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VISÃO GERAL SOBRE DERMATOLOGIA UNIDADE IV EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO Atualização Maria Lopes Corrêa Produção Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração SUMÁRIO UNIDADE IV EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO .....................................................................................................................5 CAPÍTULO 1 EXAMES DERMATOLÓGICOS .................................................................................................................................................... 5 PARA (NÃO) FINALIZAR ...............................................................................................................................40 REFERÊNCIAS ...............................................................................................................................................41 5 UNIDADE IV EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO CAPÍTULO 1 EXAMES DERMATOLÓGICOS Introdução Há uma máxima em dermatologia alertando que a pele manifesta diferentes condições patológicas por um número limitado de sinais cutâneos. Sendo assim, o quadro sintomatológico de diferentes dermatopatias pode ser semelhante, demandando uma abordagem diagnóstica bastante criteriosa e sistemática para diferenciá-los. Todo o curso de avaliação do paciente deve ser procedido considerando os aspectos gerais da saúde, pois os sinais cutâneos podem ser a sentinela para doenças internas. Por outro lado, sinais clínicos gerais podem contribuir para a elucidação da dermatopatia em curso e para a avaliação do estado geral de saúde e da capacidade de recuperação. O exame clínico geral pode ainda contribuir para a identificação de sinais cutâneos mais sutis ou com distribuição disseminada, porém esparsa. Do mesmo modo, em casos nos quais, no momento da avaliação, o paciente se apresenta em condições de dermatopatia crônica, com predominância de lesões secundárias ou que tenha sido submetido a tratamentos prévios, a abordagem sistemática e generalista do paciente é fundamental. O exame clínico pode contribuir para a identificação de fatores predisponentes ou desencadeantes daquela condição clínica, contribuindo para a elucidação da evolução do quadro. Diversas estratégias devem ser associadas a esse processo investigativo, desde o recolhimento detalhado do histórico até o exame clínico geral e dermatológico que seleciona os sinais mais relevantes para a caracterização do quadro. Entre elas, a descrição das lesões em um mapa dermatológico é uma excelente ferramenta de registro, seja para o processo de diagnóstico ou para o acompanhamento do curso da doença e da resposta ao protocolo terapêutico. Todos os sinais recolhidos durante o exame clínico (geral e dermatológico) servem como evidências para o levantamento das suspeitas de diagnóstico. A partir dessas evidências, 6 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO é elaborada a lista de diagnósticos diferenciais, que deve incluir todas as patologias que podem cursar com os mesmos sinais. Na dermatologia veterinária, a conclusão de diagnóstico a partir desssa lista é alcançada pela execução dos exames complementares praticados com base nessas lesões que cacterizam o quadro. Muitos desses exames podem ser realizados no ambiente ambulatorial, oferecendo resultados rápidos e melhor dinâmica para o processo de diagnóstico, bem como sobre a instituição precoce do tratamento e melhoria da qualidade de vida do paciente. Ainda que os exames de abordagem inicial não sejam suficientes para conclusão final sobre o quadro, contribuem para o processo, pois possibilitam a identificação rápida de alterações secundárias que podem mascarar o diagnóstico da doença de base. Tabela 21. Listagem de material para realização de exames complementares ao diagnóstico. Material de apoio para exames dermatológicos complementares Microscópio eletrônico Lâminas e lamínulas de vidro Oléo mineral Óleo de imersão Corante rápido do tipo Panótico Swabs de algodão Lâminas de bisturi Fita de acetato Punch Meio de transporte para cultura microbiológica Frascos estéreis Fonte: elaborado pela autora. De modo geral, os exames dermatológicos complementares envolvem práticas simples de execução e coleta, guardando os devidos cuidados de boas práticas para segurança das amostras, do paciente e de quem as coleta. Antes de iniciar os procedimentos, o médico veterinário responsável pelas coletas deve estar adequadamente paramentado, usando preferencialmente jaleco de mangas compridas e presas aos punhos, com luvas de látex e, dependendo do tipo de amostra e da suspeita clínica, máscaras e óculos de proteção contra exsudatos e aerosóis. Para início dos procedimentos, devem ser adotadas medidas de antissepsia adequadas à natureza da amostra que será avaliada. Por exemplo, amostras de crostas e pelos para investigação parasitológica podem ser coletadas após limpeza superficial para retirada de sujidades grosseiras da superfície da pele. Por sua vez, o mesmo tipo de amostra pode 7 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV ser coletado para investigação de fungos dermatófitos por cultivo; nesse caso, a área da coleta deve ser previamente higienizada com álcool 70%, a fim de evitar a contaminação da amostra por outros fungos ou bactérias oportunistas. É importante frisar que, também na etapa de coleta dos exames complementares, os procedimentos ambulatoriais devem seguir um padrão de conduta sistemático de modo a evitar a variação metodológica, garantindo maior confiabilidade dos resultados. Adicionalmente, uma questão bastante relevante recai sobre a capacitação do avaliador (que pode ser patologista especializado ou mesmo clínico dermatólogo) para interpretação das amostras. É comum que avaliadores com pouca prática tenham dificuldade em distinguir as características patológicas de determinada amostra. Ainda que, em fases iniciais da prática dermatológica, o clínico não sinta confiança para avaliação das amostras, é fundamental que mantenha a rotina de treinamento para tais avaliações, no sentido de se aprimorar e aos poucos assumir todas (ou a maioria) as etapas de investigação das lesões e interpretação dos achados. Entre as medidas que os clínicos podem usar para minimizar a incidência de resultados falso positivo e falso negativo nos exames, a primeira é obter histórico, realizar exames físicos e dermatológicos para estalecer o mínimo de diagnósticos diferenciais. Esse talvez seja um dos pontos fundamentais para aumentar a confiabilidade dos resultados, pois a escolha dos exames complementares deve contribuir para a distinção dos sinais e suas possívies etiologias. O uso indiscriminado de exames aumenta a probabilidade dos resultados falso positivo e falso negativo. Exames de avaliação da superfície das lesões, como raspado e citopatológico, podem contribuir para a triagem geral por distinguirem a etiologia de lesões muito frequentes e compartilhadas por muitos quadros clínicos. Exames dermatológicos complementares ao diagnóstico O conjunto mínimo de técnicas de diagnóstico dermatológico inclui exames parasitológicos por raspado cutâneo, swabs auriculares e citologia cutânea. O objetivo inicial deve ser identificar possíveis infecções secundárias (piodermite, sarna demodécica, dermatofitose, otite, dermatite por Malassezia, pododermatite infecciosa) e, a partir daí, formular o plano para distinguir sinais primários e controlar a doença de base (alergias, endocrinopatias, defeitos de queratinização e doenças autoimunes de pele). Avaliações séricas Hemograma e perfil bioquímico podem contribuir para a identificação de alterações sistêmicas, orientando com relação a suspeitas de encdocrinopatias. Alterações de perfil bioquímico também são importantes para a caracterização de endocrinopatias, sobretudo 8 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO com relação a alterçaões de colesterol e triglicerídeos, que podem estar relacionadasvariações devem ser esclarecidas aos responsáveis, a fim de aumentar a confiança nas condutas e a adesão ao processo de diagnóstico e tratamento. A avaliação dermatológica minuciosa será parte da rotina de acompanhamento do paciente desde as consultas iniciais de investigação do diagnóstico e as subsequentes, para reavaliação dos sinais e verificação da eficácia do protocolo de tratamento. Manter registros detalhados e atualizados é uma excelente estratégia para direcionar a condução do caso e o acompanhamento em longo prazo dos quadros crônicos. 41 REFERÊNCIAS ACKERMAN, L. (Ed). 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Permite avaliação do aspecto geral, textura, além de permitir a detecção de parasitas. » Dermatoscópio: também é um instrumento que aumenta a capacidade de visão em amplitude ainda maiores que a lente simples. Seu uso é difundido na dermatologia humana sobretudo para diferenciação de alterações pigmentares e neoplásicas. Na medicina veterinária, ainda não é frequente, porém pode ser uma ferramenta interessante para triagem de procedimentos mais invasivos de punção aspirativa e biópsia, além de otimizar a inspeção de lesões de áreas com alta densidade pilosa e lesões diminutas. » Otoscópio: método diagnóstico fundamental para exame do conduto auditivo, inspeção da integridade da epiderme e exsudado. Possibilita a identificação de ácaros, corpos estranhos e massas. Como sempre, a investigação dos ouvidos deve ser parte de exame físico completo, pois as otopatias podem ser um dos pontos de manifestação de doenças que acometam todo o corpo, sobretudo no caso das alergopatias. Exames parasitológicos Pente-fino Material necessário: » Pente fino O pente fino é um recurso extremamente simples e acessível para coleta de amostras de pelos para o exame com lupa. Oferece sensibilidade mediana para o recolhimento de grandes parasitas externos, como pulgas e piolhos. No entanto, na avaliação clínica são detectadas apenas cerca de 10% das pulgas envolvidas no parasitismo. O restante dessa população está na fase pós-repasto, infestando o ambiente. Além disso, no caso das alergopatias parasitárias, estima-se que apenas cerca de 60% das pulgas possam ser identificadas nos cães, e, nos gatos, esse percentual é ainda mais baixo, pois as removem por lambedura. Por isso, a avaliação pelo pente fino não deve 9 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV ser o único recurso de avaliação das ectoparasitoses, sendo necessário associar outras estratégias no processo de diagnóstico. Exame do material escovado da pelagem Material necessário: » Escova » Folha de papel » Lâmina de vidro » Fita adesiva » Microscópio Esse exame se assemelha bastante ao método do pente fino, porém a amostra para exame consiste nos pelos que se desprendem facilmente com a escovação. Oferece sensibilidade moderada para diagnóstico de parasitas superficiais como pulgas e piolhos e ácaros que se aderem à haste do pelo. As descamações se desprendem junto aos pelos, e a amostra completa é depositada sobre a superfície de uma folha de papel. O papel é cuidosamente dobrado para que o material coletado fique na região da dobra. O pelo é removido, e o material pode ser macroscopicamente examinado para a presença de fezes de pulgas, assim como grandes parasitas, como piolho. Outra possibilidade de exame dessa amostra é depositá-la sobre lâmina de vidro com auxílio de fita adesiva transparente e examinada sob microscopia em pequeno aumento. Toda a área da fita adesiva deve ser examinada cuidadosamente. Tricograma Material necessário: » Pinça hemostática » Lâmina de vidro » Óleo mineral » Fita adesiva ou lamínula » Microscópio 10 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO O arracamento de pelos por avulsão e subsequente exame ao microscópio pode ser indicado para detectar ácaros como Demodex spp e Cheyletiella spp. Compreende um método útil quando as amostras são coletadas de áreas difíceis de se realizar o exame parasitológico por raspado cutâneo, como no caso de pododermoticose, que apresenta as limitações sobre a sensibilidade dolorosa, além das características topográficas. O procedimento é realizado com o auxílio de pinça hemostática com ponta protegida por borracha (que evita o trauma da haste do pelo), em movimento contínuo no sentido do crescimento. As amostras abrangem cerca de 50 a 100 pelos, que são arranjados em uma lâmina com óleo de imersão recoberta por uma lamínula. As pontas das hastes e os bulbos dos pelos devem ser cuidadosamente avaliados. Exames parasitológicos de raspado cutâneo A raspagem de pele é uma técnica muito utilizada e é recomendada nos casos em que, entre os diagnósticos diferenciais, estejam incluídas ectoparasitoses por ácaros microscópicos. Porém, a sua sensibilidade para descartar um diagnóstico depende da doença e dos procedimentos de técnica de coleta. Entre os fatores que podem interferir na sensibilidade do exame, podemos citar a escolha da profundidade do raspado, que deve ser adequada ao parasito investigado, e a área selecionada para a coleta. São realizados para identificar a presença de ácaros superficiais, Sarcoptes sp. e Cheyletiella spp., ou profundos, como Demodex spp. Deve ser o procedimento de escolha quando o quadro cutâneo incluir eritema, escamação, crostas, pápulas ou pústulas. Deve-se evitar coletar amostras de áreas excessivamente crostosas ou escoriadas, pois isso pode acarretar resultado falso negativo. A sarna demodécica ou demodiciose ocorre quando ácaro do gênero Demodex spp., habitante natural do folículo piloso, multiplica-se em grande quantidade devido a desequilíbrios no sistema imune cutâneo ou sistêmico do animal. Consequentemente, decorrem alterações no fluxo de secreção sebácea nos folículos, provocando obstrução e inflamação, manifestada com sinais de eritema, pápulas, pústulas, foliculite, hipotricose ou alopecia. Apesar de o prurido não ser sinal primário da parasitose, algumas raças de cães demonstram prurido marcante ao longo do curso da doença: shih-tzu, lhasa apso, pug e yorkshire. Por sua vez, na escabiose, os ácaros do gênero Sarcoptes parasitam camadas superficiais da epiderme. Os ácaros escavam túneis horizontais na camada córnea, intensificando o processo de descamação, inflamação e prurido. Nos cães, as lesões se distribuem na borda de pavilhões auriculares e o clínico deve ter cuidado ao raspar essa região com lâmina de bisturi a fim de evitar acidentes. 11 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV A escabiose dos felinos é causada por ácaros da espécie Notoedris cati. O exame parasitológico de raspado cutâneo deve ser realizado com lesões representativas do quadro, que se distribuem principalmente na região cefálica, preferencialmente sobre a pele íntegra, evitando as lesões ulceradas. Do mesmo modo, quando o prurido for disseminado, devem ser selecionadas áreas com lesões ativas. Devido à dinâmica do ciclo de vida dos ácaros no interior dos túneis epidérmicos, os procedimentos de raspado podem não ser suficientes para recolher os ácaros. Para evitar resultados falsos negativos, devem ser realizados vários raspados cutâneos. Por isso, sempre que o caso clínico cursar com prurido intenso e suspeitas de escabiose, o clínico não deve excluir essa suspeita de diagnóstico, ainda que o raspado seja negativo para a presença dos ácaros. Cheiletiose é uma dermatite parasitária que acomete com frequência felinos, podendo acometer caninos, causada por ácaros da família Cheyletidae. A espécie mais observada é a Cheyktiella blakei. Esses ácaros se alimentam de debris celulares e vivem na superfície da pele. O exame parasitológico de raspado cutâneo deve ser realizado em lesões descamativas, pois frequentemente as escamas, além de estarem associadas ao quadro, podem ser confundidas com o parasita, preferencialmente em pele íntegra. Figura 55. Microscopia do ácaro S. scabiei com aumento de 40X. Fonte: MEDLEAU, 2012. Figura 56. Microscopia de Demodex gatoi com aumento de 10X. Fonte: MEDLEAU, 2012. 12 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO Figura 57. Microscopia de Demodex cati com aumentode 10X. Fonte: MEDLEAU, 2012. Figura 58. Microscopia do ácaro Notoedres cati com aumento de 10x. Fonte: MEDLEAU, 2012. Figura 59. Microscopia de Cheyletiella sp. com aumento de 10x. Fonte: MEDLEAU, 2012. 13 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV Figura 60. Microscopia de Otodectes cynotis com aumento de 4X. Fonte: MEDLEAU, 2012. Figura 61. Microscopia de Otodectes cynotis com aumento de 40X. Fonte: MEDLEAU, 2012. Procedimento para coleta de raspado parasitológico superficial Material necessário: » Lâmina de bisturi. » Lâmina de vidro. » Óleo mineral. » Fita adesiva ou lamínula. » Microscópio. 14 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO A lâmina de bisturi sem corte (romba) é posicionada perpendicularmente à pele e friccionada com força moderada na direção do crescimento do pelo para escarificação da camada córnea. Caso a área seja coberta com pelo, pode ser necessário tricotomizar uma pequena área para acessar a pele. Considerando que o exame tem baixa sensibilidade para recuperação dos ácaros, recomenda-se raspar áreas com 2,5 a 5 cm. Como esses ácaros habitam somente as camadas superficiais da epiderme, não é necessário visualizar o esvaziamento dos capilares ou sangue. Para aumentar o valor preditivo do exame e otimizar a coleta dos ácaros, preferencialmente o raspado deve ser na borda da orelha e na lateral dos ombros. Geralmente, é necessário realizar os procedimentos de raspado em diversas áreas, e as amostras devem ser depositadas sobre diferentes lâminas para que o material coletado seja espalhado de modo fino o suficiente para permitir o exame microscópico. Procedimento para coleta de raspado parasitológico profundo Material necessário: » Lâmina de bisturi. » Lâmina de vidro. » Óleo mineral. » Lamínula. » Microscópio. A lâmina de bisturi é posicionada perpendicularmente à pele pregueada por pinçamento digital (entre os dedos do médico veterinário). A superfície cortante da lâmina pode ser umedecida com óleo mineral para evitar cortes. A lâmina deve ser friccionada sobre a pele em movimentos descontinuados até que seja observado sangramento capilar (fato que deve ser comunicado ao proprietário com antecedência). A escarificação deve alcançar camadas subepidérmicas que contêm folículos pilosos e infundíbulos das glândulas sebáceas, onde os ácaros se alojam. Posteriormente, o material coletado deve ser posto sobre a lâmina, diluído em óleo mineral e coberto por lamínula. Imprimindo discreta pressão digital, a lâmina e a lamínula devem ser pressionadas em movimentos de vaivém, até que se obtenha um material translúcido e homogêneo. Esse material deve ser avaliado ao microscópio óptico para procura por ácaros do gênero Demodex spp nas formas adultas ou em ovos. Em algumas raças de cães com pele espessa, como os sharpeis, ou em condições crônicas com inflamação profunda e alteração dos aspectos de plasticidade e queratinização da 15 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV pele, o raspado pode não alcançar a profundidade suficiente para recolher os ácaros. Nesses casos, é indicado recorrer a biópsia das lesões, que é um exame mais sensível para confirmação do diagnóstico. O tricograma pode ser uma técnica alternativa para avaliação de casos suspeitos de demodiciose. A avulsão dos pelos deve ser feita com o auxílio de pinça hemostática com dentes protegidos por borracha para evitar o trauma dos pelos. A pinça deve ser posicionada próxima à inserção dos pelos na pele, e a avulsão deve ser realizada em movimento contínuo e rápido. A técnica garante a extração dos pelos desde o folículo, onde estão alojados os ácaros. Os procedimentos de coleta são menos invazivos para o animal quando comparados ao raspado profundo e, por isso, são preferíveis para investigação de áreas com maior sensibilidade dolorosa, como a face, interdígitos ou áreas de intensa inflamação. Os ácaros podem ter o corpo pouco queratinizado, e, por isso, pode ser difícil vizualizar no momento da avaliação microscópica. Pode ser útil diminuir o condensador do microscópio, o que provê maior contraste aos ácaros, aumentando, portanto, sua visibilidade. Interpretação dos resultados do raspado parasitológico profundo Não há um consenso exato sobre a quantidade de ácaros que deve ser encontrada para que se determine o diagnóstico de demodicidose, pois, habitualmente, o ácaro faz parte do microambiente cutâneo. No entanto, a evidenciação de apenas um ácaro ou mais do gênero Demodex sp em lesões sugestivas da doença é o bastante para confirmar o diagnóstico. Por outro lado, uma sequência de raspados deve ser executada em diferentes áreas de lesão para descartar o diagnóstico de demodiciose. Tricografia ou tricograma Material necessário: » Pinça hemostática. » Lâmina de vidro. » Óleo mineral. » Lamínula ou fita adesiva. » Microscópio. Tricograma consiste na avaliação das pontas, hastes e raízes dos pelos, permitindo a identificação da fase de crescimento, alterações pigmentares e identificação de fungos 16 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO dermatófitos. O exame consiste na remoção dos pelos, sem provocar a quebra ou corte, com auxílio de pinça hemostática com superfície de pressão protegida por borracha. O pelo deve ser agarrado o mais próximo possível da superfíce de inserção na pele e avulsionado na direção do crescimento, em procedimento rápido e contínuo, evitando traumatismos. Para avaliação das estruturas, a amostra de pelos pode ser fixada em lâmina de vidro em meio de óleo mineral e com auxílio de lamínula, conforme descrito anteriormente. Uma alternativa pode ser a fixação da amostra na lâmina com auxílio de fita de acetado, recurso útil para o diagnóstico de dermatofitose. A amostra é então avaliada ao microscópio óptico, em aumentos de 4-10x. A avaliação da ponta dos pelos permite diferenciar a queda de pelo por prurido daquela atraumática, particularmente útil em pacientes felinos que apresentam o hábito de se lamber, provocando a quebra da extremidade do pelo. O exame permite ainda a identificação da fase de crescimento, defeitos na pigmentação e infecção por fungos. Essa técnica é uma boa alternativa para avaliação de cães de contenção difícil e/ou para examinar áreas sensíveis como a região periocular, perioral e de interdígitos, áreas comumente acometidas por lesões de demodiciose em cães. O tricograma é uma técnica diagnóstica confiável, com sensibilidade em torno de 70% para diagnóstico de demodiciose em cães. Outra aplicação interessante é na diferenciação entre alopecia decorrente de prurido e autotraumatismo e alopecia não inflamatória das endocrinopatias e defluxo telogênico. Na primeira situação, as hastes estão fraturadas, enquanto, na segunda, estão normais, apesar de estarem todas em telogênese. Em condições fisiológicas e de crecimento normal, a ponta do pelo tem a extremidade livre gradualmente afilada. Sua avaliação permite diferenciar a queda de pelo por prurido daquela atraumática. Hastes de pelos fraturadas indicam traumas autoinduzuidos decorrentes de quadros pruriginosos. Essa avaliação é indicada para investigação de casos de alopecia simétrica em felinos que exacerbam os hábitos de lambedura (overgrooming). O exame da haste do pelo permite a identificação de falhas na pigmentação que podem sugerir alopecia por displasia folicular do pelo preto ou por diluição da cor. A identificação de dermatófitos e ovos de ectoparasitas é possível; no entanto, a sensibilidade do tricograma é extremamente baixa. As raízes podem ser examinadas para a caracterização do ciclo de renovação do folículo piloso. Normalmente, a maioria das raças de cães e gatos apresenta maior número de pelos no estágio telogéno. » Exame do bulbo do pelo: o bulbo claviforme e com pigmentação densa é característico do pelo na fase anagênica (crescimento). Por sua vez, a raiz delgada, 17 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IVreta, não pigmentada e com extremidade fina é característica do pelo em telogenese (em repouso). Ambas as fases podem ser idenficadas por meio do tricograma. A determinação da proporção entre pelos em anágeno e em telógeno pode ser útil na investigação da causa da alopecia, contudo a interpretação dessa proporção requer cautela. Raças como chow chow, samoieda, lulu-da-pomerânia e husky siberiano retêm maior volume de pelos telogênicos por longo período. Por outro lado, raças como poodle e bichon frisé têm a maior parte dos pelos na fase anagênica, na qual os pelos têm crescimento contínuo. Apesar dessa variação racial, a ausência de raízes anagênicas em um tricograma pode ser sugestiva de um distúrbio no ciclo do crescimento do pelo, como uma endocrinopatia. A presença de bulbos em fase anagênica indica crescimento piloso ativo e tornaria um distúrbio do ciclo de crescimento do pelo uma causa menos provável da alopecia; trauma autoinduzido ou foliculite seriam mais prováveis nesses casos. » Cilindro folicular: cilindros foliculares indicam acúmulo de material queratossebáceo ao redor das hastes dos pelos. Ocorre em distúrbios da cornificação do folículo piloso. Tal condição é observada com maior frequência na adenite sebácea na forma descamativa, como ocorre na raça akita e springer spaniel inglês. Figura 62. Cilindros foliculares no tricograma. Fonte: PATEL, 2010. Figura 63. Cilindro folicular aderido aos pelos de cão. Fonte: WILLEMSE, 2002. 18 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO Fita adesiva de acetato Material necessário: » Lâmina de vidro. » Fita adesiva. » Corante do tipo Panótico rápido. » Microscópio. As preparações em fita adesiva são usadas para avaliar lesões esfoliativas de superfície cutânea, sejam com aspecto seco ou gorduroso. A técnica envolve o uso de uma fita adesiva perfeitamente transparente (simples ou dupla face) para coletar amostra de pelos ou debris da superfície cutânea. A fita deve ter tamanho aproximadamente 50% maior que a lâmina. A porção média da fita deve ser pressionada várias vezes sobre a lesão do animal que foi selecionada para avaliação; posteriormente, essa porção deve ser fixada sobre a lâmina. As extremidades da fita são fixadas a cada uma das extremidades da lâmina, mantendo-a aderida e permitindo a avaliação de toda a extensão da lâmina. » Preparação em fita adesiva para coleta de ácaros: o método permite coletar ácaros grandes, como pilhos, ou microscópicos, como ácaros do genero Demodex sp. A técnica favorece a expulsão dos ácaros do interior do folículo piloso, em alternativa ao raspado profundo e ao tricograma. » Preparação em fita adesiva para pelo (tricograma): a fita adesiva é utilizada para segurar os pelos em posição em uma lâmina de vidro. Em áreas de pelos longos, pode ser necessário aparar a extremidade livre dos pelos para otimizar o exame de tricograma. » Preparação em fita adesiva para leveduras: preparação em fita adesiva é uma ferramenta interessante para investigação de dermatite por leveduras do gênero Malassezia sp. É uma técnica rápida e pouco invasiva que permite coleta de amostra de regiões com acidentes topográficos que dificultem a coleta por aposição direta em lâmina. Após a coleta, a fita deve ser corada com os dois corantes (eosinofílico e basofílico) do Panótico rápido, secada ao ar e então fixada sobre a lâmina pelas extremidades para ser avaliada à micorscopia, inclusive sob imersão. A superfície adesiva recolhe grande quantidade de debris celulares e resíduos de secreções e fluidos intersticiais que preenchem o “fundo de lâmina”. Tais resíduos podem comprometer a avaliação da amostra por avaliadores menos experientes. 19 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV Figura 64. Coleta de amostra citológica pela técnica da fita adesiva em interdígito de cão. Fonte: ALBANESE, 2014. A escolha do exame complementar ao diagnótico das ectoparasitoses é definida pelo tipo de lesão que o animal manifesta e pela suspeita clínica. Os exames parasitológicos da pele buscam por ácaros que estejam em ciclo de vida ativo na pele do hospedeiro. Por isso, a estratégia escolhida para coleta das amostras deve ser adequada aos hábitos de vida que cada gênero ou espécie desenrola em parasitismo. Tabela 22. Métodos de diagnóstico dermatológico das ectoparasitoses. Ácaro Teste diagnóstico Acurácia Outros testes Demodex canis Exame parasitológico de raspado profundo Elevada Biopsias podem ser necessárias em lesões hiperqueratóticas Demodex cati Exame parasitológico de raspado profundo Elevada Demodex gatoi Exame parasitológico de raspado superficial Baixa Diagnóstico terapêutico Sarcoptes sp Exame parasitológico de raspado superficial Baixa Diagnóstico terapêutico Otodectes Exame parasitológico de raspado superficial Elevada Cheyletiella Pente para pulgas, preparação com fita adesiva, exame parasitológico de raspado superficial Moderada Piolhos Preparação com fita adesiva Elevada Notoedres cati Exame parasitológico de raspado superficial Elevada Fonte: adaptado de MEDLEAU, 2012. Teste intradérmico Material necessário: » Alérgenos. 20 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO » Agulhas e seringas de 1mL. » Caneta. » Paquímetro. » Máquina de tosa (tricotomia). » Suporte anestésico. O teste intradérmico é indicado para a investigação da reação cutânea de hipersensibilidade a alérgenos ambientais. Consiste na injeção intradérmica de extratos produzidos a partir desses alérgenos e subsequente observação de reação local característica da hipersensibilidade do tipo com imediata presença de eritema, edema e pápula no local quando positivas. Injeção de histamina é aplicada como controle positivo para a reação alérgica, e o controle negativo é feito com água de injeção. As reações cutâneas são avaliadas 10 a 25 minutos após as injeções com formação de pápulas. O resultado é obtido com a medição do diâmetro das reações e calculado com média aritmética do diâmetro maior com a sua perpendicular. Para a reação ser considerada positiva, o diâmetro da pápula deve ser maior que a média dos diâmetros do controle positivo e negativo. Figura 65. Teste intradérmico com reações em pápulas. Fonte: PATEL, 2010. Exames para investigação micológica As micoses com manifestação cutânea são classificadas como superficiais, de subcutâneo ou profundas/sistêmicas de acordo com a profundidade do sítio de instalação do agente patogênico. O quadro sintomatológico e a configuração das lesões representativas de cada micose são determinados por características da fisiopatologia da infecção que decorre de tal profundidade. Consequentemente, a escolha dos métodos de diagnóstico mais indicados para investigação das lesões deve ser decidida com base nos possíveis diagnósticos diferenciais. 21 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV Tabela 23. Comparativo do material necessário para os procedimentos de três métodos para investigação de fungos dermatófitos. Material necessário Cultura Micológica Tricograma Citopatologia » Lâmina de bisturi ou escova » Frasco estéril » Álcool 70% » Meios de cultura » Lâminas de vidro » Fita adesiva » Corante Panótico » Microscópio » Pinça hemostática ou fita adesiva » Lâmina de vidro » Swab de algodão ou fita adesiva » Lâmina de vidro » Corante Panótico » Microscópio Fonte: elaborado pela autora. Indicações Dermatofitose As dermatofitoses são infecções fúngicas de tecidos queratinizados, como epiderme, pelos e unhas. As principais espécies fúngicas associadas à doença em animais domésticos são Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton equinum e Trichophyton verrucosum. O quadro clínico se manifesta por lesões circulares, de bordas eritematosas e centro descamativo, e, em felinos, que também apresentam dermatite miliar, que são pequenas crostas amareladas firmemente aderidas à pele, podemser facilmente palpadas. Em cães, as lesões podem se iniciar com pelo de má qualidade e áreas de hipotricose, que podem evoluir para lesões alopécicas e crostosas. Descamação, eritema, hiperpigmentação e prurido são variáveis. A doença tende a ser focal, mas alguns casos podem chegar à alopecia generalizada. Devido ao amplo espectro de apresentações clínicas das dermatofitoses, bem como devido a seu caráter zoonótico e aos efeitos colaterais observados em alguns tratamentos, é fundamental definir precisamente o diagnóstico para definição de tratamento e das medidas de controle de transmissão. As amostras de diagnóstico devem constar de estruturas queratinizadas: descamação da pele lesionada, pelos e unhas. A coleta deve ser feita por raspado superficial com auxílio de espátula ou lâmina de bisturí sem corte, seguindo procedimentos similares aos de coleta de parasitológico. O raspado deve ser feito de forma bastante delicada, pois a contaminação com sangue ou exsudatos pode comprometer os resultados, especialmente 22 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO a cultura. Além disso, a amostra deve ser coletada após antissepsia da pele com álcool 70% para evitar contaminação por patógenos oportunistas. Outra possibilidade de método de coleta de amostra para a cultura é a técnica da escova de MacKenzie, muito utilizada na rotina para dermatofitose em gatos. O método é proposto para casos nos quais as lesões não estão bem definidas, ou o animal é exposto a dermatófitos, mas sem sinais clínicos. Utiliza-se uma escova de cerdas finas e estéril (escova de dentes) para a coleta dos pelos e das escamas por escovação da pelagem por 30-60 segundos na região das lesões. A haste da escova pode ser cortada e enviada ao laboratório no frasco estéril de trasporte. A amostra deve ser armazenada entre lâminas, em tubo estéril ou dentro de coletores universais estéreis, para, na sequência, ser semeada em placas de petri contendo meio de cultura Saboraud acrescido de antibióticos (para controlar o crescimento de contaminantes), incubado a 25° C. Dermatófitos podem crescer nesse meio em até 21 dias, e somente após esse período o diagnóstico será confirmado ou refutado. A identificação da espécie do dermatófito envolve as características morfológicas macroscópicas da cultura, além da confirmação das características microscópicas de macroconídios. A avaliação microscópica é feita com amostra da superfície das colônias coletada com auxílio de fita adesiva, seguindo os procedimentos descritos anteriormente, com a única diferença de que se procede à coloração somente com acréscimo de uma gota do corante basofílico do Panótico diretamente entre a fita e a lâmina; a leitura deve ser imediata. Há formulações comerciais de meios específicos para diagnóstico, sobretudo Dermatophyte Test Medium (DMT), um meio Sabouraud acrescido de vermelho fenol. Em poucos dias (3 a 10), quando a amostra é positiva, o meio faz a “viragem” passando de discretamente amarelado a vermelho devido à produção de substâncias alcalinas pelos dermatófítos. No entanto, para a confirmação da espécie em questão, é necessário proceder à avaliação microscópica das colônias. A limitação desse teste se refere à impossibilidade de identificação específica e ao fato de que fungos saprófitas como Aspergillus spp., Mucor spp. e bactérias podem provocar a mudança de coloração do meio, fazendo com que esse teste não seja plenamente confiável para a determinação de um diagnóstico positivo. O método de coleta e a temperatura são os mesmos já citadas no cultivo convencional. Os felinos são a única espécie doméstica que pode ter dermatofitose por Microsporum canis sem apresentar lesões de pele. Como a dermatofitose é uma importante zoonose, 23 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV não raro são observados proprietários de felinos com lesões sem que seus animais se apresentem doentes. Independentemente da técnica escolhida para confirmação da dermatofitose, os animais que já estiverem submetidos à terapia tópica ou sistêmica devem ser afastados do tratamento por no mínimo sete dias para que o material seja coletado. Uma opção para o diagnóstico das dermatofitoses de animais é a avaliação dos pelos por tricograma, seguindo os procedimentos de avulsão com auxílio de pinça hemostática, conforme descrito anteriormente. Há ainda outra opção de diagnóstico ou triagem para coleta de amostras de cultura: lampada de wood. É uma técnica que incide luz ultravioleta com comprimento de onda de 360 nm (nanometros) sobre as áreas de lesão. As hastes dos pelos infectados com certas cepas de Microsporum canis fluorescem em cor verde-maçã devido aos metabólitos de triptofano. Esses metabólitos são produzidos apenas por fungos que invadem os pelos em crescimento; ou seja, a fluorescencia pode ser observada somente em amostras que contenham resíduos de queratina, sejam diretamente sobre a pele/ pelame do paciente ou sobre superfícies que contenham tais resíduos. As lâmpadas devem ser ligadas cinco a dez minutos antes dos procedimentos de exame e deixadas aquecendo. A observação da fluorescencia é otimizada quando o exame é realizado em sala com pouca ou nenhuma luminosidade. Podem ocorrer falsos positivos quando o animal for submetido a tratamento prévio com produtos que possuam enxofre na composição. Além disso, os metabólitos de bactérias Pseudomonas aeruginosa e Corynebacterium minutissimum também fluorescem. É um teste de alta especificidade, mas de baixa sensibilidade, visto que só 50% das cepas dessa bactéria fluorescem. Raras infecções por M. audounii, M. distortum e Trichophyton schoenlenii também podem resultar em fluorescência. Tabela 24. Características de identificação dos fungos dermatófitos. Microrganismo Características Microsporum canis Macroconídios com forma de lança, paredes grossas, botão no extremo terminal, compartimentados, geralmente 6 ou mais células. Esporos no pelo – pequenas e desorganizadas. Microsporum gypseum Frequentemente mais macroconídios que M. canis, paredes finas, ausência de botão no extremo terminal, compartimentados, às vezes com menos de 6 células; esporos no pelo – escassas, grandes e em cadeia. Trichophyton mentagrophytes Raramente com macroconídios com forma de lança; hifas espiraladas; esporos no pelo. Fonte: ACKERMAN, 2008. 24 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO Dermatite por Malassezia A dermatite por Malassezia pachydermatis é uma dermatopatia frequente em cães e pode acometer a pele e os condutos auditivos; otite é a manifestação mais comum em gatos. Em geral, as lesões são descamativas, eritematosas ou hiperpigmentadas, podendo apresentar aumento de secreção sebácea aumentada sobretudo em região de interdígitos e pregas cutâneas. O diagnóstico é confirmado pela identificação do agente patogênico a partir de amostras de descamação das lesões ou de secreções da superfície cutânea ou do conduto. As amostras são coletadas por meio de swab de algodão ou de fita adesiva para procedimentos de citopatologia ou cultura micológica. A avaliação citopatológica oferece boa sensibilidade para identificação das leveduras com morfologia sugestiva desse gênero: as formas infectantes se assemelham a “pegadas” graças ao seu característico brotamento O material enviado ao laboratório deve ser representado por escamas coletadas da lesão, que devem ser enviadas entre lâminas, em tubo estéril, dentro de coletores universais estéreis, ou ainda coletadas por swab no caso de lesões untuosas. O material deve ser semeado em placas de petri contendo meio de cultura Sabouraud e Sabouraud acrescido de antibióticos (impede o crescimento de fungos saprófitas) a 37° C. A Malassezia pachydermatis, também denominada de Malassezia canis, cresce em 5 a 7 dias. É uma levedura que se assemelha a “pegadas” ou “tina d’água” graças ao seu característico brotamento, de fácil identificação e consequente confirmaçãodo diagnóstico. Os animais que já estiverem submetidos à terapia tópica ou sistêmica devem ser afastados do tratamento por no mínimo sete dias para que o material seja coletado. Figura 66. Citopatologia identificando diversas estruturas leveduriformes. Fonte: HODGES, 2013. 25 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV Esporotricose Esporotricose é uma micose subcutânea que pode acometer cães e gatos. É uma zoonose amplamente distribuída no país, e é importante diagnóstico diferencial para quadros nodulares e ulcerativos em gatos. O quadro clínico se manifesta pela formação de lesões nodulares que evoluem em fístulas, úlceras e lesões intensamente secretivas (hemorragia ou secreção serosa). O agente patogênico presente nas lesões sob a morfologia de levedura pode ser identificado em amostras de secreção ou de fragmento de tecido obtidas diretamente dessas lesões. As amostras podem ser coletadas por impressão direta (imprint), por meio de swab de algodão, ou ainda por biópsia. O material pode ser avaliado por exame citopatológico (imprint) ou por cultura em meios específicos a partir de amostras de secreção coletadas por swab ou amostras de fragmento, Sabouraud acrescido de antibióticos a 25 e 37° C. A cultura micológica permite diagnóstico do gênero Sporothrix spp. por garantir a exibição do dimorfismo levedura/hifa, a 37ºC e 25° C respectivamente. Exame de citologia A citopatologia é uma técnica muito usada na dermatologia veterinária para investigação da celularidade de diversos tipos de amostras: descamação de superfície epidérmica, secreção de diferentes etiologias. As amostras citológicas são importantes para a classificação das lesões cutâneas, pois correspondem à “porção” dessas lesões que se despreende da “base” morfológica. A técnica é simples quanto aos procedimentos para coleta e leitura, podendo ser realizada durante a consulta dermatológica, oferecendo informações importantes para a condução de todo o processo de diagnóstico e acompanhamento da evolução do quadro. É indicada para investigação de lesões com suspeitas de etiologia inflamatória, infecciosa, disqueratóticas ou neoplásicas. A escolha da técnica de coleta de amostra varia de acordo com as características da própria amostra almejada e da lesão representativa do quadro. » Objetivo: obter amostras de lesões completamente desenvolvidas, mas antes de as alterações secundárias ocorrerem. As melhores amostras são de pústulas intactas, abaixo de crostas e margens ulceradas e tumores não ulcerados. » Indicações e finalidades: possibilita a diferenciação entre os processos inflamatórios, hiperplásicos, císticos e neoplásicos e permite estabelecer diagnósticos de neoplasias e identificar prováveis locais de metástase regionais, o que proporcionaria rápida ação terapêutica e estadiamento neoplásico inicial. 26 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO » Vantagens: são relacionadas à rapidez e à simplicidade na execução da técnica que é minimamente invasiva, associada a um menor traumatismo. O procesamento para análise não exige tratamento da amostra e equipamentos sofisticados, diminuindo custos. As amostras podem ser analisadas imediatamente após a coleta, o que proporciona rapidez no diagnóstico diferencial. » Desvantagem: ao microscópio, visualizam-se células isoladamente, sem analisar a alteração do tecido, fato que limita a sua citopatologia em comparação com o exame histopatológico. Resultados inconclusivos por baixa celularidade e coletas inadequadas podem levar a amostras insuficientes ou excesso de material, o que dificulta a análise. Técnicas de citologia A técnica tem por objetivo coletar amostras que permitam investigação das lesões quanto a seu perfil de celularidade: quantitativo e características morfológicas de células do proprio paciente ou dos agentes etiológicos envolvidos no fisiopatogenia das lesões. Nas amostras celulares, frequentemente são observadas células inflamatórias, sobretudo macrófagos, neutrófilos, linfócitos e eosinófilos, que estão envolvidos nas estratégias de defesa imune do organismo. Além disso, células dos agentes patogênicos (bactérias, leveduras, parasitos) podem ser identificadas em eventos de fagocitose, o que indica importante infecção ativa. Células de descamação, anucleadas e com morfologia irregular são achados citológicos normais; no entanto, variações de células epiteliais nucleadas podem sugerir alteração na epitelização. Os agentes infecciosos mais frequentemente encontrados em preparações citológicas de cães e gatos são leveduras e bactérias de aspecto cocoide ou bastonete. A identificação dos aspectos morfológicos que distinguem os microrganismos contribui para a elaboração do diagnóstico, uma vez que permite diferenciar quadros quanto à sua etiologia. Nas lesões de etiologia bacteriana, é possível ainda diferenciar bactérias gram-positivas das negativas, visto que a maioria dos cocos é gram-positiva, enquanto que a maioria dos bastonetes é gram-negativa. A quantificação (ou estimativa) das formas infectantes de microrganismos presentes em determinado campo citológico pode ser determinante para a conclusão do diagnóstico. Cocos ocasionais em amostras de pele e do conduto auditivo são irrelevantes, considerando o microbioma cutâneo. No entanto, quando os agentes infecciosos são identificados em áreas de pele lesionada, a celularidade se torna representativa do processo patológico em curso naquele sítio, determinando relevância na interpretação clínica. 27 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV Conhecer os métodos de coleta e saber como estes podem ser aplicados diante de diferentes tipos de lesões, bem como o processamento e acondicionamento, é essencial para aumentar as chances de um melhor diagnóstico e consequente prognóstico. Zaragatoa ou swab Material necessário: » Swab de algodão. » Lâmina de vidro. » Corante Panótico. » Óleo de imersão. » Microscópio. É um método de coleta indicado para recuperação de amostras de condutos auditivos, fístulas, úlceras, lesões cavitárias ou de interdígito. Após a coleta, a amostra é transferida para uma lâmina de vidro por rolamento direto do swab sobre sua extensão. É importante não “rolar” o swab duas vezes pelo mesmo local para evitar amostras muito “espessas” que dificultam a observação de cada célula individualmente. Não é necessário conservar a amostra em geladeira até a avaliação caso esta seja encaminhada a laboratório. Os achados são de fundamental importância para decidir qual tratamento usar e para monitorar a resposta à terapia de processos infecciosos. O registro da quantidade de células do agente nas amostras pode ser interessante para acompanahamento da evolução do tratamento e definição de prognóstico. Figura 67. Rolamento de amostra hemorrágica em superfície de lâmina de vidro. Fonte: RASQUIN; MEYER, 2016. 28 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO Impressão direta em lâmina Material necessário: » Lâmina de vidro. » Corante Panótico. » Óleo de imersão. » Microscópio. Essa técnica é conhecida por imprint ou decalque e é indicada para coleta de amostra de lesões ulceradas ou exsudativas. A limpeza local prévia das lesões é importante para retirar as crostas e restos celulares (debris) por meio de movimentos leves e não abrasivos e pode ser realizada com o auxílio de gaze umedecida em solução salina. As pústulas devem ser rompidas antes da coleta, em procedimento suave, para garantir a preservação da amostra. A amostra deve ser imprimida sobre a superfície da lâmina de vidro em pontos individualizados ao longo de seu comprimento. Para evitar amostra espessa, após cada impressão, deve-se deslocar a lâmina, afastando a área impressa e aproximando aquelas ainda não marcadas da superfície da lesão; não “arrastar” a lâmina sobre a lesão! Esse procedimento evita que as células se sobreponham e dificultem a visualização e a identificação aomicroscópio. A vantagem dessa técnica está associada à boa preservação morfológica celular e rápida avaliação da presença de estruturas bacterianas e fúngicas. Onde a impressão direta não é possível, o material pode ser transferido da pele por meio de swab de algodão ou com auxílio de fita adesiva, conforme os procedimentos abordados anteriormente. Figura 68. Procedimeento de imprint de amostra de lesão cutânea sobre lâmina de vidro. Fonte: MEDLEAU, 2012. 29 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV Escarifição ou scraping Material necessário: » Lâmina de bisturi, espátula ou escova citológica. » Lâmina de vidro. » Corante Panótico. » Óleo de imersão. » Microscópio. É a técnica de escolha para a coleta de amostras quando existem crostas, vesículas ou descamações do estrato córneo. A pele afetada é exposta, e a superfície raspada superficial e delicadamente com uma lâmina de bisturi ou espátula. Os debris são transferidos para a lâmina de vidro e espalhados uniformemente com o uso de outra lâmina ou pincel. Em lesões exsudativas, em que há uma maior dificuldade de obter material, a técnica é indicada. Com o auxílio do bisturi ou da espátula, escafica-se a superfície da lesão, e o material é depositado sobre uma lâmina de vidro previamente limpa e seca. Uma desvantagem seria a formação de citologia espessa, dificultando a visualização ao microscópio e a fixação do material em lâmina. A escova citológica pode ser uma estratégia para coleta em lesões ulceradas ou mucosas, pois otimiza a esfoliação celular, garantindo amostra celular rica. A distribuição do material na lâmina deverá ocorrer de forma delicada, em movimentos de rotação, sem friccionar. Figura 69. Escova citológica. Fonte: CASTRO, 2013. Punção aspirativa por agulha fina Material necessário: » Lâmina de vidro. » Agulha. 30 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO » Seringa. » Corante Panótico. » Óleo de imersão. » Microscópio. Punção aspirativa é a técnica indicada para coleta de amostras de lesões sólidas, nodulares, edemaciadas ou encapsuladas. Não existe uma regra rígida quanto à dimensão da seringa e ao diâmetro da agulha, a escolha vai variar quanto à sensibilidade e à experiência do operador. Como regra geral, usa-se seringa de 10 mL com agulhas 22 gauges (25x7mm). Em casos de tecido mole, cistos e linfonodos, podem ser usadas agulhas mais finas acopladas a seringas menores (3 ou 5mL). A preparação da pele para a punção deve incluir os cuidados de antissepsia indicados para venopunção. Após a fixação do nódulo com uma das mãos, a agulha é introduzida na formação e, por meio de movimentos “em leque”, a agulha vai cortando o tecido, as células vão se esfoliando, e o material entrará na agulha por capilaridade, outro nome para essa técnica. Durante a manobra, a agulha não deve sair da lesão, para evitar contaminação por células do tecido adjacente. Após a coleta, a agulha é então retirada da formação, acopla-se a seringa previamente preenchida com o ar, com o bisel para baixo, próximos à lâmina, empurrando o êmbolo para que a amostra seja expelida. Em casos de nódulos de pequeno diâmetro, a técnica deve ser realizada por capilaridade sem seringa acoplada, o que proporciona maior mobilidade e firmeza. A agulha deve ser introduzida na lesão e movida para trás e para frente várias vezes, em movimentos “em leque”, redirecionando a agulha para que diferentes áreas da lesão sejam amostradas. A agulha é retirada e conectada a uma seringa contendo poucos milimetros de ar. O conteúdo da agulha é expelido em uma lâmina limpa e delicada e rapidamente espalhado em uma segunda lâmina. A velocidade é fundamental para evitar a desidratação da amostra. A amostra deve ser seca ao ar e corada por métodos rápidos. Figura 70. Método de coleta por capilaridade. Fonte: CASTRO, 2013. 31 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV Figura 71. Punção aspirativa em nódulo cutâneo. Fonte: ALBANESE, 2014. Figura 72. Movimentos “em leque” para coleta por punção aspirativa. Fonte: RASQUIN; MEYER, 2016. Preparações para esfregaços O método de preparo para as lâminas provenientes de punção é a técnica de squash ou esmagamento. Consiste em colocar uma lâmina sobre a outra e distribuir a amostra. É preciso obter esfregaços finos, nos quais as células se apresentam espalhadas em uma monocamada, o que evita seu rompimento e aglomerações. Exame bacteriano Cultura bacteriana A cultura bacteriana e teste de sensibilidade são preconizados nas seguintes situações: » infeccção cutânea não responsiva a antibioticoterapia empírica de primeira escolha; » infecções profundas; » infecções com presença de bastonetes. 32 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO Os procedimentos têm por objetivo identificar espécie, perfil bioquímico e perfil de susceptibilidade aos antibióticos, oferecendo subsídios para a indicação do agente terapêutico mais adequado, evitando a prescrição empírica, que favorece a seleção de bactérias multirresistentes. As amostras devem ser coletadas de lesões íntegras e minimamente alteradas por autotraumatismo. Técnica Material necessário: » Swab estéril » Meio de transporte » Álcool 70% Antes da abertura da pústula, a área deve ser delicadamente limpa com álcool 70% para remover contaminantes bacterianos superficiais. A lesão preferencial para coleta é a pústula íntegra, aberta somente ao momento da coleta, com auxílio de agulha hipodérmica, e o conteúdo coletado com a ponta de um swab. Em lesões íntegras nodulares, a coleta deve ser realizada por punção aspirativa, que grarante o mínimo de contaminação. Na ausência de lesões intactas, o swab deve ser introduzido por baixo de crosta ou sobre a superfície de lesão exsudativa. Na piodermatite profunda, os swab podem ser introduzidos nos seios drenantes, ou a lesão pode ser delicadamente comprimida para exsudar o pus. Em lesões fistuladas, para os procedimentos de coleta, o swab deve alcançar as laterais internas da lesão. Amostras de tecidos mais profundos podem ser coletadas por biópsias com punch ou incisão elíptica. Geralmente, o material é submetido para cultura e exames histológicos. Se há suspeita de infecção por micobactéria, as amostras podem ser congeladas e posteriormente submetidas para a cultura. Teste de sensibilidade a antibióticos Corresponde a método in vitro de avaliação da sensibilidade de bactérias a antibióticos. Seu uso é indicado para investigação de lesões infecciosas de dermatite pustular, piodermatites profundas, fístulas, celulite e abscessos crônicos e em todos os casos em que o distúrbio dermatológico não responde ao tratamento inicial. A amostra é coletada com auxílio de swab estéril e imediatamente deve ser armazemada em meio de transporte (meio de Stuart) e encaminhada para o laboratório onde será 33 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV processada. Caso não seja possível encaminhar no mesmo dia da coleta, essa amostra deve ser armazenada sob refrigeração por até 24 horas. Para o processamento, a amostra será recuperada do swab (por suspensão em caldo) e semeada em meio de cultura adequado para isolamento. Após a definição do diagnóstico específico, é avaliado o perfil de sensibilidade, observando o crecimento das colônias quando expostas e incubadas com discos de papel impregnados com diferentes antibióticos, durante 24 horas e a 37° C. Exame histopatológico Biópsia A biópsia é indicada na situação de doenças incomuns de pele, distúrbios erosivos ou ulcerativos, nódulos e tumores, condições graves ou riscos à vida e quando há pouca resposta ao tratamento. O exame histopatológico tem pouco valor na investigação da maioria dos casos de prurido. Técnicas punchs de 6 ou 8 mm são apropriadas na maioria das circunstâncias, embora a excisão com o bisturi seja necessária para lesões grandes ou frágeis ou quando há lesões com aspecto de paniculite, em que é necessário incluir o subcutâneo.Exceto quando a amostra é retirada de áreas como o pavilhão auricular, coxim, lábios ou plano nasal, anestesia e sedação geralmente são suficientes. O anestésico não deve conter adrenalina, pois poderá causar vasoconstrição na amostra. Na biópsia com punch, deve ser considerado o uso de uma lâmina de bisturi circular. O punch deve ser posicionado perpendicularmente à superfície cutânea, e um movimento para baixo e rotacional deve ser aplicado para fazer a incisão. O punch não deve ser girado em ambas as direções, pois isso pode provocar artefatos na amostra. É importante fazer biópsia de lesões que sejam representativas da doença. Lesões aproriadas incluem pápulas, pústulas, vesículas, nódulos, erosões ou úlceras. Como regra, deve-se colher amostras de lesões em diferentes estágios de desenvolvimento, de preferência lesões primárias (mácula, pústulas, pápulas, vesículas, nódulos, tumores, escamas, crostas ou áreas de alopecia). Retire as amostras cutâneas do centro de uma área de alopecia, assim como qualquer margem em expansão, quando colher amostras de áreas de alopecia. Para amostra, a lesão não deve ser recente ou antiga, em fase de regressão, ulcerada ou com erosões. As alterações crônicas secundárias podem mascarar a doença primária ou medicamentos. Por isso, os anti-inflamatórios, principalmente os corticoides, devem ser afastados por 2 a 3 semanas antes da coleta da biopsia. Sempre que possível, deve-se coletar um fragmento que contenha a transição da pele íntegra ao tecido acometido. Em casos de alterações discretas, como discromias, 34 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO descamação, alopecia ou atrofia, é aconselhável enviar um fragmento de pele normal para efeito de comparação. Técnicas para realizar uma biópsia cutânea: » biópsia incisional: com uma folha de bisturi pequena, faz-se uma incisão em forma de gomo de laranja com 1 cm de diâmetro e suficientemente profunda para chegar ao tecido subcutâneo. No fim, o local é suturado; » biópsia por punção: indicada para pequenas lesões, é colocado um punch de biopsia diretamente sobre a lesão, com um suave movimento de rotação sempre para o mesmo sentido, e, exercendo-se alguma pressão, extrai-se a amostra. A incisão é fechada com um ou dois pontos de sutura; » biópsia excisional: está indicada para lesões frágeis, muito extensas ou muito profundas, em que pode haver a necessidade de recolher também tecido adiposo subcutâneo. Com a ajuda do bisturi, é realizada uma incisão elíptica, que engloba a lesão, a zona de transição e o tecido normal envolvente. O local é suturado; » biópsia com agulha de corte: é utilizada uma agulha com mandril, que tem um canal na ponta que recolhe a amostra. É mais utilizada em gânglios e massas cutâneas e subcutâneas. Orientação básica » Lesões vesicopustulosas intactas (pênfigo foliáceo eritematoso, impetigo, piodermite superficial, dermatose pustulosa subcorneal, pustulose eosinofílica estéril, farmacodermia pustular superficial, dermatofitose pustulosa). » Bolhas e vesículas intactas (penfigoide bolhoso, pênfigo vulgar, epidermólise bolhosa). Se não houver lesão primária intacta, a margem de uma vesícula ou bolha recentemente rompida pode ser biopsiada. » Lesões frágeis (vesículas e bolhas) precisam ser removidas inteiramente por biópsia “em fuso”, com bisturi, para preservar a integridade da superfície. » Crostas devem ser inclusas, pois podem ser úteis para estabelecer o diagnóstico. Deve-se evitar lesões crostosas antigas. A epiderme íntegra é necessária para estabelecer o diagnóstico de diversas doenças (lúpus eritematoso, eritema multiforme, dermatopatia isquêmica, dermatomiosite canina, necrólise epidérmica tóxica, dermatite esfoliativa em felino). Na presença de apenas lesões ulceradas, áreas eritematosas adjacentes às úlceras podem ser biopsiadas. Lesões em processo de despigmentação do plano nasal ou no lábio são importantes para o diagnóstico do lúpus eritematoso discoide. 35 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV » Placas eritematosas, descamativas, escamo-crostosas, alopécicas ou não; comedões (dermatite solar; placa eosinofílica; foliculite/dermatite piotraumática; doenças com cornificação anormal, como dermatose reponsiva ao zinco, dermatite seborreica, comedões actínicos, adenite sebácea). » Máculas, pápulas e placas eritematosas (alergias). » Pápulas e pústulas (foliculite bacteriana). » Lesões pápulo-nodulares (dermatites e paniculites infecciosas ou não, como piogranuloma estéril, doenças fúngicas, bacterianas e por protozoários, granuloma eosinofílico, reação a corpo estranho, calcinose circunscrita, amiloidose, histiocitoses reativas). » Áreas de máxima alopecia (todos os casos de suspeita de doença endócrina, foliculites murais, alopecia cicatricial, displasia folicular e alopecia não inflamatória de causa não endocrina). » Máculas discrômicas (alterações de pigmentação, ex.: vitiligo, hiper ou hipopigmentação pós-inflamatória). » Lesões purpúricas (hemorragias, vasculites). Na suspeita de vasculite, evitar locais de difícil cicatrização (como plano nasal e coxim). Se necessário, realizar a biópsia na margem das lesões nessas regiões. » Placas urticariformes (urticária e angioedema). Devem-se realizar precocemente às biópsias, uma vez que as lesões são transitórias. Pode-se incluir pele normal para efeito de comparação. » Em casos de paniculite, realizar biópsia profunda “em cunha”, por bisturi (nunca punch), garantido que a amostra represente, além da epiderme e da derme, o tecido subcutâneo. » Evitar lesões crônicas (hiperpigmentadas, liquenificadas), autotraumatizadas e infectadas. » Sempre que possível, obter biópsias profundas. Não são esperadas grandes complicações durante ou após o procedimento de biópsia. A hemorragia, que sempre existe em alguma intensidade, pode ser geralmente controlada por simples compressão. No entanto, deve-se prestar muita atenção em animais com distúrbios de coagulação, nas intoxicações por rodenticidas e nas trombocitopatias. Cuidado com os animais que têm hiperadrenocorticismo, diabetes mellitus e anormalidades de colágeno ou que normalmente possuem problemas de cicatrização, sendo esperada a boa atuação do clínico, o que envolve: 36 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO » escolha de lesões representativas a serem biopsiadas; » sempre que possível, obter várias amostras; » preservar ao máximo a superfície lesionada; » utilizar instrumental adequado, evitando os artefatos de coleta; » fixação adequada da amostra; » envio de formulário de solicitação de exame contendo a identificação do animal, resumo da história e sinais clínicos, tratamentos realizados, respostas terapêuticas e a lista dos principais diagnósticos diferenciais (ficha clínica), nos quais deverão constar informações relativas à anamnese e ao exame físico do animal, assim como a descrição das lesões, quaisquer outros resultados de exames complementares realizados, tratamentos e resultados destes. Uma boa biópsia deve ser representativa e abranger o máximo possível as partes ativas do processo. O animal não deve estar medicado, à exceção de antibióticos, que pode tomar até 3 semanas antes para eliminar a infeção associada e assim não mascarar os resultados histopatológicos. A amostra obtida é colocada com a face interna voltada para baixo sobre um fragmento de cartão e pressionada ligeiramente para facilitar a sua aderência. De maneira a evitar a autólise da amostra, ela deve ser fixada com formol a 10%. Isso conservará e preservará os tecidos dos processos de autólise, que posteriormente impediriam o exame histopatológico. Caso sejam coletadas diversas amostras, cada uma deve ser corretamente separada e identificada. Submissão da amostra Os formulários de submissão devem ser completamente preenchidos com os sinais clínicos e histórico completo. Deve ser incluída uma descrição da progressão da doença,presença de sinais sistêmicos, detalhes e resultados dos exames realizados anteriormente e resposta à terapia prévia. Apenas com essas informações o patologista será capaz de fazer correlação clinicopatológica. A interpretação do laudo histopatológico geralmente é dividida em várias partes. A primeira parte detalha como a maioria dos cortes foi examinada e dá a descrição histopatológica das lesões encontradas. A próxima parte dá o diagnóstico morfológico. Essa é uma descrição do padrão de reação histopatológica. Se as mudanças são patognomônicas, um dignóstico específico pode ser dado, mas é provável que o patologista discuta as alterações e tente correlacioná-las com o histórico dado pelo clínico. 37 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV O tempo de fixação depende do tamanho da amostra e se faz da periferia para o centro da amostra. O período mínimo de fixação para fragmentos obtidos por punch de 6 mm ou maiores é de 24 horas. Um erro frequentemente observado é o envio de grandes fragmentos de tecidos, acondicionados em recipientes de boca estreita ou com pouco volume de fixador. O volume do fixador deve ser 20 vezes maior que o volume da amostra. Em virtude de a formalina não penetrar eficientemente nos fragmentos com espessuras superiores a um centímetro, as amostras de maior tamanho devem ser parcialmente secionadas em pedaços menores de 1 cm. Quando se pretende o estudo de imunofluorescência ou microscopia eletrônica, a formalina não é o fixador indicado. Para esses casos, utiliza-se o fixador de Michel e Milogni, respectivamente. Para o estudo imunoistoquímico (imunoperoxidase), a fixação prévia com formalina não é impedimento absoluto para a realização da técnica. Nesses casos, é importante consultar o laboratório para saber qual é a melhor forma de fixação ou acondicionamento da amostra, pois alguns anticorpos não funcionam em tecido fixado em formalina. Não há necessidade que o clínico conheça todas as reações e fundamentos do processamento histopatológico. Entretanto, é importante que ele tenha algumas noções básicas das etapas do processo. Após recebimento e registro da amostra pelo laboratório, segue- se o exame macroscópico da peça, que consiste em analisar as características da peça como dimensões, cor, consistência e o aspecto ao corte da lesão para observar algum tipo de alteração. O clínico deve ter consciência de que, após a fixação com formalina, as alterações de cor como o eritema, discromias e mesmo impressões obtidas pela palpação podem desaparecer e, frequentemente, não são mais observadas pelo patologista devido ao endurecimento e à descoloração da peça. Da mesma forma, lesões pequenas, como pápulas e pústulas, visíveis durante o exame físico, também, possivelmente, não serão mais óbvias após a fixação. A amostra deve ser cortada e colocada no cassete plástico juntamente com os dados de identificação do animal. Os fragmentos de pele podem ser adequadamente secionados ao meio, através da epiderme, até atingir a região panicular, no sentido dos folículos pilosos. Tal corte permite a visualização longitudinal dos folículos pilosos e demais anexos epidérmicos. O corte transversal, paralelo à superfície cutânea, na altura do infundíbulo folicular, é indicado nos casos de avaliação das alopecias não inflamatórias. Após essa primeira etapa, o tecido é desidratado passando por soluções de álcool, diafanizado em soluções de xilol, para depois ser incluído em parafina. A parafina mantém firmes e relacionadas as estruturas morfológicas para não deformarem quando submetidas ao corte do micrótomo. A seguir, o tecido é colocado em um pequeno recipiente contendo parafina derretida, que, ao endurecer, fundir-se-á com a parafina previamente infiltrada no tecido, formando o bloco de parafina. 38 UNIDADE IV | EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO A pele é um tecido de difícil corte devido à natureza diversa dos tecidos que a compõem, exigindo um técnico experiente, paciente e cuidadoso, bem como aparelhagem limpa, lubrificada e afiada. Os cortes são feitos com espessura de 4 a 6 mm, embora seja preconizada alguma vantagem com cortes mais espessos que 5 mm. Após o corte, o tecido é esticado em banho-maria e montado em uma lâmina microscópica. A coloração histológica empregada na rotina é a hematoxilina-eosina (HE). A coloração de orceina ácida de Giemsa também e útil na rotina e tem sido utilizada em alguns serviços. Outras colorações podem ser empregadas com o objetivo de melhor visualização de certas estruturas, como grânulos dos mastócitos (Azul de Toluidina), fungos (Ácido Periódico de Schiff – PAS e prata metamina de Grocott), bacilos álcool ácido resistentes (Ziehl Neelsen e Fite Faraco), fibras elásticas (Verhoeff), melanina (Fontana Masson), amiloide (Vermelho Congo ou cristal violeta), entre outras. Muitos artefatos teciduais podem resultar tanto do ato da biópsia (responsabilidade do clínico) como do processamento laboratorial (responsabilidade do patologista). Virtualmente, qualquer etapa do procedimento pode afetar o diagnóstico histopatológico final. Ao clínico vale lembrar que a escolha inadequada da lesão, o preparo cirúrgico indevido, o uso de antissépticos ou fármacos, a fricção da pele a ser biopsiada, o uso incorreto de pinças, a não utilização de apoio de madeira ou cartolina para o fragmento biopsiado, a fixação desapropriada ou o congelamento da amostra e a rotação errônea do punch podem levar a alterações microscópicas teciduais que comprometem o resultado do exame histopatológico de correlação anátomo-clínica. Demonstre iniciativa para solicitar, quando apropriado, colorações especiais. Mesmo com o avanço no conhecimento científico, o exame histopatológico possui suas limitações. Por exemplo, os padrões histopatológicos das doenças alérgicas ainda não permitem diferenciá-las na maioria dos casos. Isso também ocorre com o padrão atrófico das endocrinopatias. Esse fato pode, no primeiro momento, representar uma desvantagem do exame, o que não é verdade, pois o referido exame pode estreitar a lista dos diagnósticos diferenciais. Na dermatite hiperplásica perivascular superficial, por exemplo, o estereótipo do padrão reacional das dermatoses crônicas na espécie canina pode afastar a suspeita de endocrinopatias se houver abundante atividade anagênica folicular; se o infiltrado inflamatório contiver eosinófilos, deve-se valorizar a hipótese parasitária ou alérgica; ácaros ou fungos podem estar presentes; espongiose, exocitose linfocitária, com coleções intraepidérmicas de células Langerhoides, podem sugerir dermatite atópica, entre outras possibilidades. No entanto, não é apenas a habilidade do dermatopatologista o único fator necessário para o sucesso do exame histopatológico da pele. De igual importância está a capacidade 39 EXAMES COMPLEMENTARES AO DIAGNÓSTICO | UNIDADE IV do clínico em realizar adequadamente o procedimento de biópsia, reconhecer as lesões que mais representam o processo patológico e manusear corretamente os fragmentos biopsiados. A amostra coletada deve ser submetida ao laboratório com a solicitação do exame, constando a história clínica, exame físico, tratamentos realizados, resultados e as suspeitas clínicas. 40 PARA (NÃO) FINALIZAR A prática clínica na dermatologia veterinária é um processo investigativo que, a partir de sinais da superfície cutânea, esclarece sobre diferentes condições patológicas que podem acometer o organismo como um todo. Ao longo das etapas do exame clínico, os sinais são “decifrados” a fundo, em seus aspectos microscópicos e na maneira como interagem com outros sistemas. A busca pelo diagnóstico se inicia com anamnese detalhada e identificação de fatores que podem contribuir para as considerações iniciais sobre os diagnósticos diferenciais. Nesse ponto, é fundamental que o médico veterinário mantenha a comunicação clara, sincera e direta com o responsável pelo paciente. Todas as etapas e possíveis