2. Técnicas de Imunodiagnóstico I

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Técnicas de Imunodiagnóstico I:
Precipitação, Aglutinação e Lise
Professora: : Amanda Vasconcelos do Nascimento, Bsc em Professora: : Amanda Vasconcelos do Nascimento, Bsc em 
Biomedicina, UFPE. Mestranda em Biociências e 
Biotecnologia em Saúde, Fiocruz-PE
Testes Imunológicos
Qual a utilização ???
Diagnóstico de Diversas 
Doenças
COMO ??
Utilizando técnicas para a detecção e quantificação de antígenos e
anticorpos, ou outras substâncias que desepenhem o papel do
antígeno no ensaio, tais como drogas, hormônios, ácidos nucléicos,
citocinas, receptores celulares, etc.
Testes Imunológicos 
• Reagentes não marcados
– Reações de Precipitação
– Reações de Aglutinação 
– Reações de Lise 
• Reagentes marcados
– RIA (Radioimunoensaio)
– ELISA 
– Imunofluorescência
– Western Blotting
Reações de Precipitação 
• Para que a imunoprecipitação ocorra, é necessária a equivalência
entre quantidades de antígeno e de anticorpo na reação.
• O fenômeno de pró-zona ocorre quando há um excesso de
anticorpo , e pode causar erros na interpretação dos resultados ,
sendo necessário a realização da titulação de anticorpos .
Reações de Precipitação
� Imunodifusão
� Imunoeletroforese
� Eletroimunodifusão
� Automação: Nefelometria e Turbidimetria.� Automação: Nefelometria e Turbidimetria.
Imunodifusão
• Princípio da Técnica
– É baseada na difusão de substâncias solúveis por
movimentos moleculares aleatórios
– Pode ser realizada em gel de agarose ou em ágar.
– A visualização da reação é feita quando há formação– A visualização da reação é feita quando há formação
de imunocomplexos de elevado peso molecular, que
precipitam no suporte
– Fatores como concentração dos reagentes,
especificidade e avidez dos soros imunes e a escolha
dos extratos antigênicos definem a eficiência do teste.
Imunodifusão
�Simples: Um dos componentes o antígeno ou o
anticorpo é fixado em um suporte sólido enquanto o
outro migra até a formação de Imunocomplexo;
� Dupla: Os dois elementos migram simultaneamente;Dupla: Os dois elementos migram simultaneamente;
�Linear: Possui movimentos orientados para uma
direção sob a influência de uma corrente elétrica ou
gravidade;
�Radial: Movimento das partículas ao acaso e em
todas as direções.
Imunodifusão simples radial 
• Método : O anticorpo é fixado no gel e o antígeno é
adicionado no poço.
• Interpretação : O tamanho do alo formado é
proporcional a quantidade de antígeno .
Antígeno Anticorpo
Imunodifusão dupla radial
• Método : Os dois componentes difundem-se em todas as
direções até encontrarem-se e formarem o precipitado.
• Desvantagens : Possui uma baixa sensibilidade e
necessita de uma alta concentração de antígeno e
anticorpo.
Ex.: Identificação de Determinantes Antigênicos 
Imunoeletroforese
• É a combinação de dois métodos , a eletroforese em gel ,
seguida da imunodifusão e precipitação das proteínas
• Variáveis: Tamanho das partículas , pH do meio, carga,• Variáveis: Tamanho das partículas , pH do meio, carga,
concentração, temperatura, viscosidade e intensidade do
campo elétrico.
Eletroimunodifusão
• Método: A migração Ag e do Ac é dirigida por um campo
elétrico, aumentando a velocidade de reação e a
sensibilidade da técnica.
• Pode ser dividida em:
– Simples Linear (Laurell ou Foguete) : Anticorpo é– Simples Linear (Laurell ou Foguete) : Anticorpo é
incorporado ao gel de agarose.
– Dupla Linear ou contra-imunoeletroforese: São pares de
orifícios, um contendo Ag e outro contendo Ac e ambos
submetidos à eletroforese
Técnicas Automáticas de ensaios de 
Imunoprecipitação
• Nefelometria: Reações de precipitação entre Ag e Ac
(imunocomplexos) em soluções diluídas produzem aumento
da reflexão da luz, que pode ser medida diretamente pela
dispersão da luz incidente através de uma cubeta fotométrica.
O sinal emitido pode ser matematicamente relacionado àO sinal emitido pode ser matematicamente relacionado à
concentração de Ag ou Ac presente na amostra.
• Tubirdimetria: A diferença dos sistemas nefelométricos é o
sinal de detecção, que neste caso é a absorbância em vez de
intensidade de luz dispersa.
Reações de Aglutinação
• Definição: São caracterizadas pela formação de
agregados visíveis como resultado da interação de
anticorpos específicos e partículas insolúveis que
possuem determinantes antigênicos em sua superfície.
• Método: O Ag ou Ac é adsorvido a micropartículas• Método: O Ag ou Ac é adsorvido a micropartículas
insolúveis ou células, permitindo leitura visual e rápida,
com a formação de agregados insolúveis.
• Vantagens: Elevada sensibilidade; baixo custo; leitura
visual; facilidade de execução.
• Desvantagens: Reprodutibilidade dos lotes de reagentes;
estabilidade da ligação Ag-Ac no suporte.
Reações de Aglutinação 
• Direta :
– O Antígeno faz parte naturalmente da célula. Haverá
aglutinação dessas células quando em contato com
amostra contendo anticorpos contra este Ag.
– Ex : tipagem de grupos sanguíneos ABO e Rh.Ex : tipagem de grupos sanguíneos ABO e Rh.
Reações de Aglutinação
• Inibição da hemaglutinação direta
– É baseada na capacidade que certos antígenos virais têm 
de, espontaneamente, aglutinar certos tipos de hemácias.
– A reação é positiva quando não ocorre aglutinação
– Detecta Acs contra rubéola, sarampo, influenza,
enterovírus .enterovírus .
Reações de Aglutinação
• Indireta
– Emprega a adsorção de Ags solúveis protéicos ou
polissacarídeos ou Acs na superfície de micropartículas
inertes(suporte).
– Micropartículas de látex ou poliestireno são as mais– Micropartículas de látex ou poliestireno são as mais
usadas.
Reações de Aglutinação
• Hemaglutinação indireta
– O suporte utilizado para ser sensibilizado com o antígeno 
é a hemácia
• Vantagens da utilização das hemácias
– Possui baixo custo; fácil obtenção; podem ser armazenadas
por longos períodos; superfície complexa que facilita apor longos períodos; superfície complexa que facilita a
ligação de muitos antígenos.
• Há kits comerciais para pesquisa de anticorpos com
essa técnica
– Exs: Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum, toxoplasma
gondii, etc.
Reações de Aglutinação
Reações de aglutinação
• Inibição da aglutinação indireta
– Consiste na adição de antígeno solúvel à amostra contendo
anticorpos visando ao bloqueio dos sítios de ligação, para
que não reaja com os Ags presentes nas partículas
sensibilizadas.sensibilizadas.
Reações de Aglutinação
• Floculação (VDRL)
– O teste de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)
emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com
lecitina e cardiolipina, para a pesquisa de anticorpos da
sífilis.sífilis.
– Os Acs contidos na amostra interagem como Ag
(cardiolipina), formando imunocomplexos que se
depositam sobre cristais de colesterol, formando grumos
visualizados em microscopia óptica. Amostras devem ser
tituladas, para evitar pró-zona(falso-negativos).
Reações de Aglutinação
Procura de Acs da doença
Reações de Lise
• O resultado consiste na presença ou ausência de
hemólise.
�Ensaios Líticos com toxinas bacterianas
�O Teste de Inibição da Hemólise é empregado para
pesquisa de Acs antiestreptolisina O (ASO), como auxíliopesquisa de Acs antiestreptolisina O (ASO), como auxílio
diagnóstico de infecções crônicas por Streptococcus Beta-
hemolítico do grupo A e sua associação com febre
reumática.
�Fundamento: Os Streptococcus produzem toxinas que
provocam lise de hemácias e estimulam a produção de
Acs.
Reações de Lise
Obrigada !!!