Apostila Pratica BioCel

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DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA 
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS 
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
 
 
 
 
BIOLOGIA CELULAR (BIO-206) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS DE ESTUDO DA 
CÉLULA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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I. INSTRUMENTAÇÃO EM CITOLOGIA: O MICROSCÓPIO FOTÔNICO 
 
 
 A célula, o objeto de estudo da Citologia, pode ser estudada sob diversos 
aspectos: podemos procurar conhecer sua forma e a de seus constituintes, a 
natureza química desses constituintes e seu modo de funcionamento. Em outras 
palavras, essas investigações são denominadas morfológicas, químicas ou 
bioquímicas e fisiológicas e a cada uma delas correspondem métodos de estudo 
particulares. Esta parte do curso de Citologia tratará justamente de introduzir o aluno 
nos diversos tipos de abordagem normalmente utilizados no estudo da célula. 
 De uma maneira geral, podemos dizer que, devido às suas pequenas 
dimensões, um estudo detalhado da célula e de seus constituintes com a vista 
desarmada é virtualmente impossível. Para se ter uma idéia, as dimensões mais 
comumente observadas entre as células de animais e vegetais superiores, situam-se 
na faixa de 10 a 20 µm (lembrar que 1 µm = 10-3 mm; 1 nm = 10-6 mm e 1 å = 10-1 nm). 
Por isso, o citologista é obrigado a se utilizar de instrumentos de aumento para a 
observação conveniente da célula. 
 Os estudos morfológicos ou morfofisiológicos da célula começam 
normalmente com o emprego do microscópio óptico, mais corretamente denominado 
de microscópio fotônico (por se utilizar da luz como fonte de formação de imagens) 
ou microscópio composto (pode ser constituído por dois sistemas de lentes 
sobrepostas: a objetiva e a ocular). Este instrumento pode ser considerado como a 
ferramenta básica e indispensável de todo o citologista. 
 A observação da célula ao microscópio fotônico é feita por luz transmitida, 
possibilitando assim que detalhes estruturais internos possam ser evidenciados. 
Contudo, esta observação por transmissão de luz exige que o objeto a ser estudado 
responda a certas condições. Para que a luz possa atravessá-lo, o objeto deve ser 
suficientemente fino. No caso da célula, para se ter uma imagem conveniente sem 
grande sobreposição de estruturas, essa espessura deve ser da ordem de 5 µm. 
Como raramente uma célula apresenta uma espessura tão pequena, somos 
obrigados a fazer fatias ou cortes da célula para atingir a espessura desejada. 
 Além da espessura, a observação da célula por transmissão ao microscópio 
fotônico apresenta ainda um outro problema: ela só é efetiva se certas regiões do 
objeto absorverem mais luz do que outras, ou seja, se esse objeto apresentar 
contrastes. Como em geral os constituintes celulares têm muito pouco contraste, o 
citologista é obrigado a lançar mão de certos artifícios para contornar esse problema. 
A alternativa mais lógica é criar, artificialmente, este contraste, no nível de certas 
estruturas celulares. Isto pode ser obtido através do uso de corantes, que são 
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substâncias que absorvem certos comprimentos de onda da luz visível e têm 
afinidade por determinados constituintes celulares. Uma outra maneira de se criarem 
contrastes artificialmente é através da utilização de certas montagens ópticas 
especiais que são capazes de ampliar as pequenas diferenças de contrastes 
existentes entre as diversas regiões da célula. Como exemplo dessas montagens, 
temos o microscópio de fase, o microscópio de interferência, o microscópio de 
polarização, etc. 
 
- Partes do Microscópio Composto. 
 
 Compõe-se fundamentalmente das seguintes partes: 
 
A) Partes Mecânicas 
 
1. PÉ - é a base do aparelho e suporta todas as outras partes. 
2. BRAÇO - preso ao pé, rígido ou articulado, suporta o canhão, a platina, o 
condensador e o espelho (ou fonte luminosa). 
3. CANHÃO - é o tubo onde se dispõem as parte ópticas de ampliação; pode ser fixo 
ao braço ou possuir movimento vertical. 
4. REVÓLVER - é uma peça giratória onde se conectam as objetivas e que permite a 
instantânea mudança das mesmas. 
5. PLATINA - é a mesa de trabalho, onde se coloca a preparação para exame; possui 
uma abertura central que dá passagem à luz proveniente da fonte; pode ser fixa ao 
braço (se o canhão for móvel) ou possuir movimento vertical (se o canhão for 
fixo). 
6. "CHARRIOT" - é um dispositivo preso à platina, dotado de movimento antero-
posterior e lateral, destinado a movimentar a preparação. 
7. PARAFUSO MACROMÉTRICO - é um dispositivo destinado a dar grandes e rápidos 
deslocamentos verticais ao canhão ou à platina; serve para focalização grosseira. 
8. PARAFUSO MICROMÉTRICO - é um dispositivo destinado a dar pequenos e lentos 
deslocamentos verticais ao canhão ou à platina; serve para focalização fina. 
 
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B) Sistema de iluminação 
 
1. ESPELHO OU FONTE DE LUZ DIRETA - preso à parte inferior do braço, refletindo 
ou projetando a luz para a parte inferior do condensador. 
2. DIAFRAGMA OU ÍRIS - colocado sob o condensador, destinado a restringir o 
diâmetro do feixe luminoso. 
3. CONDENSADOR - é um sistema óptico de refração preso à parte inferior do braço, 
sob a platina, podendo ou não possuir movimento vertical (e lateral para 
centragem), destinado a fazer convergir sobre a preparação a luz proveniente da 
fonte. 
 
C) Sistema de ampliação 
 
1. OBJETIVA 
2. OCULAR 
 
- Princípios de Formação de Imagem ao Microscópio Fotônico 
 
 A luz proveniente da fonte luminosa, seja ela direta ou refletida, após 
atravessar o condensador, é concentrada sobre a preparação. A luz incidente no 
condensador deve ser paralela para que toda a luz emergente possa convergir no 
foco daquele sistema óptico. Assim, no caso da existência de espelho, a face plana 
deve ser utilizada quando a luz for artificial e emitir luz paralela e a face côncava 
quando a luz for natural (difusa) ou artificial divergente. 
 A preparação (objeto) a ser observado deve ter como vimos, uma espessura 
reduzida para permitir a transmissão da luz. Cada um de seus pontos funciona como 
fonte intensa para a formação de imagens pela objetiva. 
 A objetiva fornece uma imagem real, ampliada e invertida da preparação, 
conforme se pode ver na construção geométrica da Figura 1. Nessa figura, Ho é a 
preparação, Hi a imagem formada pela objetiva, F1 e F2 os focos, f a distância focal 
da objetiva e D a distância entre a objetiva e a imagem. Note que a objetiva foi 
considerada, para efeitos didáticos, como uma lente simples, apesar de ser, na 
realidade, um sistema de lentes. Como veremos adiante, o mesmo foi feito com 
relação à ocular. Contudo, as relações obtidas são as mesmas. 
 Analisando a construção geométrica da Figura 1, pode-se tirar a relação: 
 
Hi = D - 1 
Ho f 
 
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 De onde se conclui que a distância focal e o poder de ampliação de uma 
objetiva são inversamente proporcionais, ou seja, quanto menor for a distância focal 
da objetiva, maior será seu poder de ampliação (maior o Hi). 
 A imagem fornecida pela objetiva será novamente ampliada pela ocular, 
funcionando essa imagem, portanto, como "preparação" ou "objeto" para a ocular. 
Assim, esta lente fornecerá uma imagem virtual, ampliada e direta dessa imagem já 
formada pela objetiva, como se pode ver na Figura 2. Nessa figura temos também que 
o Ho é a preparação (no caso a imagem formada pela objetiva), Hi a imagem formada 
pela ocular, F1 e F2 os focos, f a distância focal e D a distância entre a lente e a 
imagem. 
 Analisando-se a construção geométrica da Figura 2, temos: 
 
Hi =D + 1 
Ho f 
 
 De onde se conclui que, similarmente à objetiva, a distância focal e o poder de 
ampliação da ocular são inversamente proporcionais, ou seja, quanto menor for a 
distância focal de uma ocular, maior será seu poder de ampliação. 
 Na Figura 3 podemos observar a marcha dos raios luminosos em um 
microscópio fotônico, desde a preparação até a formação de imagem virtual da 
ocular e convertida em imagem real na retina do observador. 
 Nessa figura existem alguns parâmetros considerados importantes. Um deles 
é a distância de trabalho, que é simplesmente a distância entre a preparação e a lente 
frontal da objetiva. No caso, quanto maior for o aumento da objetiva (menor distância 
focal), menor será a distância de trabalho. 
 Um outro parâmetro é a região crítica, que é a região onde devem ser 
formadas as imagens fornecidas pela objetiva, para que a ocular possa torná-las 
virtuais e ampliadas e situadas a uma distância que não pode ser menor que a d 
(distância mínima de visão distinta). 
 O comprimento óptico é simplesmente a distância entre os focos da objetiva e 
da ocular. 
 
- Poder de Resolução 
 
 O poder de resolução de um microscópio fotônico ou outro instrumento óptico 
qualquer, pode ser definido como a capacidade que este sistema possui de formar 
imagens distintas e nítidas de dois pontos situados muito próximos em uma 
preparação. O limite máximo de resolução teórico é aproximadamente a metade do 
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comprimento de onda da fonte luminosa. Como o microscópio fotônico usa luz 
visível (4000 a 7000 å ou 400a 700 nm), o máximo de poder de resolução deste 
aparelho estaria em torno de 2000 å (ou 200 nm). 
 
- Abertura Geométrica de uma Objetiva 
 
 É um parâmetro que caracteriza uma objetiva, sendo definido como o ângulo 
máximo formado pelos raios luminosos extremos que partem de um ponto da 
preparação, situado sobre o eixo óptico, atingindo os bordos da lente. Na Figura 4: 
ag = 2µ 
 
- Objetivas de Imersão - Abertura Numérica de uma Objetiva 
 
 Para se aproveitar uma maior quantidade de luz quando a objetiva é de grande 
aumento e, portanto, de pequeno diâmetro e sendo utilizada a uma distância de 
trabalho muito pequena, trabalha-se com a lente frontal imersa em um líquido de alta 
refringência, em geral óleo de cedro (índice de refração de 1,575). Com o emprego 
deste óleo, pode-se fazer convergir o feixe luminoso proveniente do condensador, 
captando-se aqueles raios luminosos que, com objetivas secas, seriam perdidos. 
Estas objetivas são denominadas de objetivas de imersão. A conseqüência direta do 
emprego dessas objetivas é o aumento da luminosidade. 
 Como o índice de refração do líquido de imersão (n) altera a distância de 
trabalho e, consequentemente a abertura geométrica da objetiva, foi criado um novo 
parâmetro que é a abertura numérica. Este parâmetro, normalmente impresso no 
próprio suporte metálico da objetiva, é definido como (Figura 5): 
 
an = n . sen µ 
 
Onde n = índice de refração do meio 
 µ = metade da abertura geométrica 
 
 No caso de uma objetiva seca, não existe óleo, e o índice de refração (n) 
corresponderá ao do ar que é 1. Portanto: 
 
an = sen µ 
 
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Poder Penetrador 
 
 É a capacidade que tem uma objetiva de permitir a observação simultânea de 
pontos situados em diferentes níveis de preparação. Pela Figura 6 pode-se verificar 
que a distância entre as imagens dos planos extremos da preparação, com objetivas 
de pequena distância focal (F2) é bem maior do que com objetivas de grande 
distância focal (F1). Assim, podemos concluir que quanto maior for o aumento da 
objetiva (e menor sua distância focal), menor será seu poder penetrador. 
 
II. EXAME A FRESCO E COLORAÇÃO VITAL 
 
1. EXAME A FRESCO 
 
 O exame a fresco é um método muito simples, consistindo na observação ao 
microscópio de células, pequenos organismos vivos ou fragmentos de tecidos vivos, 
num meio líquido o mais próximo possível do meio natural desses organismos. 
 A finalidade desse método é permitir a observação de estruturas "in vivo", de 
modo a poder observar manifestações funcionais, como a ciclose, reações a 
estímulos, etc., além de ser importante na contraprova de outros métodos de estudos 
de estrutura celular que utilizem o estudo de células mortas. 
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Para que a célula sobreviva o maior tempo possível, é necessário o uso de líquidos 
chamados conservadores fisiológicos que são soluções que proporcionam às 
células que estão sendo observadas condições as mais aproximadas possíveis do 
seu ambiente natural. Isso possibilita um exame mais prolongado. 
 Podemos classificar os líquidos conservadores em naturais e artificiais: 
 
(a) Líquidos naturais: água doce (organismos aquáticos), água do mar (para 
organismos marinhos), humor aquoso (do globo ocular de bovinos), soro 
sangüíneo (técnicas de cultura de tecido), líquido amniótico, líquido ascítico 
(obtido de processos patológicos), etc. 
 
 (b) Líquidos artificiais: 
- Soro Fisiológico 
 NaCl em água - 0,9% para mamíferos 
 0,8% para anfíbios 
 0,6% para insetos 
- Líquido de Ringer 
 Cloreto de sódio 
 Cloreto de potássio 
 Cloreto de cálcio 
 Bicarbonato de sódio 
 Água destilada 
- Líquido de Knop - para órgãos e tecidos vegetais. 
- Líquido de Tyrode - para hematologia. 
 
(Esses últimos, além dos sais acima, levam em sua composição magnésio, glicose, etc.). 
 
 A grande vantagem desse método é não produzir modificações nem na forma 
nem na função do objeto examinado, servindo portanto de contraprova para outros 
métodos. Outra vantagem é a sua rapidez. 
 O emprego do exame a fresco está restrito dentro de estreitos limites: só se 
aplica a objetos finos e transparentes; não permite observações prolongadas e 
mostra apenas uma pequena parte dos detalhes das estruturas. É, portanto, 
relativamente grosseiro e leva eventualmente à morte celular. 
 O exame a fresco pode ser feito entre lâmina e lamínula, utilizando-se líquidos 
fisiológicos. O condensador deve ser abaixado nos microscópios comuns ou a 
observação deve ser feita em fase. Se for necessário, para evitar o esmagamento (por 
exemplo para visualizar o movimento de protozoários), deve-se suspender a 
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lamínula entre quatro pilares de cera, ou utilizar o método da gota pendente, que tem 
a vantagem de criar uma micro-câmara úmida para observações mais prolongadas. 
Consiste na utilização de uma lâmina escavada com uma lamínula contendo uma 
pequena gota de material nessa região. A gota deve ficar suspensa. A câmara assim 
construída pode ser vedada com parafina. 
 
2. COLORAÇÃO VITAL 
 
 O método da coloração vital constitui um procedimento intermediário entre a 
observação a fresco e a observação após a fixação. Constitui-se o uso de corantes 
não tóxicos que permitem que as células continuem vivas, embora penetrem 
facilmente no organismo. 
 
 Corantes vitais 
- Azul de Metileno - para observação, por exemplo, de protozoários entre lâmina e 
lamínula. 
- Vermelho Neutro. 
- Verde Janus - cora mitocôndria. 
- Carmin Lítico. 
 
 Esses corantes se empregam em grandes diluições, de 1:500 até 1:100.000, 
variando a diluição para cada corante e para cada uso, por exemplo, se destinar a ser 
injetado, ou se, simplesmente, o organismo for mergulhado no corante. 
 Esses corantes não reagem quimicamente com nenhuma estrutura celular. A 
coloração vital se processa apenas por atração eletrostática entre o corante e a 
estrutura. 
 Demonstrar a existênciareal dos diversos elementos morfológicos revelados 
pelos materiais fixados. É, entretanto, uma técnica limitada pelo pouco detalhe de 
estrutura que fornece. 
 
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III. FIXAÇÃO 
 
 Os métodos de exame a fresco dão apenas informações insuficientes sobre a 
célula viva porque os elementos que a constituem possuem mais ou menos o mesmo 
índice de refração, o que de certo modo é resolvido pelo microscópio de contraste de 
fase ou outras montagens ópticas especiais. 
 Um pedaço de tecido cortado de um organismo não mantém sua estrutura, ao 
nível microscópico, por causa principalmente da: 
. evaporação 
. diferenças osmóticas 
. ataques de microorganismos 
. autólise (auto digestão das células pelas suas próprias 
 enzimas ativadas pela cessação da atividade metabólica 
 vital e normal das células). 
 
 Para estudar a estrutura da célula é necessário proceder à coloração, 
suprimindo com a cor a falta de contraste das células. A coloração é muito limitada e 
quase impossível no estado vivo, por isso é necessário matar as células para se 
proceder à coloração. 
 A fixação é uma operação destinada a matar as células, conservando-as o 
mais próximas possível do seu aspecto quando vivas. O fixador, portanto, deve 
imobilizar a célula, conservar exatamente todas as suas partes constituintes e não 
fazer aparecer novos detalhes de estrutura (artefatos). Desse modo será possível ao 
pesquisador utilizar corantes tóxicos, fazer testes histoquímicos que raramente são 
aplicáveis a células vivas, manter preparações permanentes, cortar os tecidos em 
secções finas, para o estudo da estrutura intracelular e principalmente das relações 
intercelulares. 
 Não existe um fixador absolutamente perfeito; portanto, o melhor fixador será 
aquele que apresentar o menor número possível de modificações secundárias no 
tecido analisado. Um tecido bem fixado mostrará células bem preservadas, 
permitindo a visualização de detalhes de sua estrutura fina. 
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- A Qualidade dos fixadores 
 
1) Poder de Penetração: o fixador deve penetrar rapidamente tanto nas camadas 
superficiais como nas profundas; de outro modo, as camadas internas poderão se 
necrosar antes de serem atingidas por ele. 
 
2) Deve alterar os constituintes da célula, de modo a torná-los insolúveis: esta ação 
não deve ser violenta e instantânea; ao contrário, deve-se produzir secundariamente 
em relação à morte das células, de modo a não produzir contrações. 
 
3) A acidez é uma qualidade importante, sendo o ácido acético um dos mais 
empregados. O meio alcalino dificulta a coagulação, nos fixadores que agem desta 
maneira. 
 Em resumo, o bom fixador deve: favorecer a observação das estruturas; impedir o 
aparecimento de alterações; impedir o aparecimento de estruturas artificiais; não 
impedir colorações posteriores; aumentar a afinidade do tecido pelos corantes; 
impedir o desaparecimento dos elementos solúveis e possuir alto poder de 
penetração. 
 
Agentes Fixadores 
 
 Podem ser Físicos e Químicos 
 
 Físicos 
 
 O frio não é, em geral, um bom agente fixador, no máximo ele suspende as 
alterações devidas à necrose e à digestão enzimática. Além disso, a formação de 
cristais e o aumento de volume dos líquidos com o congelamento acarretará 
distorções no material.* 
 O calor exerce uma ação bem diferente, segundo seja aplicado a objetos 
úmidos ou secos. Os fixadores em ebulição são utilizados para certos casos. O calor 
seco tem uso em esfregaços previamente desidratados, podendo, entretanto, 
provocar distorções. 
 
 
*
 Empregado juntamente com agentes crioprotetores (como o glicerol), 
que impedem a formação de cristais, é muito utilizado em exames 
citológicos rápidos como, por exemplo, em patologia. 
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 Químicos 
 
 São preferíveis para o estudo dos tecidos. Podemos classificá-los de modo a 
reuni-los em dois grandes grupos de acordo com seu efeito sobre as proteínas (o que 
pode ser testado com uma solução de albumina). 
 
1) Coagulantes - agem como o calor, coagulando as proteínas, transformando o 
protoplasma celular numa rede. Ex.: metanol, etanol, acetona, ácido nítrico, ácido 
pícrico, etc. 
 
2) Não coagulantes - ex: ácido acético, formaldeído, tetróxido de ósmio e dicromato 
de potássio. 
 
 Esses agentes fixadores, entretanto, não são capazes de reunir, 
individualmente, todas as qualidades necessárias para um bom fixador. É raro, 
portanto, que se empregue, hoje em dia, um fixador único. Utilizam-se, isso sim, 
misturas de fixadores de maneira a que um componente complete a ação do outro. 
Algumas das misturas fixadoras mais usadas: 
(a) Bouin - ácido pícrico, formalina e ácido acético glacial. Trata-se de um fixador 
extremamente penetrante, que praticamente serve para todas as espécies de 
trabalho. 
(b) Zenker - dicromato de potássio, cloreto de mercúrio e sulfato de sódio. Esse 
fixador apresenta o inconveniente de exigir uma lavagem cuidadosa do material 
por tempo prolongado. 
(c) Carnoy - ácido acético, metanol e clorofórmio. Usado em citogenética. 
 
 A fixação química é normalmente realizada imergindo-se a peça a ser estudada 
no fixador. O volume deve ser 20 a 30x da peça a ser fixada. Para peças de grande 
tamanho, é útil usar-se o método da perfusão, que consiste em injetar o fixador 
através da rede vascular do organismo. 
 
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IV - COLORAÇÃO 
 
 Os processos de coloração têm um papel importante na técnica histológica. 
Uma boa parte do conhecimento a respeito dos corantes é devida a Otto Witt que em 
1876 apresentou uma teoria sobre a coloração. Segundo Witt a cor é condicionada 
por certos grupos ou radicais que ele chamou de cromóforos. De acordo com as 
idéias atuais, esses seriam constituídos por conjuntos de átomos não saturados, 
responsáveis pela cor das moléculas das quais eles fazem parte. Em sua maioria são 
substâncias aromáticas que têm a possibilidade de alterar rapidamente a 
configuração da molécula entre os vários estados possíveis, sendo essas alterações 
denominadas ressonância, envolvendo a absorção de ondas eletromagnéticas. 
 As substâncias que possuem um ou vários cromóforos são chamadas 
cromogênios. Dito de outro modo, os cromóforos são grupamentos atômicos que 
dão a potencialidade de coloração às moléculas que são então chamadas de 
cromogênios. 
 Um exemplo de cromóforo é a quinona. A quinona por si só não tem a 
tendência a se ligar a uma substância de uma preparação microscópica, pois as 
substâncias que apresentam essa tendência se ionizam em solução aquosa e a 
quinona não. Portanto, não basta somente que a substância tenha cor, isto é, um 
cromóforo por si só não confere à molécula a capacidade tintorial. Um grupo 
ionizável é também necessário. Esses grupos ionizáveis que transformam 
substâncias coloridas em corantes são denominados auxocromos. Além de 
geralmente conferir o poder tintorial, os auxocromos aumentam a intensidade da cor, 
como seu nome sugere. Um dos auxocromos mais comuns em corantes é o grupo -
NH2, grupo amida. 
 Tintóforos por outro lado, são grupos que não modificam o espectro de 
absorção e, portanto, a coloração de um cromogênio, mas fazem aparecer o poder 
tintorial, agindo nesse sentido da mesma forma que os auxocromos. 
 Dentre os radicais que agem como tintóforos, temos por exemplo o grupo 
carboxila, -COOH. 
 A finalidade da coloração não é a obtenção de uma imagem de diversos 
coloridos, mas acentuar os contrastes das estruturas celulares. 
 
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Classificação dos Corantes 
 
 Os corantes podem ser classificados, de acordocom sua origem, em naturais 
e artificiais (ou sintéticos). 
A) Naturais - produtos extraídos de animais, como o carmin, ou dos vegetais, como a 
hematoxilina, a orceína, etc. 
B) Artificiais ou sintéticos - derivados da destilação da hulha e, genericamente 
conhecidos como corantes de anilina. Do ponto de vista químico, esses 
corantes são sempre sais, podendo assim ter caráter ácido, básico, neutro ou 
indiferente. 
 
(a) Corantes ácidos: 
 Nesses corantes a base é incolor e o ácido é colorido (cromóforo). Temos por 
ex.: a Eosina em que a propriedade do corante é devida ao ácido eosínico; na parte 
básica, temos o sódio que é incolor. Outros exemplos: Fucsina ácida, Vermelho 
congo, Eritrosina. Tingem o citoplasma, a quitina, etc., de reação básica (acidófilos). 
 
(b) Corantes básicos: 
 Possuem a base colorida e o ácido incolor. Temos por exemplo, o azul de 
metileno, que é um cloridrato de azul de metileno; o poder do corante é devido ao 
composto básico de azul de metileno e não ao ácido clorídrico que é a parte incolor. 
Outros exemplos: Fucsina básica, Azul de Toluidina, Violeta de Genciana. São 
corantes absorvidos com certa avidez pelas estruturas celulares de reação ácida 
(basófilas) como a cromatina. 
 
(c) Corantes neutros: 
 Tanto o ácido como a base são coloridos. Ex.: o Eosinato de Azul de Metileno. 
Esses corantes se obtêm misturando partes convenientes de corantes ácidos e 
básicos e têm grande importância em estudos hematológicos. 
 
(d) Corantes indiferentes: 
 Não são nem ácidos nem básicos e são incapazes de formar sais. São 
insolúveis em água, mas solúveis em álcool e nos lipídios. São desse grupo os 
corantes de lipídios Sudan III e Vermelho Escarlate. 
 
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- Mordente 
 
 Uma coloração pode ser direta ou indireta, dependendo do fato de haver ou 
não uma substância intermediária entre o corpo a ser colorido e o corante. 
 Os sais de certos metais alteram radicalmente o comportamento de certos 
corantes. Esses sais metálicos são chamados mordentes. Forma-se um complexo 
tecido-mordente-corante e, uma vez formado, ele é insolúvel em todos os fluidos 
neutros usados ordinariamente em histologia, de modo que facilita os procedimentos 
posteriores. O mordente provoca uma combinação química entre dois corpos que 
não têm afinidade química entre si. Forma-se então o precipitado fortemente colorido 
e insolúvel em água. 
 Exemplo: os alúmens que, em geral, são sulfatos duplos de alumínio e outro 
metal, têm a propriedade de formar, com certos corantes, soluções intensamente 
coloridas e com propriedades seletivas. 
 
- Marcha de Coloração 
 
 Coloração Progressiva - nesse tipo de coloração, a absorção do corante pelas 
células é controlada e interrompida no ponto desejado. 
 
 Coloração Regressiva - nesse caso, há um exagero de absorção do corante, 
ou super coloração que, em seguida deve ser extraído novamente. A diferenciação 
consiste na remoção do excesso de coloração até que o corante fique retido apenas 
pelos componentes celulares ou tissulares que interessam ao estudo. Pode ser 
obtida pelo emprego do álcool etílico puro ou acidificado, por exemplo. 
 
Tipos de Coloração 
 
 Ortocromática - quando o tecido aparece corado nas cores do próprio corante. 
 Metacromática - quando o tecido aparece com cor ou cores diferentes das do 
corante. Ex.: Azul de Toluidina, entre pH 4,5 e 5,0 cora o DNA em azul e o RNA em 
vermelho. 
 
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V. INCLUSÃO E MICROTOMIA 
 
 A maior parte das peças fixadas deverá ser tratada posteriormente, de modo a 
permitir sua observação por meio da luz transmitida. 
 Para isso, é preciso reduzi-la a fatias delgadas, obtidas por cortes. Esses 
cortes, com espessura de 3 a 4 µm são impossíveis de obter em tecidos frescos ou 
mesmo fixados. Desse modo, faz-se a inclusão da peça numa substância plástica que 
permita a obtenção de secções finas do tecido. A substância deve penetrar 
totalmente até os componentes celulares mais delicados, de modo a preservar a 
estrutura fina. 
 É possível então orientar e manusear as peças. 
 
- Meios ou Massas de Inclusão 
 
1) Meios aquosos - não é necessário, neste caso, desidratar as peças. Utilizados 
principalmente para pesquisas de fisiologia celular e histoquímica ou anatomia 
vegetal. 
 - gelatina glicerinada: para organismos delicados; 
 - goma (arábica) glicerinada: para objetos duros e quitinosos, como pelos de 
mamíferos, por exemplo. 
2) Meios anidros - são muito comuns nos estudos gerais de Histologia. Utilizam 
produtos de inclusão insolúveis em água, sendo, portanto, imprescindível a 
desidratação da peça, uma vez que a água é parte integrante dos tecidos. Após a 
desidratação, impregna-se a peça com o solvente do meio de inclusão. 
 
(a) Celoidina 
 Nesse caso, é feita a impregnação a frio dos objetos com nitrocelulose 
dissolvida numa mistura de álcool e éter. O uso dessa massa de inclusão permite 
executar cortes de grandes diâmetros, sem riscos de quebras, como ocorre com a 
parafina. É conveniente para objetos pouco homogêneos ou que apresentam grandes 
cavidades, para materiais duros ou fibrosos (artrópodos, por ex.), ou para tecidos 
que suportam mal as elevações de temperatura. Não há necessidade de remover a 
celoidina dos cortes, o que facilita o manejo. Entretanto, é um processo muito 
demorado (pode levar meses), sendo muito difícil obter cortes finos, e quase 
impossível obtê-los em série. A conservação dos blocos é difícil e é necessário o uso 
de um micrótomo de deslizamento, especial, que molha automaticamente o bloco e a 
navalha com álcool 70, à medida que vai cortando. 
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 (b) Inclusão em parafina 
 A parafina é uma mistura de hidrocarbonetos saturados sólidos extraídos por 
resfriamento dos resíduos pesados do petróleo. Tem pouca afinidade (parum affinis) 
química (inerte). É muito solúvel no xilol, sendo entretanto insolúvel no álcool e na 
água. 
 As vantagens da parafina consistem em permitir a obtenção de cortes finos; o 
processo de inclusão é rápido (24 horas); é possível obter cortes seriados pela 
facilidade de produção de fitas; os blocos podem ser guardados indefinidamente. 
 Existem, também, algumas, como por exemplo, tecidos de difícil penetração, 
tais como ossos, dentes, etc. Estes tecidos necessitam de longo tempo de inclusão, 
o que é desaconselhado, pois este processo extrai lipídeos, uma vez que os agentes 
de diafanização e desidratação são solventes de lipídios. 
 
(c) Inclusão em resinas plásticas - particularmente as resinas acrílicas têm sido cada 
vez mais empregadas em histologia no lugar da parafina, principalmente por 
permitirem cortes mais finos (1-3 µm) e, portanto, com melhor definição das 
estruturas celulares. 
 
- Procedimento para a inclusão em parafina 
 
1) Desidratação pelo álcool - com duração variável, de acordo com o tamanho da 
peça. 
2) Impregnação em solvente de parafina - consiste em trocar por um solvente de 
parafina o álcool que impregna o objeto desidratado. Essa operação é chamada 
diafanização, uma vez que os líquidos utilizados tornam o material transparente. 
Os líquidos devem ser solúveis em álcool em todas as proporções. O xilol é 
bastante utilizado neste procedimento. 
3) Impregnação em parafina - não pode ser feita a frio, uma vez que a parafina é 
sólida à temperatura ambiente. Durante a impregnação, a parafina deve ser 
mantida na estufa, próxima a seu ponto de fusão (aproximadamente 60oC). 
4) A peça agora é retirada do banho de parafina e levada para uma forma vaselinada 
cheia de parafina fundida. A peça deve ser orientada. A parafina se solidifica 
rapidamente, de modo que a orientaçãodo corte fica fácil. Esfria-se rapidamente a 
parafina, de modo a não formar cristais de grande tamanho ou bolhas. 
 Quando o processo é bem feito, pode-se guardar o material indefinidamente. 
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• Corte dos blocos - usa-se um micrótomo automático que regula a espessura dos 
cortes, aderindo-se uns aos outros, de modo a se obter uma fita. As fitas são 
fáceis de manipular, com o auxílio de um pincel e se pode obter cortes em série 
(cortes seriados). 
• Montagem dos cortes - os cortes são esticados em água aquecida a 40oC e 
"pescador" com uma lâmina albuminizada com o auxílio de um pincel o excesso 
de água é escorrido e os cortes secos em estufa a 40oC. Posteriormente a 
parafina é retirada das preparações, banhando-se as lâminas em xilol. 
 
- Coloração dos cortes com hematoxilina-eosina (HE) 
 Para se fazer a coloração do material (esfregaço de mucosa bucal, por ex.), 
este precisa ser hidratado de maneira lenta através de uma série de álcoois em 
concentrações cada vez menores. A razão disto é que os corantes são aquosos. Para 
montagem permanente, o material precisa ser diafanizado pelo xilol e montado em 
Bálsamo do Canadá (ver mais abaixo). Assim, o xilol age como diafanizador e 
também como solvente do bálsamo. Uma vez que o xilol não é miscível em água (nem 
o bálsamo), o material deve ser desidratado novamente. Se o xilol ficar turvo, ou 
aparecerem bolhas de água na preparação, é porque o material não foi 
convenientemente desidratado. 
 
• Montagem permanente - consiste em colocar o objeto entre lâmina e lamínula, em 
um líquido refringente, que servirá de meio de conservação e meio de observação. 
Esse meio deve se tornar sólido posteriormente. 
 O meio de montagem deve ter índice de refração próximo ao do vidro, deve 
secar rapidamente, não rachar, nem se alterar. Os meios de montagem mais usados 
são o Bálsamo do Canadá, resina proveniente de coníferas da América do Norte 
(sendo que o material, nesse caso, deve estar totalmente desidratado), o Euparal que 
tem a desvantagem de não secar muito rapidamente e o Permount que seca 
rapidamente. 
 Além dos processos de inclusão acima discutidos, existem outros métodos 
que permitem o corte do material biológico a ser estudado ao microscópio de luz. Um 
destes métodos envolve, por exemplo, o congelamento do material em nitrogênio 
líquido e seu corte posterior em um micrótomo refrigerado denominado de criostato. 
Em método rápido, muito útil em patologia quando, por exemplo, se necessita de 
uma análise imediata de um tecido. Para determinados tipos de material que tenham 
uma certa consistência é possível fazer ainda cortes a mão livre, com resultados 
razoáveis. É o caso de alguns tipos de tecidos vegetais, como caules e folhas.