Aula 03 (05-09) - Espectrofotômetro e Absorbância

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BIOQUÍMICA E BIOFÍSICA EXPERIMENTAL 
 
Código da disciplina: CEL0083 
Prof. Fernando Fortes de Valencia 
 
 
Aula 03 (05/09) - Espectrofotômetro e Absorbância ................................................................... 2 
Espectrofotômetro ............................................................................................................................................................ 2 
Absorbância ......................................................................................................................................................................... 4 
Aula Prática .......................................................................................................................................................................... 6 
Caderno do Grupo ............................................................................................................................................................ 8 
Gráfico.................................................................................................................................................................................. 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AULA 03 (05/09) - ESPECTROFOTÔMETRO E ABSORBÂNCIA 
 
ESPECTROFOTÔMETRO 
 
Espectrofotômetro é um aparelho amplamente utilizado em laboratórios, cuja função é a de medir 
e comparar a quantidade de luz (energia radiante) absorvida por uma determinada solução. Ou seja, 
é usado para medir (identificar e determinar) a concentração de substâncias que absorvem energia 
radiante em um solvente. 
 
 
 
Em geral, um espectrofotômetro possui uma fonte estável de energia radiante (normalmente uma 
lâmpada incandescente), um seletor de faixa espectral (monocromatizadores como os prismas, que 
seleciona o comprimento de onda da luz que passa através da solução de teste), um recipiente para 
colocar a amostra a ser analisada (a amostra deve estar em recipientes apropriados como as cubetas 
e tubos de ensaio) e, um detector de radiação, que permite uma medida relativa da intensidade da 
luz. 
 
 
Esquema do funcionamento interno de um espectrofotômetro 
 
 
 
 
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A base da espectrofotometria, portanto é passar um feixe de luz através da amostra e fazer a medição 
da intensidade da luz que atinge o detector. O espectrofotômetro compara quantitativamente a 
fração de luz que passa através de uma solução de referência e uma solução de teste. 
 
Antes de utilizar um espectrofotômetro sempre é feita uma calibração, que é fundamental para 
garantir que as medições obtidas no aparelho sejam precisas. 
 
Sendo assim, devemos seguir um passo a passo para calibrá-lo: 
 
1º passo Ligue o aparelho e mantenha a porta do espectrofotômetro fechada. 
2º passo 
Posicione para absorbância (luz no “A”) – botão “T/A/C/F” 
Encontre o botão amarelo e fique apertando para posicionar no “A”, ou seja, a luz 
laranja deve estar ao lado do display no “A”. 
3º passo 
Escolher o 𝛌 (comprimento de onda) – 𝒙 𝑛𝑚; 
Girar o botão redondo preto e posicionar. 
Ex.: Com a solução de CuSO4 (sulfato de cobre) a 8,7%, posicione em ~610 𝑛𝑚. 
4º passo Abra o aparelho e coloque uma cubeta com água destilada. 
5º passo 
O aparelho deve ser zerado para eliminar qualquer possível interferência da cubeta ou 
do solvente nos valores de absorbância). 
Para zerar, aperte o botão 
100% T
0 Abs
 
6º passo 
Retire a cubeta com água e coloque a cubeta com a solução. 
A absorbância aparece automaticamente (não precisa apertar nenhum botão). 
 
Obs.: O carrinho não deve ser mexido. Deixá-lo fixo. (É o pino da frente.) 
 
 
Representação da radiação eletromagnética em relação ao campo elétrico. 
 
 
 
 
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ABSORBÂNCIA 
 
Absorbância é a medida da capacidade de uma substância de absorver radiação eletromagnética 
(como luz) em um comprimento de onda (𝛌) específico. É usada para quantificar a concentração de 
substâncias em soluções, sendo fundamental em análises espectrofotométricas. 
 
Quanto mais intensa é a cor da solução, mais alto é o valor de absorbância. Quanto mais clarinha é 
a cor da solução, mais baixo é o valor da absorbância. Portanto: 
 Valor de absorbância  = cor intensa 
 Valor de absorbância  = cor clarinha 
 
A fração de energia luminosa absorvida por um material num comprimento de onda específico. 
 
Se a solução é azul, é porque a solução não absorveu o comprimento de onda referente a cor azul, 
sendo assim, o que ela mais absorve é o complementar do que ela menos absorve. No caso do azul, 
é o comprimento de onda referente ao laranja. 
 
Por que zerar o espectrofotômetro? 
Para que o valor de absorbância de uma solução não seja interferido pelo valor referente ao solvente 
(água) e a cubeta. 
 
Vejamos um exemplo: O CuSO4 a 8,7% tem a cor azul. 
Em um soluto de cor azul, devemos usar a cor complementar laranja para passar no espectrofotô-
metro. Por qual motivo? 
 
 
 
Um soluto azul absorve luz em seu comprimento de onda complementar, ou seja, na região laranja 
do espectro. O que vemos como cor azul é justamente a luz que não foi absorvida, mas transmitida/ 
refletida. Sendo assim, 
‒ Se a solução é azul, significa que ela não absorve a faixa azul (cerca de 450 𝑛𝑚). 
‒ O espectrofotômetro precisa enviar luz na faixa complementar (laranja, ~600–620 𝑛𝑚), porque 
essa é a faixa que será absorvida pela substância. [No nosso caso = ~610 𝑛𝑚) 
O que significa esses 8,7%? 
Este valor indica a concentração 
ou o grau de pureza do composto. 
 
 
 
 
 
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Portanto, a absorbância medida será significativa e permitirá determinar a concentração do soluto. 
 
Sobre o significado da porcentagem de 8,7 do CuSO4: 
Este valor indica a concentração ou o grau de pureza do composto. 
Ela indica que a solução em questão é composta por 8,7% de Sulfato de Cobre puro. Os outros 
91,3% são provavelmente água (se for uma solução líquida) ou outros materiais inertes/impurezas 
(se for um sólido, como um pó ou grânulos). 
 
Exemplo de contexto: 
Um saco de fertilizante com essa indicação significa que em 100 kg desse produto, 8,7 kg são de 
Sulfato de Cobre puro, que é a fonte dos nutrientes Cobre (Cu) e Enxofre (S) para as plantas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AULA PRÁTICA 
 
Espectrofotômetro é um medidor de comprimento de onda (𝛌) das cores. 
 
Onde introduz a cubeta no aparelho? 
No primeiro “buraquinho”, mais próximo a pessoa que está manuseando o aparelho. 
 
Observações: 
 Verifique se a cubeta está retinha no aparelho. Se estiver torta, muda o resultado. 
 A última casa decimal da leitura do aparelho não é confiável – fica oscilando. Normalmente é 
problema do aparelho. 
 
Soluto do dia: Sulfato de cobre (CuSO4) a 8,7% 
 
A nossa solução, CuSO4 a 8,7% é azul, portanto, tem que usar a cor complementar da luz laranja. 
 
Duas atividades: 
1 - Descubram o valor de absorbância do CuSO4 a 8,7%. 
Resultado = 0,396 
2 - Diluam a solução em 1:6. 
 
O que fizemos? 
 
Usando 1,5 ml ➡ 1/6 = 0,25 𝑚𝑙 
⤷ A cubeta pega até 1,5 ml ➡ ir somente até ¼ dela. 
 
Ficou 1,25 ml de água destilada e 0,25 ml de solução ➡ Resultado = 0,067 
 
Tem que conferir ➡ 0,067 𝑥 6 = 0,396? 
Não. Dá 0,402. Então fizemos o experimento errado. 
 
Quadro com resultado de todos os grupos: 
 
Grupo Absorbância 8,7% Absorbância da diluição Concentração (%) 
1 0,371 1 : 3 ➡ 0,177 2,9 
2 0,344 1 : 4 ➡ 0,139 2,19 
3 0,377 1 : 5,5 ➡ 0,070 1,58 
4 0,385 1 : 6,2 ➡ 0,058 1,4 
5 0,396 1 : 6 ➡ 0,067 1,45 
 
 
 
 
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Média de absorbância de todos os grupos a 8,7% = 0,375 
 
Então, temos: 
 
 Absorbância Concentração (%) 
Original 0,375 8,7 
Grupo 1 0,177 2,9 
Grupo 2 0,139 2,19 
Grupo 3 0,070 1,58 
Grupo 4 0,067 1,45 
Grupo 5 0,058 1,4 
 
Temos os seguintes dados: 
 0,375 de absorbância para 8,7% de concentração 
 0,177 de absorbância para 2,9% de concentração 
 0,139 de absorbância para 2,19% deconcentração 
 0,070 de absorbância para 1,58% de concentração 
 0,067 de absorbância para 1,45% de concentração 
 0,058 de absorbância para 1,4% de concentração 
 
Com base nos dados acima, faça um gráfico de curva padrão, com atenção a alguns detalhes: 
 
⤷ Os números da abcissa (eixo y, que mostra os valores da absorbância) são: 
 
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 
 
⤷ Os números da ordenada (eixo x, que mostra os valores da concentração, em %) são: 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
 
Deixe marcado no meio da imagem os números de concentração, ou seja: 
 8,7 
 2,9 
 2,19 
 1,58 
 1,45 
 1,4 
 
Não deixe os números um em cima do outro. 
 
 
 
 
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CADERNO DO GRUPO 
 
 
Espectrofotômetro ➡ Medidor de comprimento de onda das cores. 
 
Absorbância ➡ Fração da energia luminosa absorvida por um material num comprimento (𝛌) 
específico. 
É o oposto da transmitância? 
 
Se a solução é azul, ela não absorveu o 𝛌 referente a cor azul. Sendo assim, o 𝛌 que mais absorver 
é o complementar ao menos absorvido, no caso, é o 𝛌 referente ao laranja. 
 
Transmitância (T) é uma grandeza que indica a fração da radiação (ou luz) que atravessa uma 
amostra em relação à intensidade inicial. Já a absorbância (A) está relacionada à transmitância por 
uma função logarítmica. 
 
Portanto: 
 Não é exatamente o oposto de transmitância, mas sim uma transformação logarítmica dela. 
 Quando a transmitância diminui (menos luz atravessa), a absorbância aumenta. 
 
Exemplo: 
 Se T = 1 (100% da luz atravessa), então A = 0 (não houve absorção). 
 Se T = 0,1 (10% da luz atravessa), então A = 1. 
 
Gráfico mostrando a relação entre transmitância e absorbância para visualizarmos esse contraste: 
 
 
 
 
 
 
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Aqui está o gráfico : 
 No eixo x ➡ Transmitância (%T), ou seja, quanta luz atravessa. 
 No eixo y ➡ Absorbância (A) 
 
Exemplos destacados: 
 T = 100% → A = 0 (nenhuma absorção). 
 T = 50% → A ≈ 0,30. 
 T = 10% → A = 1,00. 
 T = 1% → A = 2,00. 
 
Quanto menor a transmitância, maior a absorbância. 
 
Por que devemos zerar o espectrofotômetro? 
Para que o valor da absorbância de uma solução (no caso, CuSO4 a 8,7%) não seja transferido pelo 
valor referente ao solvente (água destilada) e a cubeta. 
 
 ATENÇÃO! A última casa decimal do espectrofotômetro não é confiável. 
 
Como utilizamos o espectrofotômetro? 
1º) Posiciona para absorbância (luz no “A”); 
2º) Escolher o 𝛌 – no caso, 610 𝑛𝑚; 
3º) Carrinho (não mexer, deixar fixo) com água na cubeta; 
4º) Zerar a absorbância; 
5º) Colocar a cubeta com a solução; 
 
Nosso experimento: 
▸ Aparelho 1 (com problema) ➡ 0,179 
▸ Aparelho 3 ➡ 0,266 
▸ Aparelho 4 ➡ 0,379 
▸ Aparelho 5 ➡ 0,396 
 
Obs.: Se o aparelho tiver algum erro (de inclinação, por exemplo), é preciso tornar o erro repetitivo 
para que possa ser desprezado no final. 
Não confiar nos valores de absorbância acima de 1. 
 
1 : 6 1,5 mL 
 
 0,25 mL ➡ CuSO4 a 8,7% 1,5 mL da solução diluída 
 + Absorbância = 0,067 
 1,25 mL ➡ Água destilada 
A absorbância é diretamente 
proporcional à concentração; 
comparando 𝛌, sua absorbância 
também será a metade de 𝛌. 
À medida que a concentração 
aumenta, a relação direta com a 
absorção diminui. 
 
 
 
 
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GRÁFICO