Biotecnologia 1

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Biotecnologia
Msc. Edson Delatorre
ANVISA
Área 2 - Ciências Biológicas/Biomedicina
delatorre.ioc@gmail.com
Especialista em Regulação e Vigilância Sanitária
Parte 1
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Biotecnologia, o que é?
(Convenção sobre Diversidade Biológica - ONU) 
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Uma definição mais ampla…
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Histórico
Biotecnologia não é algo novo:
Número crescente de tecnologias que surgem ou se renovam
Vinho
Queijo
Pão
Cerveja
Influenciaram o desenvolvimento da humanidade 
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A sua História no Mundo ...
Primeira Geração: Idade Nova (2000 a.C.)
 Fatos: - cruzamento de espécies animais e plantas
 - leveduras para fermentação de pão e álcool
 Segunda Geração: Fim do século XIX
 Teoria de Louis Pasteur 
 Fatos: - microrganismos causam enfermidades humanas
 - ação dos microrganismos anaeróbios nas fermentações
Terceira Geração: Início de 1970. Biologia Molecular
 Fatos: 1o – isolamento e manipulação de genes (DNA)
 2o – fusão e multiplicação de células
Láctea e alcoólica
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Processo biotecnológico
Seleção do organismo
Genética, seleção, manipulação
Biorreator
Células animais, vegetais ou microbianas ou enzimas
Isolamento do produto
Controle de processos
Materiais brutos
Ar
Energia
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B
S
P
S - substrato ou matéria-prima a sofrer transformação 
B - entidade biológica que "catalisa" a reação
P - produto ou serviço resultante da reação
Processo biotecnológico
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B
S
P
S - substrato ou matéria-prima a sofrer transformação 
B - entidade biológica que "catalisa" a reação
P - produto ou serviço resultante da reação
Processo biotecnológico
B = células vegetais ou animais  cultura de células
B = microrganismos  processo fermentativo ou tratamento de resíduos
B = enzima purificada ou não  processo enzimático
B = enzimas contidas em microrganismos viáveis ou não  biotransformação 
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B
S
P
S - substrato ou matéria-prima a sofrer transformação 
B - entidade biológica que "catalisa" a reação
P - produto ou serviço resultante da reação
Processo biotecnológico
B = células vegetais ou animais  cultura de células
B = microrganismos  processo fermentativo ou tratamento de resíduos
B = enzima purificada ou não  processo enzimático
B = enzimas contidas em microrganismos viáveis ou não  biotransformação 
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Não se deve confundir os conceitos de substrato e matéria-prima. 
O substrato é a substância química, contida na matéria-prima, que participará das principais sequências bioquímicas. Como exemplos de matéria-prima pode-se citar: melaço de cana, resíduos agrícolas, esgotos domésticos e industriais, minérios etc.
Através dos Processos Biotecnológicos, é possível a obtenção de uma série de produtos cuja síntese por via química seria inviável econômica ou tecnicamente. 
São exemplos destes casos, a produção de etanol, produto de baixo valor agregado, e vários produtos da área farmacêutica, como antibióticos e vitaminas, que além do alto preço de mercado, necessitam uma série de passos em suas sínteses, o que torna obrigatório, pelo menos em algumas etapas do processo, que a via bioquímica seja utilizada. 
Processo biotecnológico
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Aplicações da biotecnologia
Bioprocessos
Aumento do rendimento
Enzimas
Catálise de reações químicas específicas
Ambiental
Controle de poluentes, recuperação 
Agricultura
Plantas GM: nutrição, tolerância, produção
Saúde
Novas drogas
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Aplicações da biotecnologia
Metabólitos secundários
Importância comercial
Penicilina
Cefalosporia
Ciclosporina A
Gibelerina
Antibiótico
Antibiótico
Antibiótico
Hormônio vegetal
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Seleção do organismo
Manipulação dos organismos
Manipulação celular
Manipulação molecular
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Seleção do organismo
Onde obter ? 
Isolamento a partir de recursos naturais
Compra em coleções de culturas
Obtenção de mutantes naturais
Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais
Obtenção de organismos recombinantes por técnicas de engenharia genética
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Seleção do organismo
 Isolamento de habitas naturais 
 atividade de grande importância para a obtenção de linhagens de interesse industrial: descoberta de novos produtos, linhagens melhor produtoras
Razões?
muito trabalho experimental
muito tempo
custo relativamente elevado
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Seleção do organismo
Obtenção de mutantes naturais ouinduzidos por métodos convencionais
 aguardar o surgimento de mutantes naturais de interesse
prático  requer muito tempo
usar métodos que induzam mutações 
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Exemplo: 
melhora da linhagem de Penicillium crysogenum para a produção de penicilina:
Na década de 40 – teor de penicilina da ordem de 100 unidades/cm3
1976 – teores da ordem de 51.000 unidades/cm3
1975 a 1992 - incrementos de ordem de 4 vezes foram obtidos pela Squibb Indústria Química
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Seleção do organismo
Obtenção de organismos recombinantes por técnicas de engenharia genética
a identificação do gene que codifica para a síntese dessa enzima
introduzir este gene em um plasmídeo e reintrodução na célula produtora
aumento do número de cópias de gene responsável pela síntese da enzima  aumento da velocidade da reação limitante
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Então, como fazer um OGM?
Tecnologia do DNA recombinante
Conjunto de técnicas que permitem selecionar um gene de interesse, 
clona-lo, modifica-lo e introduzi-lo em uma célula receptora.
Seus usos envolvem o estudo da estrutura e função de genes, tratamento e diagnóstico de doenças e criação de produtos comerciais.
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O que é um OGM?
Organismo geneticamente modificado (OGM), segundo o art. 3º, inciso V, da Lei Federal brasileira nº 11.105, de 24 de março de 2005:
http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2004-2006/2005/lei/l11105.htm
“V - Organismo cujo material genético (DNA/RNA) foi modificado por qualquer técnica de engenharia genética”
 ”§1º - Não se inclui na categoria de OGM o resultante de técnicas que impliquem a introdução direta, num organismo, de material hereditário, desde que não envolvam a utilização de moléculas de ADN/ARN recombinante ou OGM, inclusive fecundação in vitro, conjugação, transdução, transformação, indução poliplóide e qualquer outro processo natural.”
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Não é OGM:
fecundação in vitro,
conjugação,
 transdução, 
transformação, 
indução poliplóide e 
qualquer outro processo natural
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Protocolo padrão para construção de OGMs:
Isolamento do gene
Construção do inserto
Transformação
Seleção
Regeneração
Confirmação
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Isolamento do gene
Engenharia genética
Diversas técnicas podem ser utilizadas
Diversos protocolos comerciais
Fontes de DNA doador:
DNA genômico: fonte mais simples de isolamento do DNA, obtido diretamente do cromossomo do organismo doador. 
DNA complementar: DNA dupla fita sintetizado a partir do RNA mensageiro, prediz a sequência do polipeptídeo.
DNA sintético: quando não é possível isolar o DNA ou este não existe em fonte natural, pode ser sintetizado quimicamente.
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Cortando o DNA
Para separar o gene de interesse é necessário literalmente “cortar” o fragmento para inseri-lo em um vetor que irá carreá-lo para a célula receptora.
O corte é feito por enzimas de restrição
Mecanismo de defesa de bactérias
Endonucleases do tipo II
Cortam sítios específicos na sequência de DNA
Engenharia genética
Isolamento do gene
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Cortam em regiões com sequências repetidas porém em sentidos opostos nas fitas de DNA
Engenharia genética
Isolamento do gene
Enzimas de restrição
Palíndromos
EcoRI
PvuII
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Extremidades
cegas
Extremidades
coesivas
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Engenharia genética
Isolamento do gene
Enzimas de restrição
HindIII encontra o 
sítio de clivagem e 
corta as fitas ...
produzindo
extremidades adesivas.
Outras enzimas
de
restrição, como PvuII, ...
corta ambas as fitas de DNA produzindo
extremidades cegas.
extremidades cegas
Pierce - Genetics: A Conceptual Approach
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Engenharia genética
Isolamento do gene
Enzimas de restrição
Digestão
com HindIII
Digestão
com HindIII
Moléculas de DNA
cortadas com a mesma 
enzima de restrição
possuem extremidades
complementares que
são capazes de se
juntar.
Os buracos do esqueleto de açúcar na junção dos fragmentos podem ser unidos por uma DNA ligase.
Buraco no esqueleto
de açúcar-fosfato
Buraco no esqueleto
de açúcar-fosfato
Fragmentos
são combinados
Ligase
Ligase
Pierce - Genetics: A Conceptual Approach
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Engenharia genética
Isolamento do gene
Juntando o DNA
Pierce - Genetics: A Conceptual Approach
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Construção do inserto
Manipulação DNA isolado para inserção no organismo receptor.
Transferência necessita de um VETOR
Molécula de DNA pequena, de fácil manipulação, capaz de intensa replicação na célula viva.
Vetores virais
Plasmídios
Cosmídeos
BACs – Cromossomo artificial de bactéria
YACs – Cromossomo artificial de levedura
Engenharia genética
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Componentes básicos 
dos vetores de clonagem
Engenharia genética
Construção do inserto
Marcador selecionável, que permita a identificação das células que contenham o vetor
Um ou mais sítios únicos de restrição, nos quais o fragmento de DNA possa ser inserido
Origem de replicação que garanta a replicação do vetor dentro da célula.
DNA dupla fita
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Componentes básicos dos vetores de expressão
Engenharia genética
Construção do inserto
Marcador selecionável, que permita a identificação das células que contenham o vetor
Um ou mais sítios únicos de restrição, nos quais o fragmento de DNA possa ser inserido
Origem de replicação que garanta a replicação do vetor dentro da célula.
P
O
Sequências de controle da expressão gênica. (O) Operador, (P) Promotor
Sequência de início
da transcrição
Sequência de finalização
da transcrição
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Vetores virais
O(s) gene(s) de interesse é incorporado ao genoma de um vírus.
Sucesso maior na inserção do gene na célula receptora.
A escolha do vírus depende do tipo de célula que será transformada:
Bactérias: fago M13, fago lambda
Eucariotos: baculovírus, retrovírus
Engenharia genética
Construção do inserto
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Plasmídios
Pequenas moléculas de DNA circular.
Replicam-se de forma idependente ao genoma
Plasmídeos de resistência às drogas
Engenharia genética
Construção do inserto
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Cosmídeos
Vetores híbridos de fagos lambda e plasmídeos, seu DNA pode replicar-se na célula ou ser embalado no capsídeo do vírus.
Pode carregar inserções de DNA com o triplo do tamanho que um fago lambda.
Engenharia genética
Construção do inserto
Preenchimento da cabeça do fago
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BACs
Derivados do plasmídeo F
São estáveis e com grande capacidade de aceitar grandes fragmentos de DNA
Preferidos para construção na manipulação do DNA de organismos complexos.
Engenharia genética
Construção do inserto
Cromossomo artificial de bactéria
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YACs
Possibilidade de clonagem de genes até 1 Mb
Transformação de leveduras
Presença de centrômero e telômeros
Engenharia genética
Construção do inserto
Cromossomo artificial de levedura
Sítios de enzimas de restrição
Centrômero
Telômeros
ARS
Sistema de 
replicação autônoma
Marcador
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Transformação
Captação direta, incorporação e expressão de material genético exógeno
O mecanismos dependerão da célula utilizada:
Bactérias
Choque-térmico
Eletroporação
Plantas
Agrobacterium
Eletroporação
Biobalística
Transformação viral
Animais
Eletroporação
Transformação viral
Microinjeção
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Bactérias
Choque térmico
Engenharia genética
Transformação
Incubação a frio em solução com cátions divalentes
Cátions neutralizam as cargas na superfície da membrana.
Baixa temperatura estabiliza “poros” presentes.
Choque térmico cria uma corrente que conduz o plasmídeo para o interior da célula.
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Aplicação de um campo elétrico externo à célula
Rearranjo dos fosfolipídeos da membrana
Formação de “poros” efêmeros na membrana
Entrada dos vetores para o interior da célula.
Bactérias
Eletroporação
Engenharia genética
Transformação
Meio
Citosol
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Plantas
Agrobacterium
Engenharia genética
Transformação
Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria com habilidade natural de inserir material genético em células vegetais
Resistência
a antibióticos
ori
Gene Bt
Genes Ti
Plasmídeo Ti
Cromatina
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Isolamento das células
Cultivo do calo indiferenciado
Disparo das “balas”
Esferas de tungstênio ou ouro
Seleção das células transformadas
Rediferenciação do calo
Cultivo da planta trangênica
Plantas Biobalística
Engenharia genética
Transformação
Injeta material genético
Partícula de metal pesado revestido com DNA
Baixa eficiência
Maioria das plantas podem ser transformadas
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Plantas Transformação viral
Engenharia genética
Transformação
Uso de vírus como vetor para introduzir o DNA
Nem sempre ocorre a integração ao genoma
Muitas vezes ocorre a inserção do DNA exógeno mais de uma vez
Problema > vírus RNA
Vírus funciona como sistema de produção in planta.
Genoma RNA
Capsídeo
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Animais Transformação viral
Engenharia genética
Transformação
Uso de vírus como vetor para introduzir o DNA
Vírus capazes de inserir material genético no cromossomo
Muitas vezes ocorre a inserção do DNA exógeno mais de uma vez
Retrovírus
Seward Hung
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Escolha da região de integração
A integração usualmente ocorre de forma aleatória.
Porém em determinados modelos de estudo é possível a inserção em locais específicos
Recombinação homóloga para substituir o gene endógeno
Animais Transformação viral
Engenharia genética
Transformação
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Injeção de múltiplas cópias do DNA exógeno no pronúcleo masculino de óvulos recém-fertilizados.
Posterior implantação em mães de aluguel.
Animais Microinjeção
Engenharia genética
Transformação
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Seleção
A eficiência da transformação não é 100%
Como selecionar as células que realmente possuem o transgene?
Marcador seletivo
Resistência a antibióticos
Gene catabólico raro
Produção de sinal
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Regeneração
A transformação ocorre em uma célula
Reconstrução do organismo com o transgene
Plantas: cultura de tecidos  hormônios
Animais: células tronco embrionárias
Animais:
1ª geração será heterozigota
1º cruzamento
Transgênico (Aa) X selvagem (aa)
2º cruzamento
Transgênico (Aa) X transgênico (Aa)
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Confirmação
Garantir o sucesso da transformação
Determinar a localização cromossômica e número de cópias:
PCR
Hibridização
Sequenciamento de DNA
Averiguar a expressão do gene
RT-PCR
Western blot
Imunofluorescência 
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Southern Blot
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Western blot
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ELISA
Antígeno
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Aplicações
Medicina
Produção de farmacêuticos
Hormônio de crescimento humano
Para crianças com deficiências de crescimento
Fatores de coagulação
Para hemofílicos
Ativadores de plasminógenos
Para dissolver coágulos em pacientes que sofreram ataques cardíacos
Expressão de genes eucarióticos em bactérias
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Estratégias para produção de insulina
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Terapia gênica
Substituição do gene defectivo por gene normal
Medicina
...
...
Região com gene defeituoso
Recombinação
homóloga
Vetor
Cromossomo receptor
Aplicações
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Comida geneticamente modificada
Milho
Agricultura
Aplicações
Resistência a pragas: 
 Proteína Bt é uma endotoxina que mata a broca do milho.
Tolerância a herbicidas
 Resistência ao herbicida Round Up (glifosato)
Bacillus thuringiensis
Cristal de endotoxina Delta
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Comida geneticamente modificada
Batata
Batata rica em amilopectina - Amflora
Produção de papel
Arroz
Golden rice
Rico em beta-caroteno
Soja Round Up
Resistência ao glifosato
Agricultura
Aplicações
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Animais transgênicos
Produção de proteínas de uso farmacêutico
Imunização de animais por meio da expressão transgênica de antígenos virais
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 GloFish
Peixe zebra fluorescente
Primeiro pet OGM
AquAdvantage
Salmão modificado com hormônio de crescimento
Animais transgênicos
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Biologia sintética
Genomas sintéticos
Modificação em grande escala de organismos pré-existentes
Construção de genes personalizados
Nova era de tecnologia do DNA recombinante
Mycoplasma laboratorium
Craig Venter Institute
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No Brasil
LEI Nº 11.105, DE 24 DE MARÇO DE 2005 
Art. 1o 
Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre:
a construção,
o cultivo,
a produção,
a manipulação,
o transporte,
a transferência,
a importação,
a exportação,
o armazenamento,
a pesquisa,
a comercialização,
o consumo,
a liberação no meio ambiente e
o descarte
http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2004-2006/2005/lei/l11105.htm
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Resumo das regras
LEI Nº 11.105/05 
atividades e projetos que envolvam OGM e seus derivados ficam restritos ao âmbito de entidades de direito público ou privado 
atividades e projetos de que trata este artigo são vedados a pessoas físicas em atuação autônoma e independente
atividades e projetos que envolvam OGM e seus derivados deverão requerer autorização à CTNBio 
para iniciar atividades e projetos que envolvam OGM, as instituições devem apresentar o Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB), emitido pela CTNBio
É vedada a comercialização do material biológico
Bongertz V 2012
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Art. 6º Fica proibido:
        I – implementação de projeto relativo a OGM sem a manutenção de registro de seu acompanhamento individual;
        II – engenharia genética em organismo vivo ou o manejo in vitro de ADN/ARN natural ou recombinante, realizado em desacordo com as normas previstas nesta Lei;
        III – engenharia genética em célula germinal humana, zigoto humano e embrião humano;
        IV – clonagem humana;
Resumo das regras
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Complementação
Decreto 5.705, de 16 de Fevereiro de 2006: 
O objetivo do presente Protocolo é contribuir para assegurar um nível adequado de proteção no campo da transferência, da manipulação e do uso seguros dos organismos vivos modificados resultantes da biotecnologia moderna que possam ter efeitos adversos na conservação e no uso sustentável da diversidade biológica, levando em conta os riscos para a saúde humana, e enfocando especificamente os movimentos transfronteiriços 
(não se refere a OGM a serem mantidos em contenção)
 http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-2006/2006/Decreto/D5705.htm
Para avaliar a classificação de risco, o nível de biossegurança e as condições de trabalho em contenção com OGM, deve-se seguir a Resolução Normativa CTNBio Nº 2, de 27.11. 2006 
(www.ctnbio.gov.br)
Ver também Instrução Normativa nº 8 – CTNBio : Dispõe sobre a manipulação genética e sobre a clonagem de seres humanos.
(www.ctnbio.gov.br)
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Classificação de risco de OGMs
Os OGMs serão classificados em Grupo I e Grupo II, conforme o Anexo I da Lei 8.974/95. 
A classificação dos OGMs em Grupo I ou Grupo II deverá considerar os riscos associados aos seguintes componentes: 
a classe de risco, de acordo com o Apêndice 2 destas normas, e as características do organismo receptor ou parental (hospedeiro),
 o vetor,
o inserto,
o OGM resultante. 
Instrução Normativa CTNBio nº 7, de 06.06.97 
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Classes de risco 
(a) Classe de risco 1 - (baixo risco individual e baixo risco para a comunidade) - organismo que não cause doença ao homem ou animal. 
(b) Classe de risco 2 - (risco individual moderado e risco limitado para a comunidade) - patógeno que cause doença ao homem ou aos animais, mas que não consiste em sério risco, a quem o manipula em condições de contenção, à comunidade, aos seres vivos e ao meio ambiente. 
As exposições laboratoriais podem causar infecção, mas a existência de medidas eficazes de tratamento e prevenção limitam o risco, sendo o risco de disseminação bastante limitado. 
(c) Classe de risco 3 - (elevado risco individual e risco limitado para a comunidade) - patógeno que geralmente causa doenças graves ao homem ou aos animais e pode representar um sério risco a quem o manipula. 
Pode representar um risco se disseminado na comunidade, mas usualmente existem medidas de tratamento e de prevenção. 
(d) Classe de risco 4 - (elevado risco individual e elevado risco para a comunidade) - patógeno que representa grande ameaça para o ser humano e para aos animais, representando grande risco a quem o manipula e tendo grande poder de transmissibilidade de um indivíduo a outro. 
Instrução Normativa CTNBio nº 7, de 06.06.97 
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Origem de replicação garantindo que este consiga se replicar dentro da célula
Marcadores selecionáveis permitindo que todas as células que contenham o vetor consigam ser identificadas
Um ou mais sítios únicos de restrição nos quais um fragmento de DNA possa ser inserido
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