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Aspectos Teóricos da Técnica Western Blotting Aluno: Pedro Nonato da Silva Júnior Orientadores: Prof.ª Norma Maria Barros Benevides e Valdécio Silvano Monteiro Bolsista de Iniciação Científica Graduando em Farmácia Objetivos Conceituar western blotting, apresentando um pouco do seu histórico; Citar e descrever os passos do protocolo de western blotting de forma geral; Destacar os eventuais problemas que podem ocorrer, sugerindo o que pode ser feito para revertê-los. Apresentar as vantagens e desvantagens do método; Conceituando western blotting... “É um poderoso e importante método em biologia molecular, também conhecido como protein blotting ou immunoblotting, utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente.” (KURIEN & SCOFIELD, 2006); “O western blotting é utilizado para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou de outras moléculas.” (ABBAS et al., 2008); “Esta técnica permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em determinadas amostras.”(KURIEN & SCOFIELD, 2003); Mas por que western blotting? Western Blotting Southern Blotting Northern Blotting Western Southern Northern Objeto de Estudo Proteína DNA RNA Eletroforese Vertical Horizontal Horizontal Obtenção das amostras Mecânica e/ou soluções Mecânica e/ou soluções Mecânica e/ou soluções Tipo do Gel Acrilamida Agarose Agarose Preparação das Amostras Desnaturação porβ- mercaptoetanol Enzimas de Restrição Desnaturação por Formaldeído Tipo de suporte de transferência PVDF ou nitrocelulose Nylon ou nitrocelulose Nitrocelulose Tratamento do Gel Não Sim, HCl e sol. alcalina Sim, formaldeído Incubação Tampão Anticorpo Primário AnticorpoSecundário Enzima + Substrato Tampão + DNA radiomarcado Tampão + RNA radiomarcado Detecção Colorimétrica Quimioluminescente Fluorescente Auto – Radiografia Auto – Radiografia Preparação das Amostras Fontes de proteína Preparação das Amostras Precauções Rápida remoção do tecido, a dessecação e congelamento (Nitrogênio líquido ou -80 °C); Tecidos frescos ou provenientes de biopsias: sem sangue, soro, estroma indesejável e gordura; Adição de proteases e inibidores de fosfatases; Armazenamento → Homogeneização → Centrifugação; Fracionamento proteico: ↑[Proteína]. Preparação das Amostras Homogeneização Homogeneização mecânica: Homogeneizador; Fácil de limpar e esterilizar; Ossos e cartilagens; Homogeneização ultrassônica Sonicador Pequenos pedaços de tecidos Sangue, fígado e cérebro; Homogeneização por pressão → Microrganismos em suspensão; Lise por detergentes Triton X-100 Tween 80 Nonidet P-40; Saponinas Preparação das Amostras Solubilização Proteica Afeta a qualidade do resultado final e é determinante para o sucesso do processamento; A ruptura das interações que agregam as proteínas permite a separação das mesmas em solução; O processo de solubilização de proteínas implica no uso de: Caotrópicos: uréia ou tiouréia; Detergentes: 3-[(3-Colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano sulfonado (CHAPS) ou Trixton – 100; Agentes redutores: ditiotreitol/ditioeritritol (DTT/DTE) ou tributilfosfina (TBP); Inibidores de proteases/fosfatases/glicosidades; Preparação das Amostras Remoção de Contaminantes Diminuir a heterogeneidade da amostra o máximo possível: SNC → Alto teor de lipídios e ácidos nucleicos; Remoção = resultados de alta qualidade; O pH e a força iônica das amostras influências consideravelmente na solubilidade das proteínas e por esse motivo soluções tampões, soluções salinas e detergentes são incluídos nas amostras; Vale ressaltar que em muitos casos o uso da proteína pura não pode ser feito porque proteínas como albumina e IgGs constituem a grande maioria do concentrado de proteínas nas células. Eletroforese em Gel “A eletroforese é processo analítico de separação de proteínas e outras moléculas, em que a migração de partículas acontece em um campo elétrico (matriz). Para tal evento é necessário que essas partículas sejam dotadas de carga elétrica.” (VESTERBERG, 1989); A separação de proteínas por tamanho é obtida com o uso do gel de dodecilsulfato de sódio – poliacrilamida (SDS – PAGE); Eletroforese em Gel Pré-tratamento com β-mercaptoetanol e SDS: β-mercaptoetanol → agente redutor → cliva as ligações dissulfeto; SDS → detergente aniônico→ desnatura as proteínas; Eletroforese em Gel O gel age como uma peneira molecular: Quanto mais alta a concentração de acrilamida, menores são os poros do gel e as proteínas se movem mais lentamente; Géis com alta concentração de acrilamida são usados para determinar proteínas de tamanho pequeno, ao passo que géis com baixas concentrações de acrilamida são usados na determinação de proteínas grandes; Transferência para a Membrana Objetivo: tornar as proteínas acessíveis à detecção por anticorpos; Tipos de Membranas: Nitrocelulose; Polivinildina diflourada (PVDF); Papel ativado; Nylon; Formas de transferência: Difusão simples; Transferências à vácuo; Electroblotting (transferência úmida ou semi-seca); Bloqueio de Ligações Inespecíficas Etapa necessária para prevenir a interação entre a membrana anticorpo utilizado para detectar a já que o anticorpo é uma proteína; Bloqueio de sítios não - específicos é possível colocando a membrana em uma solução diluída de proteínas (tipicamente soro albumina bovina ou leite desnatado em pó); A proteína na solução diluída ataca membrana em todos os locais onde a proteína - alvo não foi transferida; Isso reduz o ruído no produto final do WB tornando os resultados mais claros e eliminando falsos positivos; Adição do Anticorpo Anticorpos (monoclonais ou policlonais) são utilizados para detectar uma proteína (antígeno ou epítopo) específica; Posteriormente, esta reação antígeno/ anticorpo primário será exposta a um anticorpo secundário direcionado à porções espécie-específicas do anticorpo primário; Normalmente, o anticorpo secundário está ligado à uma enzima reveladora - HRP que gera uma mudança de coloração ou um sinal fotométrico 18 Detecção de Antígenos Detecção em duas fases: Uma solução de anticorpo primário é incubada com a membrana sobre uma gentil agitação de 30min a overnight em temperaturas diferentes; A solução é composta pela solução de bloqueio; Lavar para remover o excesso do primário; A membrana é exposta a outro anticorpo dirigido para a porção específica do anticorpo primário, comumente conjugado a biotina ou a uma enzima repórter (FA/HRP); Também pode-se usar um anticorpo secundário conjugado a peroxidase → cliva agente quimiluminescente para produzir luminescência proporcional a quantidade de proteínas; Detecção em uma fase Detecção de Antígenos Detecção colorimétrica: Depende da incubação do western blotting com o substrato que reage com a enzima reveladora que é ligada ao anticorpo secundário; Corante solúvel → Corante insolúvel → Precipita e colore a membrana; Densitometria ou espectrofotometria; Detecção quimioluminescente: Preconiza a incubação de um substrato fluorescente que ao ser exposto a uma enzima reveladora associada ao anticorpo secundário gera uma coloração; A luz é detectada por um filme fotográfico ou por câmeras CCD, que capturam uma imagem digital do western blotting; Densitometria → avalia a quantidade de proteína colorida e quantifica os resultado em termos de intensidade óptica; Detecção de Antígenos Detecção flourescente: Marcador fluorescente é excitados por luz e a emissão da excitação é detectada por um fotosensor ou câmara CCD; Método de detecção mais específico → quantitativo; Detecção radioativa: Ionização e subsequente autorradiografia para visualização da interação antígeno-anticorpo; Alto custo e muitos riscos à saúde → Desuso; Solução de Problemas sddgsgsgs 23 25 Vantagens do Western Blotting Membranas maleáveis e de fácil uso; As proteínas encontram-se rápida e uniformemente disponíveis a diferentes ligantes, pois estão imobilizadas numa membrana; Alta sensibilidade e especificidade; É possível fazer múltiplas réplicas do gel; Somente uma pequena quantidade de reagentes são necessários para a análise de transferência; O armazenamento da amostra transferida pode ser prolongado; A mesma proteína transferida pode ser usada para múltiplas análises sucessivas; Desvantagens do Western Blotting Custo médio alto; Procedimento longo; Grandes chances de erro em diversos pontos; Problemas de segurança/biossegurança dependendo do sistema de revelação; Referências Bibliográficas MIGUEL, M.P.; MENEZES, L.B.; ARAÚJO; E.G. Western Blotting: a técnica e aplicações na pesquisa e rotina diagnóstica em medicina veterinária. Enciclopédia Biosfera. Goiania. v.8, p. 1704 – 1719, 2012 MAHMOOD, T.; YANG, P. Western Blot: Technique, Theory and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. Hamilton. v.4, p. 429 – 434, 2012
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