Extração de DNA

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Etapas de extração de DNA
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DETERGENTES
Promovem a ruptura de membranas 
Detergentes comumente utilizados:
SDS (dodecil sulfato de sódio)
Utilizado na eletroforese de proteínas
ou CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio).
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SDS (dodecil sulfato de sódio)
Características:
 Pó branco
 Detergente polianiônico
 Aplicações:
Solubilização de proteínas.
Preparação de soluções para pré-hibridização e	hibridização em Biologia Molecular
Dissociação dos complexos proteína - ácido nucléico durante procedimentos de isolamento de DNA/RNA.
 Agente denaturante na eletroforese em géis de poliacrilamida.
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SDS
Manipulação:
Em contato acidental com a pele, olhos e mucosas
lavar abundantemente com água.
 Para evitar maiores acidentes trabalhar com máscara
 equipamentos de proteção individual.
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CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio)
Esse detergente solubiliza as membranas, formando com o DNA um complexo que facilita uma posterior precipitação juntamente com o NaCl
É utilizado na separação de ácidos nucléicos dos polissacarídeos
Possuem solubilidade diferenciada na presença desse detergente
Não tóxico, mais deve evitar-se a inalação
Usar máscara, luvas e avental no preparo da solução
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PH DO TAMPÃO DE EXTRAÇÃO PARA DNA
Por volta de 8,0
evita a ação de DNAses que podem degradar o DNA.
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EDTA (ácido etileno
diamono tetracético)
O EDTA é uma substância quelante de cátions divalentes
Mg+2 e Ca+2 e, portanto, inibe a açãode DNAses, que usam esses metais como cofatores (Sambrook et al., 1989)
Armazenamento
Temperatura Ambiente
Manter em recipiente fechado, ambiente seco e ventilado
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Manipulação:
Irritante; se inalado, pode causar tosse e espirros,
 Apresenta baixa toxicidade se ingerido,
 Grandes quantidades podem provocar dores gástricas devido ao desequilíbrio osmótico pelos íons seqüestrados.
Recomenda-se o uso de máscaras, aventais e luvas ao manipular o produto
EDTA (ácido etileno
diamono tetracético)
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CLOROFÓRMIO
Promove a separação de Ácidos nucléicos das proteínas
Desnaturam as proteínas tornando-as insolúveis à fase aquosa, onde se encontram os ácidos nucléicos.
Armazenamento: 
2ºC a 8ºC
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CLOROFÓRMIO
Efeitos potenciais à saúde:
 Pode ser fatal se for aspirado ou inalado
	Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório
Afeta Sistema Nervoso Central, rins, Sistema Cardiovascular e fígado
 Pode causar câncer dependendo do nível e duração de exposição.
Equipamento a ser usado em laboratório:
 óculos, avental, luvas e capela
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Manuseio e armazenamento
Mantenha o material em um recipiente bem fechado, 
armazenar em local fresco, seco em área ventilada
Os recipientes vazios deste material são tóxicos pois retêm resíduos; observe todos os avisos e precauções com relação ao produto.
Fogo
Não inflamável
Toxicidade ambiental: Não é tóxico a vida aquática.
CLOROFÓRMIO
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Considerações para eliminação: 
Sempre que não for possível salvar a substância para reutilização ou reciclagem, esta deve ser colocada em um aparato aprovado e apropriado para eliminação do lixo. O processamento, o uso ou contaminação deste produto pode alterar a forma de administrar o lixo. 
CLOROFÓRMIO
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CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO 24:1
Promove a extração de lipídios, proteínas e polissacarídeos, que são dissolvidos nesse solvente orgânico (inferior)
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ÁLCOOL ISOAMAÍLICO
Efeitos Potenciais na Saúde: 
Inalação de vapores pode causar irritação das membranas das mucosas e da área respiratória. 
Pode causar dor-de-cabeça, náusea, vômito, diarréia, vertigens. Inalação de vapores de altas concentrações pode causar morte. 
Ingestão causa dor abdominal e vômito. 
Contato com a pele: 
Podem acontecer sintomas de irritação, vermelhidão e dor;.
Contato com o olho: 
Os vapores podem irritar os olhos. 
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Informação Ecológica
Destino no Ambiente: 
Na terra sofre lixiviação, biodegradação e evaporação. 
Não é esperado que este material significamente sofra bioacumulação. 
Toxicidade no ambiente: 
Nenhuma informação catalogada. 
 
ÁLCOOL ISOAMAÍLICO
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PVP (polivinilpirrolidona)
Possui efeito antioxidante,
evita a oxidação de polifenóis
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β-MERCAPTOETANOL
Agente redutor
Promove a desnaturação de proteínas 
inibe a atividade de peroxidases e polifenoloxidases
Considerado tóxico apenas quando:
entra em contato com a pele ou ingerido, 
Causa irritabilidade nas membranas mucosas e área respiratória
dores abdominais e vomito
OBS:
Apresenta forte odor e deve ser manipulado com uso de luvas e em capela
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ETANOL 100% OU ISOPROPANOL
Permite a recuperação dos ácidos nucleicos totais por precipitação
desidratam a molécula de DNA e na presença de NaCl permitem sua precipitação ao final do processo, formando um sedimento visível na fase líquida do tubo.
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ETANOL 70% 
Utilizado para a lavagem de ácidos nucléicos
retirar os sais
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ETANOL
Identificação dos danos
 Líquido inflamável! 
Manuseio e armazenamento
Manter o material em um recipiente bem fechado
Armazenar em local fresco, seco e bem ventilado
 Guardar longe de fontes de calor, de ignição e de substâncias oxidantes e incompatíveis
Manter nos locais de trabalho a quantidade de álcool etílico suficiente para apenas uma jornada. 
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ISOPROPANOL
Solúvel em água, volátil, altamente inflamável
Levemente tóxico se ingerido ou absorvido pela pele, podendo causar lesões na córnea.
 Seus vapores tem efeito anestésico, podendo causar tontura. 
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BROMETO DE ETÍDEO
Descrição:
O Brometo de Etídeo é uma molécula plana de grande tamanho. 
Pode se intercalar ou inserir nas moléculas de DNA ou RNA, formando complexos fluorescentes, sendo possível a sua visualização sob luz ultravioleta.
Aplicações:
Coloração de géis de agarose para visualização de ácidos nucléicos
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Manipulação:
É um mutagênico potente
 Essa capacidade tem sido testada em alguns modelos animais bem como em microrganismos patogênicos
 Não foi testado efetivamente em humanos, mas, com base na sua toxicidade e sua interação com o DNA é altamente recomendável que seu manuseio seja realizado segundo alguns procedimentos:
BROMETO DE ETÍDEO
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PROCEDIMENTOS
Trabalhar com máscara e equipamentos de proteção individual
Em contato acidental com a pele, olhos e mucosas
lavar imediatamente com água em abundância.
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Blue Green Loading Dye I
Tampão corante fluorescente pronto para uso
Apresenta elevada sensibilidade na detecção de ácidos nucléicos em géis de agarose
Sua excepcional sensibilidade pode ser aproveitada em experimentos de PCRs de poucos ciclos de amplificação, DNA com baixo número de cópias. 
Composição: 
Emprega reagentes de elevada pureza, a saber: Azul de bromofenol, xileno cianol, glicerol e a molécula de cianeto assimétrica (família de corantes sintéticos ) liga à molécula de DNA
 
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Procedimento para uso: 
Recomendável aliquotá-lo em volumes menores, para evitar eventual perda de sensibilidade
Aplicar entre 0,5 – 1,0 uL para cada 10 uL de amostra de DNA a ser analisada
Não afeta a configuração do DNA que se deseja analisar
Não apresenta a capacidade mutagênica dos corantes habitualmente utilizados em Biologia Molecular
A remoção do produto das amostras de DNA e de superfícies contaminadas pode ser feita com etanol 95%
Blue Green Loading Dye I
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ACRILAMIDA
Uso;
Gel para eletroforese 
Identificação dos danos
 
Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório
Pode causar câncer (o risco de câncer depende na duração e nível de exposição)
 Afeta o sistema nervoso central e periférico e o sistema reprodutor
Pode causar má formação
congênita
Termalmente instável. Pode polimerizar explosivamente se aquecido ao ponto de fusão.
 
Equipamento a ser usado em laboratório: 
óculos, avental, capela , máscara e luvas apropriadas.
 
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Manuseio e armazenamento
Armazene em uma área fresca, seca e ventilada, longe de fontes de ignição ou calor. 
Lave as mãos, rosto, antebraço, pescoço quando sair áreas restritas. 
Tente manter as roupas que não usa no trabalho fora de contaminação.  
ACRILAMIDA
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BIS-ACRILAMIDA
Descrição:
É um composto utilizado junto com Acrilamida para preparação de géis de poliacrilamida. 
 Manipulação do Produto:
AVISO: Danoso se for engolido, inalado ou absorvido pela pele. Causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.
Equipamento a ser usado:
 óculos de proteção, avental, capela e luvas apropriadas.
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TEMED
Reagente utilizado na polimerização de compostos com acrilamida.
Identificação dos danos:
AVISO: Causa queimaduras a qualquer área de contato
Pode ser fatal se engolido
Danoso se for inalado. 
Líquido e vapor combustíveis
Equipamento a ser usado em laboratório:
 óculos, avental, capela e luvas apropriadas.
Armazenamento:
 Temperatura Ambiente
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PERSULFATO DE AMÔNIO
Uso
Polimerização de gel de poliacrilamida
Identificação dos danos
aviso:perigo! oxidante forte. contato com outro material pode causar fogo
prejudicial se ingerido ou inalado
pode causar queimaduras para a pele e olhos. pode causar reação alérgica ou respiratória.
Equipamento a ser usado em laboratório: 
óculos, avental, capuz, luvas;
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NITRATO DE PRATA
AVISO: VENENO!!! PERIGO- Corrosivo. 
Causa queimaduras a qualquer área de contato. 
Pode ser fatal de engolido. Danoso se for inalado. Oxidante muito forte. O contato com outros materiais pode causar fogo.
Manuseio e armazenamento
 Mantenha em um container bem fechado
 Armazene em uma área fresca, seca e ventilada, longe de fontes de ignição ou calor. 
 Proteja da luz e não coloque em chão de madeira. 
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Equipamento a ser usado em laboratório: 
óculos, avental, capela e luvas apropriadas
Informações ecológicas
Destino no ecossistema: não há registros sobre o produto.
Toxicidade ambiental: não há informações a respeito.
NITRATO DE PRATA
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DEPC Dietil Pirocarbonato 
Água tratada com Dietil Pirocarbonato (DEPC)
livre de RNAses, DNAses e resíduos de proteínas.
O DEPC modifica e inativa os resíduos de histidina e tirosina constituindo assim, um método eficiente no controle da contaminação por proteínas
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Aplicações:
 Preparação de soluções que requeiram qualidade analítica e de extrema pureza
 Manipulação de ácidos nucléicos e todos os experimentos em biologia molecular, especialmente extração e recuperação de RNA
 As reações de amplificação por PCR podem ser trabalhadas com esta solução
Manipulação:
 Aconselha-se utilizar luvas, e equipamentos de proteção individual, e trabalhar em capela de exaustão.
DEPC Dietil Pirocarbonato 
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ENZIMAS
Armazenamento:
 - 20ºC
Não armazene em geladeira com sistema frost-free
Manipulação:
Manter em gelo para preservar a atividade enzimática
Usar luvas
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MEDIDAS DE PRIMEIROS- SOCORROS
Inalação
Remover o indivíduo ao ar livre. Se não estiver respirando, fazer respiração artificial. Se respirar com dificuldade, dê oxigênio. Procure ajuda médica.
Ingestão
INDUZA O VÔMITO! Dê de 2 a 4 copos de água ou leite se a pessoa estiver consciente. Nunca dê algo pela boca para uma pessoa inconsciente.
Contato com a pele
Lave imediatamente com água corrente e sabão. Remova a roupa contaminada e os sapatos. Procure ajuda médica. Lave as roupas e os sapatos antes de reutilizá-los.
Contato com os olhos
Lave imediatamente com água corrente por, pelo menos, 15 minutos, abrindo e fechando ocasionalmente as pálpebras. Procure ajuda médica imediatamente.
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 MEDIDAS PARA VAZAMENTO ACIDENTAL
Ventilar a área de vazamento 
Usar equipamento de proteção
 Quando ocorrer o vazamento, recolher o material num container apropriado ou absorva com um material inerte (vermiculite, areia seca, terra). 
Não use materiais combustíveis, como pó de serra.
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BIBLIOGRAFIAS CONSULTADAS
LGC Biotecnologia Ltda: www.lgcbio.com.br
http://www.qca.ibilce.unesp.br/prevencao/produtos/msds.html
SANTOS, Vanessa Paim1; BRAZ, Nara Geórgia Ribeiro2; SOUZA, Éwerton Ávila Teixeira3; LIMA, Leila Santos 4, GRAMACHO, Karina Peres5. ANÁLISE DE ARMAZENAMENTO E MANIPULAÇÃO DE MATERIAISTÓXICOS EMPREGADOS NA EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS. XII Seminário de Iniciação Científica da UESC - Ciências Exatas, da Terra e Engenharias
Dellaporta, S.L.; Wood, J. e Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21.
Doyle, J.J. e J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19:11-15.
Doyle, J.J. e J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15.
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Raeder, U. e Broda, P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology 1: 17-20.
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