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Prof. Elizabeth do Nascimento Introdução à Nutrição Experimental e Recomendações Nutricionais para ratos Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde Departamento de Nutrição Disciplina: Nutrição Experimental Observação; Problema; Questionamentos; Experimentação; Ciência; Ciência da Nutrição O que é Nutrição Experimental? Destino Utilização Função N U T R I E N T E S Nutrição Experimental Modelo Animal Estudo em seres humanos Tenta compreender os elos entre os nutrientes e a base metabólica da doença e/ou de seus efeitos no organismo Os objetivos dos estudos experimentais são: • Determinar os efeitos dos alimentos e seus componentes sobre o metabolismo celular ou a fisiologia; • Estabelecer a possibilidade da relação dieta-saúde; • Compreender o mecanismo básico pelo qual nutrientes específicos ou compostos bioativos alteram, evitam ou provocam a enfermidade; - Envolve aspectos éticos e/ou os inerentes a própria morbidade; - Dificuldade de assegurar que os indivíduos estão realmente ingerindo a quantidade e/ou a qualidade do alimento ou nutriente-teste; - Grande variabilidade entre os seres Humanos (genética, estilo de vida, histórico dietético, atividade física, saúde, etc.; - Maior dificuldade na manipulação das dietas ingeridas pelos seres humanos; Principais Limitações do estudo da Nutrição Experimental em Humanos - Dificuldade em isolar o nutriente analisado em função de uma intervenção dietética; - O estudo pode ser muito trabalhoso e oneroso; - A doença estudada pode ser de baixa incidência ou prevalência na população Principais Limitações do estudo da Nutrição Experimental em Humanos -Um estudo experimental, por definição, necessita de um grupo controle. - A agressividade da doença ou a virulência do agente etiológico pode não dar espaço para investigação de tratamentos alternativos sem riscos para os investigados; -A coleta do material de análise pode exigir procedimentos invasivos, dolorosos ou demorados; -Coleta de materiais em curtos intervalos de tempo pode limitar a atividade social ou laboral dos investigados; - Em conjunto, há fatores que podem limitar a coleta de material e investigação do estudo o que necessitaria do uso de vários grupos de estudos para abordar um mesmo fenômeno investigado. Principais Limitações do estudo da Nutrição Experimental em Humanos Por que utilizar animais em pesquisa? Limitações em estudos com seres humanos Avanço da fisiologia e da fisiopatologia Cuidados Éticos Quando usar um modelo animal? Modelo é um objeto de imitação: - Algo que representa algo ou alguém; - Seja semelhante a imagem do outro. Um Modelo biológico deve ter características suficientes e semelhantes ao objeto imitado e “ser manipulado sem as limitações do objeto imitado”. USO DE ANIMAIS NA PESQUISA EXPERIMENTAL A utilização de modelos animais em pesquisas vem sendo realizada desde a Antigüidade. Neste período, Hipócrates (450 a.C.) já relacionava o aspecto de órgãos humanos doentes com o de animais, com finalidade claramente didática. Hipócrates Elizabeth do Nascimento 12 Seria o rato um modelo ideal aos estudos da Nutrição? Elizabeth do Nascimento 13 Motivos: 1-Os ratos são animais onívoros e se alimentam de quase todo tipo de dieta; 2- Devido ao seu tamanho, são de fácil manejo; rápida taxa de crescimento 3- Fisiologia e genética altamente correlacionada com humanos; 4- 90 a 95% dos estudos animais utilizados na pesquisa biomédica usa camundongos e ratos; bom modelo para o humano Savory, 1863 Elizabeth do Nascimento 14 O inicio da pesquisa experimental em nutrição tendo o rato como modelo, investigou a relação entre proteínas dietéticas e crescimento (Verzar, 1973) Elizabeth do Nascimento 15 Nutrição; Alimentação e estudos em animais In 1907 Os mais promissores estudos dos requerimentos nutricionais de animais foi a partir de estudos experimentais com animais de pequeno porte alimentados com dietas purificadas. (McCollum and Davis, 1913) announcing the discovery of ‘‘fat-soluble A,’’ semanas antes de Osborne e Mendel In 1913 In 1915 (McCollum and Davis, 1915) on the discovery of ‘‘water-soluble B.’’ Elizabeth do Nascimento 16 A Era biológica: metabolismo e fisiologia Os estudos de Osborne e Mendell e a ciência da Nutrição Elizabeth do Nascimento 17 Osborne e Mendelestudo do valor proteico de diferentes proteínas alimentares Determinação do valor nutricional de variadas fontes protéicas: estudos experimentais a partir do crescimento de roedores Estabelecimento dos termos: proteínas incompletas; qualidade biológica e aminoácidos limitantes A Era biológica: metabolismo e fisiologia Elizabeth do Nascimento 18 They developed one of the first metabolism cages (Fig. 1- 23, A) used in animal experiments (Osborne and Mendel, 1911). (McCollum, 1957). Osborne and Mendel: estudo do valor protéico de diferentes proteínas Fig. 1-23 Metabolism cage and food dispenser of Osborne and Mendel, from their publication of 1911 In 1918 they showed that phosphorus was an essential nutrient (Osborne and Mendel, 1918). Elizabeth do Nascimento 19 The rats used by these investigators became known as the Osborne- Mendel strain, although at times they were referred to as the ‘‘Yale strain,’’ and were especially noted for their large size (Zucker, 1953) Osborne and Mendel: estudo do valor protéico de diferentes proteínas Elizabeth do Nascimento 20 Permite quantificar, em intervalos de tempo programado, a ingestão de produtos sólidos e líquidos no decorrer de estudos envolvendo: 1) a ação de drogas que induzem a anorexia; 2) a aversão a determinadas substâncias; 3) o aumento da sede e os mecanismos da saciedade; 4) os hábitos alimentares e suas modificações frente a diferentes condições ambientais. Caixas Metabólicas USO DE ROEDORES DE LABORATÓRIO EM PESQUISA BÁSICA - Segundo o National Institutes of Health, os ratos são uns dos modelos animais mais importantes para o estudo dos processos fisiológicos e virtualmente podem servir para estudar e comparar de forma similar aos humanos todos os órgãos e sistemas. •Tamanho moderado; •Fácil adaptação a diversas dietas; •Rápida reprodução; •Geralmente é um animal Dócil ; •É um dos modelos animais com maior disponiblidade de estudos Custo mais acessível em relação as outras espécies USO DE ROEDORES DE LABORATÓRIO EM PESQUISA BÁSICA Animais de laboratório requerem cerca de 50 nutrientes em concentrações adequadas para seu crescimento e desenvolvimento. Refere-se ao conjunto de alimentos e/ou nutrientes previamente elegíveis, de composição energética e nutricional conhecida, que reproduzirá no animal o efeito nutricional desejado e que deve ser facilmente reproduzível. Requerimentos Nutricionais Modelo Dietético Experimental REQUERIMENTOS NUTRICIONAIS DO RATO/CAMUNDONGO COMO MODELO EXPERIMENTAL Formulações de dietas -Necessidade Nutricional do animal; - Alimentos a serem utilizados; - Forma de apresentação da dieta; - Consumo esperado de alimento. A quantidade de alimento ingerido é determinada pelas necessidades energéticas de cada espécies Energia (Calorias) É a forma química que pode ser mensurada Energia Bruta (EB): Energia desprendida da queima total dosalimentos Energia Digestível (ED): (Energia bruta dos alimentos) – ( Energia contida nas fezes) Energia Metabolizável (EM): (Energia digestível) – (Energia bruta contida na urina e nos gases) Energia Liquida (EL): (Energia metabolizável) – (Energia incremento calórico) Metabolismo Basal É a energia utilizada pelo animal em jejum, descansado e em repouso é transformada em calor liberado do organismo. Necessidades Energéticas de Mantença ou Manutenção - O animal está em atividade normal mas, por definição, não está produzindo e nem ganhando ou perdendo peso. - As necessidades energéticas de mantença são quase o dobro ou mais do metabolismo basal. Segundo o NRC (1995), a produção basal de calor para ratos pode ser expressa pela equação abaixo: Hkcal = 72 kcal x PM0,75 (Metabolismo basal) Hkcal = 114 kcal x PM0,75 (Manutenção) Hkcal = 227 kcal x PM0,75 (Crescimento) Hkcal = 265 kcal x PM0,75 (Gestação) Hkcal = 311 kcal x PM0,75 (Lactação) PM0,75 = Exemplo: Peso Corporal = 100g ou 0,1 kg 1 kg de Dieta tem aproximadamente 3600 Kcal de energia metabolizável (EM). Animal jovem em crescimento Hkcal = 227 kcal x PV0,75 (Crescimento) HKcal = 227 x 0,1000,75 HKcal = 40,4 kcal de Energia Metabolizável Dieta = 3600 kcal, então o animal irá precisar ingerir: 40,4 / 3600 = 11 g de dieta 1000g --------------- 3600 kcal x --------------- 40,4 kcal Necessidades de Proteína para Ratos - CRESCIMENTO E REPRODUÇÃO *MÍNIMO DE 15% (alto valor biológico) em dietas purificadas MANUTENÇÃO em torno de 5% (alto valor biológico) em dietas purificadas. (NRC,1995), MANUTENÇAO COM INGREDIENTES NATURAIS: deve situar- se entre 7% e 12%. Dietas comerciais: de 18 a 25%. (geralmente excedem as necessidades de manutenção do rato adulto) *Dietas com 10 a 15% de proteína de alto valor biológico podem ser suficientes para o crescimento quando oferecem 5% de gordura, baixo teor de fibra e 4kcal/g Maior autoridade em requerimentos nutricionais para ratos: Nutrient Requeriments of Laboratory animal – National Research Council, 1995) Não foi estabelecido quantidade definitiva para os carboidratos. Carboidratos como frutose podem levar a anormalidades comparadas à glicose e amido em dietas semipurificadas. Frutose ou sacarose aumentam o peso do fígado, de glicogênio e de lipídios hepáticos (hipertrigliceridemia) Maior autoridade em requerimentos nutricionais para ratos: Nutrient Requeriments of Laboratory animal – National Research Council, 1995) Necessidades de Carboidratos para Ratos Ácido linolênico (omega- 3): requerimentos dietéticos não estão totalmente determinados. A maioria das dietas possuem de 4 a 6%. O NRC, (1995) recomenda 5%. Razão entre n:6-n:3 1:6 Polinsturado:saturado ≈4 (Reeves, J. Nutr. 123: 1939- 1951, 1993) Fontes de ácidos graxos essenciais e vitaminas lipossolúveis. Omega -6 (linoléico); essencial na formação das membranas celulares e fonte de prostaglandinas. Dietas: de 6.0 a 3.0g/kg. Necessidades de Lipídios para Ratos Assim como os humanos, os ratos não digerem as fibras, mas realizam fermentação no ceco e colo (15 a 60% da celulose é degradada) . 32 Recomendação da AIN 5g/100g de dieta Necessidades de Fibras para Ratos Classificação das dietas. Forma física Grau de refinamento Tipos de dietas 1. Dieta proveniente de produtos naturais Correspondem aquelas formuladas com produtos agrícolas e seus subprodutos (ex: grãos de trigo, milho, farinhas de peixe , feijão soja, farelos, etc, ). Vantagens das Dietas Naturais -Podem retratar mais fielmente o consumo humano; - São mais palatáveis; - São mais baratas. Desvantagens das Dietas Naturais: - A variação da composição dos ingredientes naturais pode gerar alterações nas quantidades de nutrientes; - Menor biodisponiblidade de nutrientes; - Difícil controle da interação entre os constituintes alimentares. - Mais trabalho para elaborar e adequar os nutrientes. 1. Dieta proveniente de produtos naturais Tipos de dietas 2. Dieta Purificadas Tipos de dietas ex: - Fonte de proteína: caseína e proteína isolada de soja ; outros - Fonte de Carboidratos: Açúcar e amido; - Fonte de fibras: Celulose; - Fonte de lipídios e ácidos graxos essenciais: Óleo vegetal - Fonte de vitaminas e minerais: Mistura química de sais inorgânicos e vitaminas. Formuladas com ingredientes refinados e de quantidade limitada. Geralmente são puros e/ou de baixa variabilidade Vantagens: - Ideais para investigar a interação entre nutrientes; - Melhor controle da composição nutricional; - Menor potencial de contaminação; - A fonte do nutriente não é variável; - Amplamente aceita; Desvantagens: -São mais caras que as naturais; - Não retratam em sua maioria o consumo humano; - São menos palatáveis. 2. Dieta Purificadas Tipos de dietas - Usadas em estudos com rigoroso controle sobre a concentração de nutrientes. - Utiliza-se componentes elementares (ex; aminoácidos, carboidratos específicos, ácidos graxos essenciais, mix vitamínico e mineral definidos. Vantagens: - Alto controle do estudo de nutrientes específicos; - Ideais para uso em animais germ-free e estudos imunológicos com controle de antígenos alimentares; - A fonte do nutriente é única Desvantagens: - Pode ter sua biodisponibilidade de nutriente alterada em função do armazenamento e da oxidação; - Custo elevado. 3. Dietas quimicamente definidas (elementares) Tipos de dietas AIN- (AMERICAN INSTITUE OF NUTRITION) -INSTITUTO AMERICANO DE NUTRIÇÃO, 1973 Comissão criada com o objetivo de identificar padrões dietéticos para estudos nutricionais com animais (roedores) de laboratório Porque padronizar as dietas para animais de laboratório? Reduzir a variação inerente as dietas e facilitar a interpretação de resultados entre experimentos e laboratórios. Objetivo da comissão: Estabelecer diretrizes que auxiliariam pesquisadores a se sentirem mais seguros em relação aos aspectos nutricionais dos seus estudos. Em 1977... AIN – 76 AIN – 76A (1982) ... Utilizada extensivamente e bem aceita na comunidade científica ... Composição da AIN-76 Caseína Metionina Amido de milho Sucrose Fibra Óleo de milho AIN-76 mix mineral AIN -76 mix vitamínico Bitartarato de colina 20 0,3 15 50 5,0 5,0 3,5 1,0 0,2 Componentes % AIN – 76A: Aumento na concentração de vitamina K Problemas técnicos e nutricionais com a dieta ... (AIN-76A) HIPERLIPIDEMIA LESÕES HEPÁTICAS NEFROCALCINOSES REQUERIMENTOS DE COBRE Workshop, 1989: Discussão da composição da dieta AIN-76 AIN-93 AIN-93 G AIN-93 M Roedores no período de: - Gravidez - Lactação - Crescimento (Desmame até 50 dias); Fase de manutenção dos roedores Características acerca da AIN – 93 - Ingredientes purificados; - Estão de acordo ou excedem os requerimentos nutricionais do Conselho Nacional de Pesquisa (1978); - Larga aplicabilidade; - Ingredientes disponíveis com custo razoável; - Composições reproduzíveis; Modificações para a criação da dieta AIN-93: O óleo de soja foi adicionado no lugar de óleo de milho para aumentar a concentração do ácido linolênico; -Ácido graxo Linoléico (w-6): Linolênico (w-3): 1:6 - Ácido graxo Poliinsaturado: saturado: 2:1 Obs.: O óleo de soja é a gordura que mais se aproxima destes critérios: - 14% de AG saturado; - 23% AG monoinsaturado;- 51% AG linoléico; - 7% AG linolênico; - Ácido graxo Linoléico (w-6): Linolênico (w-3): 7 - Ácido graxo Poliinsaturado: saturado: aproximadamente 4 DL-metionina foi substituído por L-cistina; Celulose: 90-95% de polpa de madeira, 5-10% de hemicelulose e 5% de umidade O fósforo total foi reduzida para eliminar os problemas de rim de calcificação em ratas (relação cálcio: fósforo); Modificações para a criação da dieta Ain-93: Metionina Cistina Manganês foi reduzida a 1/5 da quantidade original (Garante o crescimento dos animais); Selênio: Forma de selenato (Não causa oxidação dos outros componentes dietéticos) e é absorvido mais rapidamente. - Proteção contra degeneração da retina dos ratos machos; - Atividade das enzimas antioxidantes; Elementos Ultratraços: cromo, fluoreto, boro, vanádio, arsênico, níquel, lítio e estanho (deficiência: Atraso no crescimento, compromete a performance reprodutiva); Modificações para a criação da dieta Ain-93: O aumento da vitamina A, vitamina K e B-12;
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