Cromatografia de Aminoácidos

Prévia do material em texto

AULA 2 – CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
No final desta aula prática o estudante deverá saber: 
1. Preparar um sistema adequado para a execução experimental de cromatografia 
de aminoácidos. 
2. Fazer a aplicação de aminoácidos no papel de filtro. 
3. Executar com precisão as operações necessárias à cromatografia ascendente. 
4. Revelar um cromatograma. 
5. Identificar aminoácidos de um cromatograma 
6. Ordenar solventes empregados em cromatografia de aminoácidos baseado em 
suas polaridades. 
7. Definir fase móvel, fase fixa. 
 
MATERIAL NECESSÁRIO 
tubo de ensaio de 25 x 200 mm com uma rolha de cortiça com percevejo. 
papel de filtro Whatman no.1, em tiras de 17 x 170 mm. 
tubos capilares 
1 forro de papel. 
• lápis e régua 
estufa a 90° - 100° C 
1 placa de Petri 
 
REAGENTES 
• Mistura de três amino ácidos padrões (‡ 0,2 M) 
Mistura de aminoácidos desconhecidos (‡ 0,2 M) 
Solvente: mistura butanol - ácido acético - água (4:1:5) 
Revelador: solução de ninhidrina 0,25% em acetona. 
 
 
INTERPRETAÇÃO 
Cromatografia é uma técnica de grande importância na bioquímica moderna por 
permitir a separação, identificação e até dosagem de misturas que são de difícil 
resolução, como por exemplo: amino-ácidos, glúcides, ácidos graxos, assim 
como todos os seus derivados ou polimeros. 
 
PRINCÍPIOS 
1.A distribuição (partição) das substâncias (solutos) ocorre entre a fase aquosa 
estacionária e a fase solvente em movimento. O soluto move-se na direção do 
fluxo do solvente a uma velocidade que dependerá da sua atração, seja pela fase 
aquosa estacionária POLAR, seja pela fase orgânica (apolar) implica numa 
velocidade maior de migração. 
2. Suportes - O sistema de soluto e solvente necessita de um suporte inerte, que 
variará com o objetivo da cromatografia. Pode-se utilizar papel de filtro, resinas e 
sais inorgânicos. 
3.Tipos - Há várias formas de se efetuar uma cromatografia de acordo com: 
a) suporte usado: papel, camada fina (silica gel), coluna e troca iônica (resinas e 
sais inorgânicos). 
b) fluxo do solvente: ascendente mono - e bidimensional, descendente mono- e 
bidimensional; disco. 
Adota-se geralmente as bidimensionais para os casos em que há acúmulo de 
solutos num único local na monodimensional. 
4. Fatores importantes: A migração do soluto é influenciada por: seu peso 
molecular, tipo de suporte, temperatura ambiente, sistemas de solventes, pH, 
polaridade, ação capilar, tempo de corrida, quantidade de soluto, etc. 
 
5. Identificação - são vários os métodos para identificar e até dosar os 
componentes de mistura cromatografada. Sua aplicação dependerá apenas do 
objetivo proposto e do tipo da cromatografia adotado. No caso da cromatografia 
em papel, deve-se fazer uma revelação. Isto é, aplica-se sobre o cromatograma 
um reagente que dê com o soluto uma reação corada, tornando-o portanto, 
visível. 
No caso dos aminoácidos emprega-se como revelador uma solução de ninhidrina 
que dá um produto azul com todos eles, exceto a prolina, cuja mancha é 
amarelada. No caso de se desejar fazer uma determinação quantitativa deve-se 
localizar a mancha e eluir a mesma. 
Índice - Quando se realiza uma cromatografia em papel obtém-se um índice 
adicional que é característico para cada substância, desde que se fixe as 
condições da técnica. Este índice, R (ratio front) é dado pela relação existente 
entre a distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo solvente, a 
partir do ponto onde foi colocada a mistura. O R deverá ser sempre maior que 
zero. Se for igual a zero ou a 1, significa que a substância ou não se moveu, ou 
migrou com o solvente. Nestes casos, deve-se então modificar o sistema de 
solventes. Devido aos fatores mencionados acima, é aconselhável correr-se 
sempre que possível um padrão em paralelo com as misturas. 
 
PROCEDIMENTO 
IMPORTANTE: Em todas operações abaixo evitar tocar no papel de filtro com os 
dedos. 
Contaminações aparecerão, como manchas que prejudicarão o resultado da 
cromatografia. As bancadas de estudantes deverão executar as duas partes (I e II) 
em paralelo. 
 
I - CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS 
1. Em uma das extremidades de tira de papel de filtro, a uma distância de 20 mm 
traçar a lápis uma linha transversal como referência para o ponto de origem. 
2. Tocar com a ponta do tubo capilar contendo a mistura de três aminoácidos 
padrões, o meio da linha transversal traçada (ponto de origem), deixando escoar 
um pouco da mistura, evitando que o mesmo se espalhe por uma área maior de 5 
mm. Secar. 
3. Repetir a mesma operação por duas vezes, tendo o cuidado de secar a mistura 
depositada antes do toque seguinte. Os três toques colocarão 2,5 a 20 ml de 
mistura a ser cromatografada. 
4. Fazer uma dobra na extremidade do papel de filtro contrária àquela onde foi 
feita a aplicação da amostra. Fixar a tira de papel de filtro na face inferior da rolha 
de cortiça por meio de um percevejo, de modo que a dobra se localize sobre o seu 
diâmetro 
5. Tampar o tubo de ensaio com a rolha fixada à tira de papel de filtro, tendo o 
cuidado de não deixar que a tira permaneça em contato com a parede interna do 
tubo. 
6. Mergulhar a tira de papel de filtro no solvente +/- 1,5 cm, evitando que o ponto 
de aplicação da mistura permaneça em contato com o solvente. 
7. Esperar o tempo suficiente para a frente do solvente chegar até +/- 1,5 cm da 
rolha. 
8. Retirar a tira de papel de filtro da rolha e tampar novamente o tubo. 
9. Marcar imediatamente a lápis o ponto atingido pela frente do solvente. 
10. Secar a tira de papel de filtro na estufa a 90-100° C por +/- 1 minuto. 
11. Revelar o cromatograma pulverizando o papel com a solução reveladora. 
12. Secar a estufa a 90-100° C.