo da região: angelim (Ouratea vaccinoides), coração de bugre (Ouratea parviflora) e caju bravo (Ouratea floribunda e Ouratea salicifolia), sendo estas últimas empregadas em ornamentação urbana. No Nordeste, as espécies desse gênero são conhecidas popularmente por batiputá (Fig.7) (Barroso, 1986). As espécies de Ochnaceae mais competentes em biossintetizar flavonóides e biflavonóides, é representada pelo gênero Ouratea, sendo a frequência e a diversidade estrutural dos biflavonóides nas espécies desse gênero utilizadas como marcadores taxonômicos (Tih et al., 1992). As espécies de Ouratea, são utilizadas pela população como tônicas e adstringentes (O. castanaefolia, O. parviflora), como anti-inflamatório e em doenças da pele (O. parviflora) e no tratamento de doenças gástricas (O. spectabilis) (Corrêa, 1975; Paulo et al., 1986; Felício et al., 2004). Estudos tem demonstrado que extratos e frações obtidas de plantas pertencentes a estes gênero possuem ação vaso-dilatadora e anti- hipertensiva (Cortes et al., 2002), antitumoral (Sampaio et al., 1975; Oliveira et al., 2002; Carvalho et al., 2002; Grynberg et al., 2002). O óleo extraído do extrato hexânico ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 30 dos frutos de O. parviflora apresentou atividades antibacteriana e antifúngica (Marcol et al., 1988). Além dos flavonóides e biflavonóides, esse gênero são bioprodutores de outras classes de metabólitos como: triterpenos, diterpenos, depsídeos, ésteres graxos e triglicerídeos, aos quais se atribuem suas importantes propriedades biológicas. Entre essas classes de substâncias, os biflavonóides recebem destaque, devido à frequência e abundância com que são encontrados nesse gênero, e cuja diversidade estrutural é devida, principalmente, aos diferentes padrões de ligações entre seus monômeros (Velandia et al., 2002; Felicio et al., 2004).Fig. 7: Ouratea sp. Fonte: http://www.ulf-mehlig.de/jpg/dunes/duouratea-1-0.html ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 31 3 JUSTIFICATIVA O uso de plantas medicinais como agentes terapêuticos tem despertado interesse junto aos pesquisadores devido os seus mais diferentes efeitos, dentre eles o de promover a cicatrização de feridas, ocasionadas por doenças de pele ou traumas. Entretanto, o uso potencial dessas plantas como fontes de substâncias cicatrizantes em Medicina Veterinária ainda é insignificante. O número e a variedade de preparações tópicas obtidas a partir de plantas medicinais para a cicatrização de feridas é relativamente significante, sendo, na sua maioria, eficientes estimulando a cicatrização. Em contrapartida, mais estudos são necessários, mediante a vastidão de plantas existentes, para que haja a comprovação científica do efeito cicatrizante de fitoterápicos, evitando assim o uso indevido de determinados produtos que são prejudiciais à cicatrização, por serem irritativos ou estimularem a formação de um tecido de granulação exuberante (White, 1995). Apesar de diversas atividades terapêuticas comprovadas, o efeito cicatrizante do óleo de batiputá (Ouratea sp.) sobre feridas cutâneas permanece desconhecido. Por outro lado, apesar de já ser utilizado pela população como cicatrizantes, essa atividade terapêutica ainda necessita de comprovação científica. Desta forma, são necessárias pesquisas que evidenciem, cientificamente, a ação dos constituintes presentes no óleo de batiputá (Ouratea sp.) como cicatrizantes além de não causarem efeitos colaterais. Portanto, a comprovação do potencial cicatrizante dessa planta utilizada em feridas cutâneas em modelos experimentais irá validar seu uso, bem como contribuir para a produção de um fitoterápico de baixo custo para uso humano e/ou veterinário. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 32 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA O óleo fixo de Ouratea sp., conhecida como batiputá, possui atividade cicatrizante em lesões cutâneas induzidas expermentalmente. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 33 5 OBJETIVOS 5.1 Objetivo Geral: Avaliar o potencial do óleo fixo de Ouratea sp. (batiputá) na cicatrização de feridas cutâneas experimentais in vivo. 5.2 Objetivos específicos: • Determinar a composição química do óleo fixo de Ouratea sp.; • Avaliar os aspectos macroscópicos das lesões cutâneas em camundongos (Mus musculus); • Avaliar a retração da área da lesão nas feridas em cicatrização; • Avaliar os aspectos histológicos no processo cicatricial; • Avaliar morfometricamente a quantidade de colágeno durante o processo de cicatrização das feridas. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 34 6 MATERIAL E MÉTODOS 6.1 Óleo Vegetal Pesquisas realizadas com a população a respeito de tratamentos para feridas na pele foi relatado o uso do óleo de Ouratea sp. como um dos produtos naturais mais utilizados na região. Com base nesta pesquisa foi feita a aquisição comercial do óleo de Ouratea sp., no Mercado São Sebastião, situado na cidade de Fortaleza, no Estado do Ceará. O óleo foi acondicionado em frascos de vidro com as seguintes características qualitativas: coloração amarela translúcida com consistência e odor sui generis. Os fracos foram armazenados a 25°C, envolvidos em papel laminado a fim de proteger contra a luminosidade excessiva. Utilizou-se como referência para o estudo o óleo de Helianthus annus (girassol), por já possuir sua atividade cicatrizante conhecida (Wendt, 2005). Este óleo foi obtido comercialmente através de farmácia de manipulação. 6.1.1 Análise Fitoquímica A análise química dos constituintes do óleo de Ouratea sp. foi realizada por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa, realizada no Parque de Desenvolvimento Tecnológico (PADETEC), em Fortaleza, Ceará. Utilizando espectrômetro Shimadzu modelo GCMS-QP 5050 sob as seguintes condições: coluna capilar de sílica fundida W Scientific DB-5MS (50 m x 0,25 mm); gás de arraste: He (1 mL/min); temperatura do injetor: 250°C; temperatura do detector: 200 °C; temperatura da coluna: 35-180°C a 4°C/min e depois 250°C/15 min; espectro de massa: por impacto eletrônico a 70 eV. A identificação dos constituintes foi feita por busca em biblioteca de espectros de massa, tempos de retenção e comparação visual dos espectros de massa obtidos com os publicados na literatura (Alencar et al., 1984; Adams, 1989). 6.2 Animais Camundongos Swiss machos, com 8-10 semanas de idade, pesando 32,0 ± 2,0g foram adquiridos e mantidos no Biotério de Criação e Biotério Experimental do ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram alojados individualmente em caixas de polietileno, permanecendo em macroambiente controlado (fotoperíodo de 12h claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento de água e ração. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas preconizadas pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório SBCAL e os protocolos experimentais Uso de Animais – CEUA da 6.2.1 Procedimento cirúrgico Os animais foram divididos em três grupos experimentais (n=15/grupo), anestesiados por via intramuscular (IM) com cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e cloridrato de cetamina 10% (115 mg/Kg), segu al. (2001). Após o procedimento anestésico, cada animal foi submetido à tricotomia da região dorsal e posterior antissepsia utilizando iodopovidona 1%. Com auxílio de um molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A ferida cutânea foi produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15 e a tela subcutânea divulsionada com tesoura íris de pontas tipo fina/fina e pinça de dissecção, até sua ressecção 6.2.2 Tratamento da lesão Fig. 8: Procedimento c metálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida realizada. . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - CPqAM/FIOCRUZ, localizado Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram alojados individualmente em caixas de polietileno, permanecendo em macroambiente controlado (fotoperíodo de 12h claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento de água e ração. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório experimentais foram aprovados pelos Comitês de Ética para o da Universidade Estadual do Ceará (SPU – 09172748 6.2.1 Procedimento cirúrgico Os animais foram divididos em três grupos experimentais (n=15/grupo), anestesiados por via intramuscular (IM) com cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e to de cetamina 10% (115 mg/Kg), seguindo a metodologia proposta por al. (2001). Após o procedimento anestésico, cada animal foi submetido à tricotomia da região dorsal e posterior antissepsia utilizando iodopovidona 1%. Com auxílio de um lico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A ferida cutânea foi produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15 e a tela subcutânea divulsionada com tesoura íris de pontas tipo fina/fina e pinça de o, até sua ressecção, expondo a fáscia muscular (Fig 8 A-C). 6.2.2 Tratamento da lesão Procedimento cirúrgicopara realização da lesão. A – metálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 35 CPqAM/FIOCRUZ, localizado no campus da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram alojados individualmente em caixas de polietileno, permanecendo em macroambiente controlado (fotoperíodo de 12h claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento ad libitum de água e ração. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório – pelos Comitês de Ética para o 09172748-0). Os animais foram divididos em três grupos experimentais (n=15/grupo), anestesiados por via intramuscular (IM) com cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e indo a metodologia proposta por Hall et al. (2001). Após o procedimento anestésico, cada animal foi submetido à tricotomia da região dorsal e posterior antissepsia utilizando iodopovidona 1%. Com auxílio de um lico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A ferida cutânea foi produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15 e a tela subcutânea divulsionada com tesoura íris de pontas tipo fina/fina e pinça de – molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Fig. 9: A- Bancada para Microtomia do processo histológico. Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e, lesão foi tratada diariamente até o 12º dia de soluções testes. Os grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental empregado: G I – animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II animais tratados com o óleo de óleo de Ouratea sp.(batiputá). 6.2.3 Análises Histológicas As amostras do tecido lesionado formam coletadas nos dias 2, 7 e 12. Nestes tempos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente de cada grupo experimental e submetidos à eutanásia em câmar 4% (v/v) preparado em PBS 0,01M, pH 7,2 e submetidas ao processamento histológico de rotina, incluídas em parafina (Fig. 9 A microtomia com seções de 5 µm na Em seguida as lâminas das amostras foram coradas pela (H/E) e pelo Picrosirius. Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente sob o microscópio de luz em magnificação de 40 aspectos histológicos (Tabela (+++) (AKKOL et al., 2009). Todos os cortes histológicos foram avaliados de forma cega pelo mesmo investigador. . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Bancada para Microtomia. B e C- Visão em detalhes do processo histológico. D – Processo de coloração das lâminas. Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e, lesão foi tratada diariamente até o 12º dia de pós-operatório (p.o.) com s grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II animais tratados com o óleo de H. annus (girassol) e G III – animais tratados com (batiputá). 6.2.3 Análises Histológicas As amostras do tecido lesionado formam coletadas nos dias 2, 7 e 12. Nestes tempos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente de cada grupo experimental e submetidos à eutanásia em câmara de CO2. Após isto, foram fixadas em formaldeído a 4% (v/v) preparado em PBS 0,01M, pH 7,2 e submetidas ao processamento histológico de rotina, incluídas em parafina (Fig. 9 A-D). O material foi então submetido microtomia com seções de 5 µm na área logo abaixo da epiderme e formação de crostas. Em seguida as lâminas das amostras foram coradas pela Hematoxilina Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente sob o microscópio de luz em magnificação de 40x e 100x e classificados quanto aos aspectos histológicos (Tabela 3) em: ausente (-), discreto (+), moderado (++) e intenso (+++) (AKKOL et al., 2009). Todos os cortes histológicos foram avaliados de forma cega pelo mesmo investigador. . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 36 Visão em detalhes Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e, cada com 100 µL das s grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II – animais tratados com o As amostras do tecido lesionado formam coletadas nos dias 2, 7 e 12. Nestes tempos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente de cada grupo experimental e . Após isto, foram fixadas em formaldeído a 4% (v/v) preparado em PBS 0,01M, pH 7,2 e submetidas ao processamento histológico D). O material foi então submetido à abaixo da epiderme e formação de crostas. Hematoxilina-Eosina Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente 0x e classificados quanto aos ), discreto (+), moderado (++) e intenso (+++) (AKKOL et al., 2009). Todos os cortes histológicos foram avaliados de forma ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por 6.2.4 Quantificação do colágeno para análise m A avaliação morfológica para a quantificação de colágeno foi realizada com as lâminas das amostras coradas através do Picrosirius. Utilizando um microscópio sob objetiva de 5x e um software expressa em percentual (Fig. 10 6.2.5 Análise Macroscópica Para a análise macroscópica, foram submetidos ao procedimento cirúrgico Diariamente, foi realizada a avaliação macroscópica de cada lesão, observando aspectos como: edema, hiperemia, exsudato, tecido de granulação 6.2.6 Contração da área da lesão A mensuração da área da lesão foi realizada c digital (Fig 11). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al. (1988): A= π.R.r, onde “A” representa a área (cm²); “R” representa o raio menor. Fig. 10: A- Equipamento utilizado para realização da morfometria. Visão do software . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por tificação do colágeno para análise morfométrica A avaliação morfológica para a quantificação de colágeno foi realizada com as lâminas das amostras coradas através do Picrosirius. Utilizando um microscópio sob software específico Qwuin (LEICA®), a quantidade de colágeno foi expressa em percentual (Fig. 10 A-C). 6.2.5 Análise Macroscópica Para a análise macroscópica, foram utilizados 3 grupos de 10 animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico como descritos a Diariamente, foi realizada a avaliação macroscópica de cada lesão, observando aspectos como: edema, hiperemia, exsudato, tecido de granulação e reepitelização. 6.2.6 Contração da área da lesão A mensuração da área da lesão foi realizada com o auxílio de um paquímetro ). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al. .R.r, onde “A” representa a área (cm²); “R” representa o raio maior; “r” Equipamento utilizado para realização da morfometria. B software utilizado. Fig. 11: Paquímetro digital. . Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 37 A avaliação morfológica para a quantificação de colágeno foi realizada com as lâminas das amostras coradas através do Picrosirius. Utilizando um microscópio sob ), a quantidade de colágeno foi grupos de 10 animais, os quais como descritos anteriormente. Diariamente, foi realizada a avaliação macroscópica de cada lesão, observando aspectos e reepitelização. om o auxílio de um paquímetro ). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al. o raio maior; “r” B e C- ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 38 6.3 Análise Estatística Foi realizada umaanálise descritiva dos resultados obtidos. Para testar a suposição de homogeneidade das variáveis envolvidas no estudo foi aplicado o teste de Bartlett. Quando observado o pressuposto de homogeneidade entre as variáveis foi aplicado ANOVA e como post hoc o teste de Tukey, e quando o pressuposto não foi observado, utilizou-se a ANOVA para variâncias com diferenças, sendo o teste Pair wise t-test como post hoc. E nos casos em que as observações ocorreram ao longo do tempo de forma dependente, o teste foi aplicado levando em consideração o pareamento dos dados. Todas as conclusões foram tomadas ao nível de significância de 5%. Os softwares utilizados foram o Excel 2000 e o R v2.10.0. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 39 7 RESULTADOS 7.1 Análise química do óleo fixo Os resultados da avaliação química do óleo fixo de Ouratea sp. estão representados na tabela 2. A cromatografia gasosa acoplada em espectrômetro de massa detectou a presença de ácidos graxos insaturados no óleo fixo de Ouratea sp. (Fig.12). O ácido linoléico (40,88%), ácido oléico (28,29%) e o ácido palmítico (20,65%) foram os componentes majoritários encontrados neste óleo. Além destes ácidos, foram isolados outros constituintes em menores concentrações, tais como os ácidos esteárico, linoléico-iso e ecosanóicos. Figura 12: Cromatografia de Íons Totais (TIC) do óleo de Ouratea sp. Tabela 2: Composição química qualitativa e quantitativa do óleo fixo de Ouratea sp., com respectivos tempos de retenção correspondente a cada substância. Tempo ret. %Total Constituintes 18.280 20.65 Ácido Palmítico 20.448 40.88 Ácido Linoléico 20.521 28.29 Ácido Oléico 20.573 1.84 Ácido Elaiclico 20.814 5.67 Ácido Esteárico 20.874 2.25 Ácido Linoléico-iso 23.142 0.42 Ácido Eicosanóico Tempo de Retenção (min.) Intensidade ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 40 7.2 Avaliação Macroscópica A avaliação macroscópica de cada lesão foi realizada até o 12º dia de p.o., os seguintes aspectos foram observados: presença de edema, hiperemia, exsudato, tecido de granulação e reepitelização (Tabela 3). No 1º dia de p.o, foi observado exsudato sero-saguinolento, hiperemia e edema nas feridas em todos grupos (Tab. 3 e Fig.13). As lesões presentes nos três grupos apresentaram sinais flogísticos como: edema, hiperemia e exsudato nos primeiros dias (0-4 dias de p.o) ( Tabela 3). Os animais dos grupos I e II apresentaram edema, hiperemia e exudato nos 3 primeiros dias de p.o. Do dia 4 ao dia 7 a hiperemia persistiu, mas houve uma diminuição no exudato e ausência de edema. O aparecimento de uma crosta de aspecto granular, espessa foi observado neste período. Não houve desprendimento da crosta neste grupo durante todo período de observação. Também não foram observados neste grupo sinais de reepitelização (Figs 13A-C). Os animais do grupo II (Figs.D-F) e com o óleo de Ouratea sp. (Figs 14 G-H) apresentaram evolução semelhante ao grupo I nos períodos iniciais de tratamento (0-3 dias). Nos grupos II e III foram observados o aparecimento de uma crosta mais precocemente do que no grupo controle (grupo I) para este mesmo período de observação. Nos dias subseqüentes até o dia 7 o grupo II apresentou uma evolução superior aos demais grupos, com diminuição do exudato, formação de crosta espessa, sem hiperemia. Já no grupo III foi observado ainda a presença de exudato, embora em menor quantidade quando comparado com os dias anteriores, uma crosta com aspecto regular e menos espessa do que nos grupos I e II. Nos períodos de 8-12 dias de p.o. os dois grupos tratados com os óleos apresentaram desprendimento da crosta, sendo que no grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. o desprendimento ocorreu mais precocemente do que no grupo tratado com o óleo de H. annus. Também foi possível observar uma maior reepitelização no grupo III quando comparado aos demais, sendo esta característica observada entre os dias 9-10 enquanto para o grupo II apenas a partir do dia 11. Houve também no grupo III um desprendimento mais rápido da crosta do que os grupos I e II. Apenas nos grupos do II e III foi observada a presença de re-epitielização (Figs 13 F-I). ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 41 Para verificarmos a hipótese do óleo de Ouratea sp. ter sido contaminado, o que poderia dificultar o processo cicatricial, foi realizado teste microbiológico deste. Nossos resultados mostraram a ausência de crescimento de microrganismos, confirmando a sua qualidade. Ed = edema, Hip = hiperemia, Exs = exsudato, Cr = crosta, Re = re-epitelização, De = desprendimento da crosta 7.3 Análises Histopatológicas Para análise histopatológica as lâminas das amostras das lesões foram coradas e analisadas segundo critérios previamente descritos na metodologia (Tabela 4). A avaliação histopatológica dos animais do grupo I demonstrou a evolução normal do processo reparativo. No 2º dia de p.o., o grupo I apresentou infiltrado de células inflamatórias, principalmente linfócitos. No grupo II, há uma predominância de Grupos Dias 0 - 4 5 - 7 8 -12 GI GII GIII Ed / Exs / Hip Ed / Exs / Hip Ed / Exs / Hip Hip / Cr Cr Exs / Cr Cr Re Re / De Tabela 3. Avaliação macroscópica durante os dias de tratamento. NaCl 0,9% H. annus Ouratea sp. Dia 2 Dia 7 Dia 12 Figura 13: Aspectos Macroscópicos das lesões durante tratadas com óleo fixo de Ouratea sp. por 12 dias consecutivos. Observe a presença da crosta menos espessa no grupo controle (A) no dia 2 quando comparada com os óleos de girassol (D) e do Batiputá (G) para este mesmo período. Também é possível observar o desprendimento da crosta e a presença de re- ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 42 neutrófilos sobre linfócitos, enquanto no grupo III apenas neutrófilos são observados no dia 2 de p.o. No 7° dia já foi possível observar nos animais dos grupos controles tecido de granulação com padrão fibrovascular, colagenização com epitélio desorganizado nas bordas das lesões. Estas fibras se mostraram mais organizadas no 12º dia p.o. quando também se pode observar a presença do processo de re-epitelização. Também foi importante observar que grupos controles não apresentavam folículo piloso durante todo o tempo de observação. A presença de fibroblastos entre os grupos foi bastante diversificada. Foi possível observar a presença destas células no grupo controle e nos grupos tratados com os óleos. No entanto, elas são mais abundantes nos grupos III e II no último dia de observação, não sendo observadas nestes grupos no 7° dia e sendo moderados no dia 2º de p.o. O grupo tratado com óleo de H. annus apresentou um infiltrado inflamatório considerável no 2° dia, quando comparado ao grupo tratado com óleo de Ouratea sp. No 12º dia p.o. o grupo tratado com NaCl a 0,9% apresentou fibras colágenas organizadas e, os camundongos tratados com o óleo de H. annus e o óleo de Ouratea sp. apresentaram características histopatológicas semelhantes: re-epitelização, presença de fibroplasia e fibras colágenas (Figura 14 A-I). Escores: ausente (-), discreto (+), moderado (++) ou intenso (+++). PARÂMETROS HISTOLÓGICOS GRUPO I GRUPO II GRUPO III DIA 02 DIA 07 DIA 12 DIA 02 DIA 07 DIA 12 DIA 02 DIA 07 DIA 12 Células Inflamatórias: Linfócitos Neutrófilos Monócitos Eosinófilos +++ - - + - - - - -+ +++ - +++ - - +++ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Edema Congestão de vasos Hemácias Tecido de granulação Angiogênese Fibroblasto Fibras colágenas Epitélio desorganizado Epitélio em organização Reepitelização Queratina Glândula sebácea Folículo piloso - - - + + + + ++ - - - - - - - - ++ - - + ++ - - - + - - ++ +++ - + - - - - - - + + - - - - - +++ + + - - - - - +++ ++ ++ ++ - +++ ++ - +++ - + +++ - +++ +++ - - ++ ++ - + + - - - - - +++ - - +++ - - - ++ +++ - ++ +++ - - - - ++ - - - - - - - - - - - - - - - +++ - - +++ - - Tabela 4: Aspecto qualitativo da avaliação histológica do potencial de cicatrização do óleo fixo de Ouratea sp. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 43 7.4 Contração da Área da Lesão A evolução macroscópica do processo cicatricial foi acompanhada pela mensuração das lesões ao longo dos 12 dias p.o. (Fig. 15). A partir do 6º dia p.o. o grupo tratado com NaCl a 0,9% iniciou uma contração significativa da área da lesão, o grupo tratado com o óleo de H. annus teve uma contração significativa da área da lesão a partir do 7º dia p.o. e o grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. reduziu significativamente a área da lesão a partir do 4º dia p.o. NaCl 0,9% H. annus Ouratea sp. Dia 2 Dia 7 Dia 12 Figura 14: Avaliação microscópica (H&E) dos tecidos tratados à base de óleos vegetais em diferentes dias sobre a cicatrização cutânea: Grupo I: NaCl 0,9% (A=D2, B=D7; C=D12) –; Grupo II: H. annus (D=D2; E=D7; F=D12); Grupo III: Ouratea sp.(G=D2; H=D7; I=D12). Legenda: c= crosta; q= queratina; ep= epitélio; vs= vaso sanguíneo; tg= tecido de granulação; ci= células inflamatórias; fb= fibroblastos. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 44 7.5 Análise Morfometria A análise morfométrica da quantidade de colágeno demonstrou que em todos os grupos houve uma tendência ao aumento da deposição de colágeno sendo que a partir do 2º dia um aumento mais pronunciado foi observado no grupo tratado com solução de NaCl 0,9%, quando comparados aos demais grupos analisados. No decorrer dos dias de tratamento, o grupo controle apresentou uma redução gradativa quanto ao conteúdo de colágeno depositado. Todavia, os grupos tratados com os óleos H. annus e Ouratea sp. comportaram-se de forma oposta ao grupo controle, pois com o decorrer dos dias de tratamento o percentual de colágeno apresentou-se em maiores quantidades (Fig. 16). Figura 15: Tratamento com o óleo fixo de Ouratea sp. sobre a área da lesão Fig. 16: Porcentagem da deposição de colágeno durante o tratamento. P ercentual de C olágeno (% ) ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 45 8 DISCUSSÃO A cicatrização é um processo complexo e dinâmico de restabelecimento das estruturas celulares e, consequentemente, das camadas do tecido epitelial. Este processo é realizado a fim de estabelecer uma reepitelização mais próxima do seu estado normal (Kumar et al., 2006). Algumas plantas são medicinais utilizadas de maneira empírica como o óleo Ouratea sp., popularmente conhecido por batiputá, que é utilizado como agente para diversas afecções da pele, inclusive, como cicatrizante para feridas cutâneas. Devido a sua disponibilidade no Nordeste Brasileiro e, mais especificamente, no interior do Estado do Ceará, as espécies de Ouratea sp., são bastante utilizadas pela população como tônicas e adstringentes (O. castanaefolia, O. parviflora), como anti- inflamatório e em doenças da pele (O. parviflora) e no tratamento de doenças gástricas (O. spectabilis) (Corrêa, 1975; Paulo et al., 1986; Felício et al., 2004). No presente trabalho nós analisamos o potencial cicatrizante do óleo do Batiputá e utilizamos o óleo de H. annus, o girassol, como tratamento de referência. Este óleo já é bastante utilizado em feridas abertas promovendo um menor desconforto doloroso ao indivíduo (Eurides et. al., 2006). Quando observadas as respostas cicatriciais das feridas cutâneas, nos tratamentos utilizados, estas podem ser atribuídas ao fato de tanto o óleo de girassol quanto o de Batiputá apresentarem como componentes mais abundantes os ácidos linoléico (ômega 6) e oléico (ômega 9). Segundo De Nardi et al. (2004), estes ácidos tem importante função no processo inflamatório, na proliferação e modulação do crescimento celular. Desta forma, os efeitos superiores destes óleos tanto na qualidade quanto no tempo da reepitelização da lesão pode ser atribuído a ação conjunta destes ácidos. No entanto, não se pode descartar a hipótese de outros constituintes encontrados em menor quantidade possa estar agindo sinergicamente potencializando sua ação cicatrizante. O ácido linoléico em alta concentração no óleo de girassol foi aplicado em lesões escamosas e dermatose por Van Dorp, 1974 e Prottey et al., 1975 onde observaram a reversão e a cura dessas lesões. Hartop Prottey, 1976 também mostrou que, quando aplicado via cutânea, ambos os ácidos (linoléico e iso-linoleico), restaurada a permeabilidade da epiderme na pele de ratos. De acordo com Glasgow e Eling, 1990, o ácido linoléico é essencial para a regulação de eventos bioquímicos que precedem a mitogênese fibroblástica uma vez que estimula alguns fatores de crescimento celular e , segundo Moch D. et al., 1990 por ser um poderoso mediador pró-inflamatório (ácido ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 46 linoléico) provoca a migração de granulócitos e macrófagos, bem como mudanças importantes no tecido da granulação. A avaliação histopatológica mostrou um maior acúmulo de células inflamatórias no grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. Sabe-se que a fase inflamatória é uma etapa das mais importantes no processo de cicatrização. É nesta fase que células como neutrófilos, responsáveis pela fagocitose de restos celulares e agentes estranhos, proliferam no sítio da lesão, ativados pela permeabilidade vascular e pela ação de substâncias quimiotáticas, como fatores do crescimento, citocinas, fatores plaquetários entre outros. Esses dados corroboram com os dados encontrados por Ribeiro et al., 2009, que observaram a presença de infiltrado inflamatório severo, predominantemente neutrofílico. E segundo Gurmel et al. 1998, as feridas dos animais tratados com curcumina demonstraram reepitelização, neovascularização, aumento da migração de várias células, incluindo fibroblastos, miofibroblastos e macrófagos no leito da ferida, e um maior teor de colágeno. Macrófagos também estão presentes nos sítios da lesão auxiliando os neutrófilos na fagocitose secretando sinalizadores de fibroblastos os quais são os responsáveis pela síntese do colágeno (Guidugli-Neto, 1992). Assim, embora nossos resultados sejam aparentemente paradoxais com relação ao aumento da atividade inflamatória no óleo do Batiputá em relação ao grupo controle, esta atividade aumentada pode contribuir para uma maior resposta destas células e por conseguinte, aumentar a eficiência do processo cicatricial. Por outro lado, a hipótese que uma eventual contaminação dos óleos com micro-organismos pudesse estar afetando e exacerbando a resposta inflamatória local também deveria ser considerada. Desta forma realizamos teste bacteriológico destes óleos. Os resultados negativos quanto a presença de microrganismos nos óleos analisados refutaram esta hipótese. Durante todo o estudo, a mensuração da área ferida foi realizada, sendo observada a redução da lesão em todos os grupos. Embora não tenha havido diferenças significativas entre os grupos comrelação a este parâmetro no decorrer do período total de observação, nossos dados mostraram que a retração da lesão se dá de maneira mais precoce no grupo do Batiputá. Um importante fator de morbidade de uma ferida é o tempo que esta leva para completar o processo de cicatrização. Assim a possibilidade de que uma ferida pode infeccionar é tanto maior quanto maior for a área comprometida (Branon, 2002; Clark, 2003). Desta forma, o Batiputá apresentaria uma vantagem em relação aos demais, uma vez que o tratamento com este óleo favorece a contratura significativa da lesão em um espaço mais curto de tempo diminuindo as chances de uma ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 47 eventual contaminação. Segundo Madison e Gronwal, 1992 o processo de contração das feridas ocorre em três fases: uma fase inicial, na qual as bordas da ferida apresentam retração centrífuga e a área da lesão aumenta; a seguir, um período de contração rápida em direção ao centro da lesão, e finalmente, quando a ferida está praticamente cicatrizada, o processo torna-se mais lento, deixando a curva de cicatrização na forma de platô. O aumento da área das lesões registrado logo após o traumatismo se deve, segundo Barber, 1990 à associação da perda da tensão ao edema da pele. Segundo Kumar et al., 2006, os animais tratados com a casca da uva em pó da Cabernet Sauvignon, exibiram aumentos significantes nas a taxa de contração da ferida, a taxa de epitelização. Corroborando com os resultados de Baie e Sheikh, 2000 que trataram ratos com o óleo de peixe, e até ao final de doze dias obtiveram 80% de contração da ferida. O tecido de granulação formado na penúltima parte da fase proliferativa é composto principalmente de fibroblastos, colágeno (tipo III), células inflamatórias, fibronectina e novos pequenos vasos sanguíneos. Colágeno, o principal componente estrutural de granulação tecidos, fortalece e apóia matriz extracelular tecidos, e eventualmente substitui a fibronectina temporária matriz. Este é considerado o principal componente que fortalece e suporta o tecido extracelular, pois é composto de aminoácidos dentre eles a hidroxiprolina, e tem sido usado como um marcador bioquímico tecidual (Kumar et al., 2006). Tomariz et. al., 2002 demonstraram que a deposição de colágeno recém-sintetizado no local da ferida, amplia a concentração deste por unidade de área e, portanto, aumenta a resistência à tração do tecido, interferindo positivamente na contração da área lesionada. Para verificarmos os efeitos dos tratamentos com os óleos sobre a deposição de colágeno, foi realizada a análise morfométrica através da quantificação desta proteína. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo da quantidade de colágeno em todos os grupos testados, sendo que no decorrer do tratamento, o grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. foi o que apresentou aumento significativo na quantidade da proteína (p=0,04) em relação ao grupo controle, no 12º dia. Estes dados corroboram tanto as nossas análises histológicas quanto macroscópicas. Consistentemente, nossos achados revelam que apenas o grupo tratado com os óleos de batiputá e do girassol apresentaram uma repitelização eficiente e sugerem que o bom resultado de repitelização alcançado pelos óleos se deva a uma deposição eficiente do colágeno nestes grupos em relação ao controle. Segundo Schumacher et al., 1992 e D’utra Vaz 1995 características clínicas semelhantes foram observadas para lesões cutâneas em equinos avaliadas nos primeiros dias após a ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 48 indução, que foram associadas ao pico da fase inicial do processo inflamatório. De acordo com Marques et. al., 2004 Ao sétimo dia após a excisão, as feridas tratadas com ácidos graxos essenciais, apresentaram-se evoluídas macroscopicamente que as feridas do grupo controle devido a um grande desenvolvimento do tecido de granulação, contração na borda exterior das fronteiras e da ausência de secreção. Por outro Por outro lado, as feridas controle apresentaram extensas áreas de hiperemia, crosta e edema. Nossos dados sugerem o óleo fixo de Batiputá como alternativa terapêutica no tratamento de feridas. No entanto, maiores estudos ainda se fazem necessário para uma melhor compreensão do papel deste óleo sobre a fisiologia da cicatrização de lesões da pele. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 49 9 CONCLUSÕES O óleo fixo de Ouratea sp. apresentou os ácidos linoléico (40,88%), oléico (28,29%) e palmítico (20,65%) como componentes majoritários; O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu re-epitelização a partir do oitavo dia e retração da área da lesão mais evidente a partir do quarto dia; O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu migração neutrofílica, proliferação de fibroblastos e aumento de fibras colágenas; O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu maior percentual de colágeno. Portanto, concluiu-se que óleo fxo de Ouratea sp. auxilia e acelera o processo de cicatrização, mostrando potencial terapêutico sobre as lesões cutâneas, comprovando, desta forma, o seu uso popular como agente cicatrizante. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 50 10 PERSPECTIVAS Como as lesões de pele, particularmente as feridas, possuem grande importância clínica em função da alta frequência com que ocorrem entre os animais domésticos, este estudo aponta perspectivas para a utilização do óleo de Ouratea sp. em ferimentos cutâneos. Além do mais, novos protocolos com o intuito de verificar a concentração ideal do óleo fixo de Batiputá para sua utilização em ferimentos cutâneos devem ser avaliados em animais de diferentes espécies. ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp. 51 11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA ABE, R. et al. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites. Journal of Immunology, v.166, n.12, p.7556-7562, 2001. ADAMS, R.P. Identification of essential oils by ion trap mass spectroscopy. London: Academic Press, 456p, 1989. 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