SHOUTER BLOTH

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Prof. Dr. Daniel Pascoalino Pinheiro
PhD em Farmacologia molecular com ênfase em Oncologia experimental
SOUTHERN, NORTHERN AND WESTERN BLOT
III Curso de Noções básicas em Biologia Molecular e Citometria de Fluxo
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Outline
• Southern blot;
• Passo a passo da técnica;
• Aplicações;
• Nothern blot;
• Western blot e aplicações da técnica;
• Explicando o passo a passo;
• Análise dos resultados;
• Casos clínicos e questões. 
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Blo*ng
• Técnicas de hibridização em membrana desenvolvidas na década de 70;
• Envolve a transferência de substâncias de um gel para uma membrana
apropriada;
• Anterior ao PCR.
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Southern Blot
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Southern Blot
• Combina os métodos de transferência de fragmentos de DNA
separados por eletroforese em gel para uma membrana e a
identificação desses fragmentos através de sondas específicas.
• A técnica de Southern blot baseia-se na hibridização entre moléculas
de DNA, fixas em um suporte, com sondas (moléculas de DNA ou
RNA) marcadas, visando à localização de sequências específicas de
DNA.
• Desenvolvida por Edwin Mellor Southern em 1975.
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Southern Blot
• Hibridização
Relembrando....
TGCACC
CGTCAT
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Southern Blot
üEtapas:
• Digestão enzimática;
• Eletroforese em gel;
• Transferência para a membrana;
• Hibridização;
• Revelação.
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Southern Blot
vDigestão enzimática
• A amostra de DNA precisa ser “digerida” por enzimas específicas para
que os fragmentos sejam separados pela eletroforese.
Fonte: www.biomedicinaonline.com.br/tecnicasembiologia 
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Southern Blot
vDigestão enzimática
• São utilizadas enzimas de restrição para digestão enzimática;
• Enzimas de restrição são proteínas encontradas em bactérias que
reconhecem uma curta sequência de DNA específica e clivam a dupla
fita em um ponto específico;
• Sistema de defesa.
Fonte: www.biomedicinaonline.com.br/tecnicasembiologia 
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Southern Blot
vDigestão enzimática
Fonte: www.biomedicinabrasil.com/enzimasderestricao 
Enzimas de restrição:
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Southern Blot
vEletroforese em gel
• Após a digestão enzimática, o DNA fragmentado é submetido à
corrida em gel de agarose.
Fonte: www.biomedicinabrasil.com/enzimasderestricao 
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Southern Blot
vDesnaturação do DNA
• O gel é incubado com solução de NaOH para desnaturar as fitas de
DNA por 30 min.
Fonte:https://sites.google.com/site/enfermagemufal20121/4-1
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Southern Blot
vTransferência (Blotting)
• Importante:
- Retirar as bolhas entre o gel e a
membrana;
- Não tocar na membrana;
- Após a montagem do aparato,
permitir a transferência overnight. 
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Southern Blot
vHibridização
• Importante:
- Antes de adicionar sondas, expor a membrana à luz UV ou ao calor;
- Pré-hibridar a membrana por 1 hora a 42°C.
- Preparar a sonda
- Adicionar a sonda à membrana - 12 a 16h
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Southern Blot
vLavagem e detecção
• Importante:
• Lavar a membrana a 42-52°C
• Expor ao filme radiográfico
Fonte: Herrera et al., 2001
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Southern Blot
vResumo
Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company.
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Southern Blot
vAplicações
• Diagnóstico de doenças genéticas;
• Testes de paternidade;
• Perícia forense.
Fonte: hpp://medicina.med.up.pt
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Northern Blot
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Northern Blot
• Técnica semelhante ao Southern Blot, porém identifica a presença de 
RNA
EXPRESSÃO 
GÊNICA
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Northern Blot
• Desenvolvida por Alwine e colaboradores em 1979, consiste numa
técnica empregada para estudo da expressão gênica, pois avalia se
um determinado transcrito se encontra presente na amostra.
• Sonda é formada por DNA complementar à sequência de RNA de
interesse.
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Northern Blot
Técnica Southern Blot Northern Blot
Molécula alvo DNA RNA
Gel Agarose Agarose
Membrana Nitrocelulose/ Aminobenziloximetil
Hibridização DNA-DNA
DNA-
RNA-
RNA-
Detecção R/Q /C R/Q /C
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Northern Blot
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Western Blot
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Western Blot
Técnica que permite detectar, caracterizar e semi-quantificar proteínas.
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Questionamentos
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• Por que estudar proteínas?
• Por que estudar proteínas fosforiladas?
• Por que estudar proteínas clivadas?
• Observando o aumento, a diminuição ou a não alteração da expressão de
uma proteína podemos afirmar que uma determinada via está ou não
sendo alterada ou ativada?
• Metilações pós-traducionais
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Etapas da técnica
• Preparação da amostra;
• Extração e quantificação de proteínas;
• Eletroforese – SDS Page;
• Transferência para membrana;
• Reação de bloqueio;
• Reação antígeno-anticorpo;
• Anticorpo primário;
• Anticorpo secundário
• Revelação.
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Preparação da amostra e extração de proteínas
• Etapas:
• Lise celular;
• Inibidores de proteases e fosfatases, para deter a digestão das 
células pelas próprias enzimas
• Sonicação e Centrifugação;
• Quantificação.
Conheça a proteína de 
interesse
Estabeleça a melhor técnica 
de extração
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Preparação da amostra e extração de proteínas
• Lise mecânica;
• Sonicador;
• Triturador;
• Lise por agentes químicos;
• Detergentes presentes nos 
tampões de extração;
• NP-40;
• RIPA.
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Extração de proteínas • RIPA (1x);
• Rompimento de membrana;
• Desnaturação de quinases;
• Coquetel inibidor de 
protease;
• Inibidor de Serinas, treoninas, 
tirosinas fosfatases;
• PMSF:
• Inibidor de Serinas;
• Ortovanadato de sódio:
• Inibidor de ATPases, 
fosfatases, tirosinas 
fosfatases.
MANTER SEMPRE EM GELO
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Quantificação de proteínas
• Curva-padrão de BSA;
• Métodos de quantficação:
• Lowry;
• Bradford;
Redução do reagente fosfomolibdato-
fosfotungstenato no reagente folin
620 nm
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y = 0.1397x + 0.0594
R² = 0.9966
0. 0000
0. 1000
0. 2000
0. 3000
0. 4000
0. 5000
0. 6000
0 0. 5 1 1. 5 2 2. 5 3 3. 5
[ ] BSA
Ab
s
Reação do cobre com a proteína, em meio 
alcalino, com posterior redução do 
reagente fosfomolibdato-fosfotungstenato
em folin
trosina e triptofano
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DC™ Protein Assay
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Bio-Rad Protein Assay
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Equação da 
reta
[ ] proteína 
da amostra 
(ug/ul)
Quanto de 
proteína irá 
aplicar?
5-50 ug
y = 0.1397x + 0.0594
R² = 0.9966
0. 0000
0. 1000
0. 2000
0. 3000
0. 4000
0. 5000
0. 6000
0 0. 5 1 1. 5 2 2. 5 3 3. 5
X= [ ] prot
Y= media da abs de cada amostra
Que volume aplicar?
Amostra 80%
Tampão (5x) 20%
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Desnaturação das amostras
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Os anticorpos reconhecem uma pequena porção da proteína de 
interesse, conhecida como epítopo, presente dentro da 
conformação tridimensional de uma proteína
Desdobramento ou 
desnaturação
Tampão de amostra + 
Aquecimento (100 °C)
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} Tampão de amostras ou de 
“carregamento” (5x):
} Glicerol – 5 mL;
} Tris HCl pH 6,8 – 0,3786 g;
} B-mercaptoetanol – 1 mL;
} Azul de bromofenol – 0,05g;
} SDS – 1g;
} H2O qsp – 10 mL.
Aumento da densidade e acelerar a migração 
da solução
Marcador
detergente aniônico
redução de pontes de dissulfeto
manter constante o pH das soluções
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Eletroforese SDS-Page
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• Corrente elétrica em uma matriz de separação sólida onde a amostra 
está inserida;
• Gel de poliacrilamida;
• Marcador de peso molecular.
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Gel de poliacrilamida
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• Escolha do tamanho dos poros;
• Concentrações dos géis à 5-20%;
• Gel de empilhamento (5%);
• Gel de separação (6-20%):
Quanto menor a proteína 
maior o percentual do gel
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O que compõe um gel de eletroforese?
Gel de poliacrilamida
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• H2O
• Acrilamida 30%:
• Acrilamida (linear) + bis acrilamida
(formato de T)
• Tris HCl
• SDS 10%
• Poliacrilamida persulfato
de amônio (APS) 10%
• Tetrametlltlenodiamino (TEMED)
Confere carga negativa às proteínas, 
facilitando a separação por peso molecular
Formação de uma rede
Agente oxidante que inicia o processo de 
polimerização da acrilamida, auxiliando na 
formação da rede
Estabilizador de radicais livres formados a 
partir do APS
Manutenção do pH e auxílio na força de 
migração e na estabilidade da acrilamida
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- Tampão de eletroforese – TGS 1x
Tris-Base;Glicina;
SDS.
- Corrida: 100 a 150 V / Amperagem livre
- Tempo: 1h 40 min
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Nitrocelulose PVDF
Menor custo Alta capacidade de ligação a 
proteínas
Pouca marcação inespecífica Fisicamente forte
Fácil de bloquear Altamente hidrofóbicas 
(precisam ser ativadas com 
metanol, isopropanol ou 
etanol 95% )
Fisicamente frágil Permitem repetidos Strippings
Membranas: 
• Interações hidrofóbicas.
Transferência para membrana
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Transferência para membrana
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• Transferência úmida:
• Menos propensa a falhas;
• Evita ressecamento da 
membrana.
Wet Semi-dry Dry
Best for proteins >100kDa Quick Even quicker
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Transferência para membrana
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Montagem do sanduíche:
esponjas
papéis de filtro
gel
membrana
papéis de filtro
esponjas
Garantir a ausência da formação de bolhas de ar entre gel e membrana
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Transferência para membrana
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• Tampão de transferência:
• Tampão de glicina (TG) – 100 mL;
• Metanol – 200 mL;
• H2O destilada – 700 mL.
• Tempo: 1h 20 min (proteínas de até 200 kDa);
• Amperagem: 0,4 mA
Membranas podem ser guardadas na geladeira em TBS para se proceder 
à imunodetecção no dia seguinte (máximo em 1 semana, idealmente 1 a 
3 dias)
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Transferência para membrana
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As proteínas foram transferidas??
Ponceau staining (reversible)
Marcador
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Bloqueio
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Bloqueio de ligação inespecífica;
Evitar interações entre a membrana e o antcorpo;
BSA ou leite em pó sem gordura (5%), com uma porcentagem mínima de Tween
20 (0,1%) – TBST 1x 
1 h
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Reação Antígeno-Anticorpo
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Reação Antígeno-Anticorpo
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Direto Indireto
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Procedimento de lavagem de membranas
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• Uso de TBST e TBS;
• Tris HCl
• NaCl
• pH 7,5
• Add Tween 20 0,1%
• Remoção de anticorpos não ligados
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Revelação
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Incubação com substrato que reage com a 
enzima reveladora ligada ao anticorpo 
secundário.
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Revelação
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Ex.: AP – fosfatase alcalina
Funciona por catalisação da fosfatase alcalina (AP), um substrato incolor BCIP será 
convertido em um produto azul.
• Conversão do corante solúvel em insolúvel, com diferente coloração, precipitando 
próximo à enzima, colorindo a membrana;
• Análise – densitometria ou espectrofotometria
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Revelação
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• Método mais sensível;
Ex.: Detecção por HRP
Incubação com substrato luminescente (luminol) que é oxidado por peroxidase e 
emite luminescência;
• Revelação e análise: filme fotográfico ou câmera de CCD; densitometria
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Revelação
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• Método mais sensível;
Ex.: Alexa 488
Incubação com sonda marcada, a qual é excitada por luz;
Emissão e excitação detectada por um fotossensor (Câmeras CCD)
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"house-keeping proteins"
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• Diferença entre amostras? - é real?
• Normalize cada amostra com base no controle;
• Quantificação – ImageQuant software
• Possíveis controles- tubulina, Beta-actina, GAPDH.
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Problemas comuns
Non specific bands
Probably too much antbody
Or insufficient blocking
High background
Probably too much antibody
Or insufficient blocking
Or insufficient washing
Blotchy transfer
Air bubbles between gel and membrane
Incomplete transfer
Transfer time too short
Transfer current too low
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Western Blot
vAplicações
• Diagnóstico de HIV
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Western Blot
vAplicações
• Diagnóstico de HIV
Fonte: http://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22172/mod_resource/content/3/HIV%20-%20Manual%20Aula%2011.pdf
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vAplicações
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Vamos analisar?
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Análise
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Como avaliar a significância??
Coeficiente de variação??
ANOVA + pos hoc???
- A low CV value indicates low signal variability 
and high precision of measurement.
- A larger CV indicates greater variation in 
signal and reduced precision
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QUESTÕES
(CESPEUnB-2010) Considerando, ainda, as metodologias de biologia molecular, assinale a opção
correta.
A. A técnica de Northern blotting é utilizada para analisar DNA por meio de uma sonda.
B. O método Southern blotting é utilizado para a análise de mRNAs transferido de um gel para um
suporte específico.
C. O termo clonagem de DNA se refere ao ato de produzir várias cópias exatas de uma molécula,
não sendo utilizado na amplificação de sequências.
D. Ao se cortar o DNA genômico aleatoriamente, serão observados genes em todos os fragmentos.
E. A endonuclease de restrição, uma das principais ferramentas da tecnologia do DNA
recombinante, corta a molécula de DNA em sequências específicas.
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(FIOCRUZ, 2010) Num estudo para verificar se a espécie “A" de bactéria apresenta e expressa um gene
similar ao gene tox da espécie “B", seria correto afirmar que:
A. A obtenção de um produto de PCR amplificado a partir de iniciadores para tox da espécie “B"
comprova a presença de um gene tox sendo expresso na espécie “A“.
B. Uma hibridação tipo Southern-blot com sonda tox marcada empregando amostras de DNA total da
espécie “A", indicaria que de fato este gene é expresso na espécie “A".
C. Uma hibridação tipo Northern-blot com sonda tox marcada empregando amostras de RNA total da
espécie “A", indicaria que de fato este gene é traduzido na espécie “A".
D. Uma hibridação tipo Southern-blot com sonda tox marcada com DNA total, indicaria que um DNA
similar a este gene está presente em “A" sem informação sobre transcrição ou tradução do mesmo.
E. Uma hibridação tipo Western-blot com sonda tox marcada empregando amostras de DNA total da
espécie “A" indicaria que um DNA similar a este gene está presente no genoma da espécie “A".
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(IFTO - 2016) As técnicas de hibridação Northern Blotting, Southern Blotting e Western Blotting
permitem estudar respectivamente:
a) RNA, DNA e Proteínas
b) DNA, RNA e Proteínas
c) RNA, Proteínas e DNA
d) DNA, Proteínas e RNA
e) Proteínas, RNA e DNA
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(ESAG – 2004) Southern Blot é uma das técnicas mais importantes para a detecção de seqüências
específicas de DNA. Assinale a alternativa correta, em relação a essa técnica:
A. A principal diferença entre as técnicas Southern blot e Northern blot, é que a primeira utiliza gel
de poliacrilamida e, a segunda, gel de agarose.
B. Depois de separadas por eletroforese, em gel de poliacrilamida, as bandas são cuidadosamente
cortadas e transferidas para uma membrana de nitrocelulose, onde são hibridizadas com sondas
específicas e coradas com brometo de etídio para serem visualizadas sob UV.
C. Fragmentos de DNA são separados por eletroforese em gel de agarose e tratados com o
intercalante brometo de etídio, podendo, assim, serem visualisados sob luz ultravioleta antes de
serem hibridizados em papel de nitrocelulose.
D. A técnica de Southern blot não é sensível o suficiente para detectar polimorfismos que
determinam alterações de clivagem, quando as alterações são muito pequenas.
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Uma catástrofe natural ocorreu numa cidade, atingindo uma maternidade e fazendo com que
alguns bebês desaparecessem. Um dos recém-nascidos foi encontrado sem identificação, dias
depois. Cinco casais alegaram serem os pais dela. Para esclarecer a dúvida, foi realizado o teste
de “paternidade”. Baseado na figura abaixo, responda:
A) Qual a técnica empregada para obtenção das bandas da imagem?
B) Qual dos casais corresponde aos pais do bebê desaparecido?
Figura 1: membrana de nitrocelulose contendo fragmentos de DNA dos supostos pais e da criança. 
Fonte: adaptado de http://tecnologiasrelacionadasaodna.blogspot.com.br
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http://tecnologiasrelacionadasaodna.blogspot.com.br/
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(UnB – CESPE – 2007) Considerando os princípios da técnica de northern blot e sua aplicação dentro da 
biologia molecular, julgue os itens seguintes.
Na técnica de northern blot, são empregados géis de agarose na presença de agentes desnaturantes.
C. Certo
E. Errado
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OBRIGADO!
Dr. Daniel Pascoalino Pinheiro
E-mail: daniepascoalino@gmail.com
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