Banho_de_orgao_pratica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
DEPARTAMENTO DE BIOFÍSICA E FARMACOLOGIA
AULA PRÁTICA: Banho de órgão isolado
PROTOCOLO
Animal: 		Cobaia adulta com peso ao redor de 400 g.
Preparação:		Íleo de cobaia.
Líquido Nutritivo: 	Líquido Tyrode com a seguinte composição (g/l): NaCl, 8; NaH2PO4, 0,05; KCl, 0,2; NaHCO3, 1; CaCl2, 0,2; Glicose, 1; MgCl2, 0,2.
Fármacos:		Acetilcolina (Agonista Padrão)
Pilocarpina (Agonista teste)
Aparelhagem:	O órgão isolado será adaptado a uma cuba de vidro contendo 10 mL de líquido nutritivo aquecido a 37oC. A cuba de vidro apresenta em sua porção inferior duas saídas: uma delas, a lateral, serve para a entrada de líquido nutritivo e a outra, a inferior, serve para o seu esvaziamento. Uma haste de vidro colocada dentro da cuba serve para fixar uma das extremidades muscular a um transdutor de força que irá transformar o sinal mecânico em um sinal elétrico, o qual será amplificado e convertido em um sinal digital (ver figura 1A).
	 
Figura 1B
Técnica: 	A preparação pode ser montada em três etapas: 
1. Preparo da aparelhagem
a) Encher o frasco de Mariotte e as tubulações de borracha com o líquido Tyrode.
b) Encher um béquer com líquido Tyrode e deixá-lo aquecendo, mergulhado no banho a 37oC.
2. Retirada do íleo
a) Sacrificar a cobaia aprofundando a anestesia com éter.
b) Deitar o animal em decúbito dorsal sobre a placa de cortiça e fazer uma incisão mediana do púbis ao externo, compreendendo pele, parede muscular e peritôneo, penetrando assim, na cavidade abdominal.
c) Retirar um segmento de mais ou menos 10 cm de íleo.
d) Segurando uma das extremidades do segmento retirado e usando uma pipeta de 10 ml, lavar a luz intestinal com o líquido de Tyrode aquecido, retirado de um béquer previamente preparado.
e) Após a lavagem, deixar o íleo em repouso por 10 minutos no interior do béquer com líquido de Tyrode a 37oC. 
3. Adaptação do íleo a aparelhagem
a) Tomar o íleo e cortar um segmento de 2 cm.
b) Usando uma agulha de sutura, dar um ponto com fio de linha em cada extremidade intestinal. Desse modo cada extremidade ficará em forma de 8. Formar uma argola numa das extremidades e deixar um fio longo na outra (ver Figura 1B).
c) Dar 2 piques de aproximadamente 0,5 cm em cada extremidade do órgão. Facilita-se, assim, o contato das drogas com o interior do órgão.
d) Fixar o íleo na haste de vidro e colocá-lo dentro da cuba de vidro contendo líquido de Tyrode. A argola será presa à haste de vidro e o fio deverá ser atado ao transdutor de força.
EXPERIMENTO 1: Classificação de agonistas muscarínicos
1. Abrir o Software OBSim>File>New experiment>Guinea Pig Ileum
2. Em “agonists” (Aba esquerda) selecione o agonista “Acetylcholine”.
1. Iniciar o registro (pressione “Record”).
1. Adicionar de maneira cumulativa o agonista (Atenção: começar da concentração mais baixa do agonista -> 10-8M. Observe o volume que deve ser pipetado para cada concentração da solução estoque na tabela 1 (ao adicionar cada concentração, observe o efeito por 10-30s; a próxima adição do agonista pode ser realizada quando a contração induzida pela concentração anterior alcança o platô). 
1. Para adicionar o agonista, selecione a solução estoque (Stock Soln) correspondente a concentração desejada, digite o volume mostrado na tabela 1 e pressione “add to organ bath”. Observe o efeito. Quando a contração alcançar um platô, adicione a próxima concentração/volume de acetilcolina. 
Tabela 1 - (cálculos realizados considerando que a cuba possui um volume de 10 mL)
	[Agonistal] solução estoque
	Volume pipetado (mL)
	[Agonista] final 
	10-8M
	0,1
	10-10M
	10-7M
	0,09
	10-9M
	10-6M
	0,09
	10-8M
	10-5M
	0,09
	10-7M
	10-4M
	0,09
	10-6M
	10-3M
	0,09
	10-5M
	10-2M
	0,09
	10-4M
1. Ao observar o efeito máximo do agonista (quando a Acetilcolina não induz efeito adicional), lavar a preparação (pressione Flush Reservoir to Bath na aba esquerda).
1. Quando a tensão do tecido alcançar a linha de base, espere 10-30s e repita o procedimento para o próximo agonista (Em “agonists” selecione o agonista Pilocarpina). 
1. Ao observar o efeito máximo do agonista (quando a pilocarpina não induz efeito adicional), lavar a preparação (pressione Flush Reservoir to Bath). Quando a tensão do tecido alcançar a linha de base, pare o registro. 
1. Analisar o efeito contrátil da ACh e Pilocarpina
5. Para saber o valor de contração induzida por cada concentração, deslocar a linha verde para o platô da contração induzida por cada concentração do carbacol.
	[Agonista]final
	Log[Agonista]
	Contração ACh (g)
	Contração Pilocarpina (g)
	10-10M
	-10
	
	
	10-9M
	-9
	
	
	10-8M
	-8
	
	
	10-7M
	-7
	
	
	10-6M
	-6
	
	
	10-5M
	-5
	
	
	10-4M
	-4
	
	
1. Plotar os dados no software prisma (observe o guia do prisma)
1. Após análise dos gráficos, responda:
A. Qual agonista é mais potente? Explique.
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image1.emf
 
Figura 1A 
image2.emf
SS
TF
C
A
CAD
TF
C
A
CAD
LN
BA
BM
T
SS
TF
C
A
CAD
TF
C
A
CAD
SS
TF
C
A
CAD
TF
C
A
CAD
LN
BA
BM
T
LN
BA
BM
T
image3.png