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08/01/2013 1 Nutrição, cultivo laboratorial, reprodução e crescimento dos micro-organismos Microbiologia I Josilene Matos Universidade Federal da Bahia Instituto de Ciências da Saúde Departamento de Biointeração UFBA Condições necessárias para o cultivo � Fatores físicos: temperatura, pH e pressão osmótica. � Fatores químicos: água, fontes de carbono, nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo e fatores orgânicos. � Fatores metabólicos: enzimas e processos associados aos fatores físicos e químicos. 08/01/2013 2 Nutrição microbiana “ Nutrientes: todos os materiais utilizados pela célula para a construção e manutenção da sua estrutura e organização, inclusive como fonte de energia, quando esta é de natureza química.” Bier, O., Microbiologia e Imunologia, 24a. Ed., 1985. �Nutrição bacteriana � Degradação de macromoléculas por bactérias através da secreção de enzimas hidrolíticas (hidrolases), proteases, lipases, etc. Nutrição microbiana �Mecanismo que fornece às células as ferramentas químicas (nutrientes) necessárias à síntese de moléculas celulares e produção de energia. � Importância da nutrição: • Torna possível a reprodução e crescimento bacteriano. � Ex: Protéinas estruturais, enzimas, mureína, LPS, polissacarídeos, ácido teicóico, ácidos nucléicos. 08/01/2013 3 Nutrição microbiana - principais elementos �Macronutrientes – Carbono • Forma o esqueleto dos carboidratos, lipídeos e proteínas. • Principais fontes �Autotróficos: utilizam o CO2 como principal ou única fonte de carbono. �Heterotróficos: utilizam compostos orgânicos como principal fonte de carbono (proteínas, carboidratos, lipídeos). Macronutrientes �Nitrogênio • Proteínas, ácidos nucléicos, mureína, ácido teicóico. • Principais fontes (diversidade dependente da espécie bacteriana) �Nitrogênio atmosférico (N2 → NH4 +) – fixação do nitrogênio �Obtenção a partir de nitrato ou amônia �Nitrogênio orgânico (aminoácidos ou peptídeos – fatores de crescimento). 08/01/2013 4 Macronutrientes �Enxofre • Síntese de aminoácidos (cisteína e metionina) e vitaminas (tiamina e biotina). • Principais fontes: � Íon sulfato (SO4 2-)→ H2S � Sulfito de hidrogênio (H2S) �Aminoácidos que contêm enxofre na estrutura Macronutrientes �Fósforo • Compostos orgânicos celulares - ATP, NADP, LPS, fosfolipídeos da membrana celular e ácidos nucléicos. • Principais fontes: �Micro-organismo somente obtém na forma de fosfato inorgânico (PO4 -3) � Potássio, magnésio e cálcio são necessários como co-fatores para as reações enzimáticas. 08/01/2013 5 Classificação dos micro-organismos quanto às fontes de energia e carbono Nutrição microbiana Oligo-elementos ou elementos-traços �Elementos exigidos em quantidades muito pequenas: • Ferro, cobre, zinco, cobalto, manganês. • Essenciais para a atividade de algumas enzimas. 08/01/2013 6 Fatores de crescimento �Compostos orgânicos que alguns micro- organismos necessitam: • Vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas �Micro-organismos fastidiosos • Bactérias láticas: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, etc. Cultivo Laboratorial �Meios de cultura • Material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de micro-organismos (cultura). �Aplicação • Isolamento e identificação de micro-organismos �Meios quimicamente definidos �Meios complexos (indefinidos) • Composição química não definida 08/01/2013 7 Meio quimicamente definido Meio complexo 08/01/2013 8 Quando se utiliza meios quimicamente definidos? � Para determinar as necessidades nutricionais de um determinado micro-organismo. � Cepa prototrófica • Não requer qualquer suplemento orgânico para crescer � Cepa auxotrófica • Necessita de suplementos orgânicos em um meio mínimo para se desenvolver. • Desenvolveu determinada necessidade nutricional em decorrência de uma mutação. Cultivo de micro-organismos � Cultivo de bactérias: meios de cultura bacteriológicos. � Cultivo de fungos: meios de cultura para fungos. � Cultivo de vírus: ovo embrionado ou cultura de células. 08/01/2013 9 Cultivo de bactérias �Meios de cultura bacteriológicos • Caldo nutriente (líquido) �Extrato de carne �Peptona �Cloreto de sódio �Água • Para solidificar, acrescentar ágar �Semi-sólido (0,3-05%) �Sólido (1,5-2%) Meio líquido - caldo BHI 08/01/2013 10 Meio sólido em tubo - inclinado Meio sólido em placa de Petri Qual seria a vantagem dos meios sólidos? �Imobilizam as células e permitem a formação de colônias • Características coloniais • Pureza de uma cultura Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 08/01/2013 11 Como cultivar bactérias intracelulares? �Culturas de células • Cultivos homogêneos que podem ser propagados e manipulados da mesma forma que as bactérias. • Clamídias, riquétsias e algumas espiroquetas são cultivadas em culturas de células. Meios – finalidade bacteriológica 08/01/2013 12 Meios de cultura - conservantes � Finalidade bacteriológica: 1. Conservantes • Contém substâncias que inibem as enzimas autolíticas e previnem os efeitos da oxidação • Transporte - Stuart / Amies Meios de cultura - seletivos � Finalidade bacteriológica: 2. Seletivos • Permitem o crescimento de um tipo particular de micro-organismo e suprimem o crescimento de outros. • Mac Conkey/EMB Microbelibrary.org (American Society of Microbiology) 08/01/2013 13 Meios de cultura � Finalidade bacteriológica: 3. Não-seletivos • Permitem o crescimento de ampla variedade de micro-organismos • Ágar sangue Meios de cultura � Finalidade bacteriológica: 4. De enriquecimento • Aumentar o número de micro-organismos de interesse até níveis detectáveis em uma população mista. • Caldo de tetrationato (Salmonella) 08/01/2013 14 Meios de cultura - diferenciais � Finalidade bacteriológica: 5. Diferenciais • Estabelecem diferenças entre micro-organismos de características parecidas • Ágar sangue/SS Meios de cultura - indicadores � Finalidade bacteriológica: 6. Indicadores • Possuem substâncias que evidenciam a utilização de determinados substratos • Urease 08/01/2013 15 Meios de cultura - redutores � Finalidade bacteriológica: 7. Redutores • Agente redutor presente no meio remove o oxigênio para produzir o meio reduzido • Tioglicolato de sódio – combina quimicamente com o oxigênio dissolvido em um meio e torna-o não disponível para os micro-organismos Crescimento e reprodução microbianos 08/01/2013 16 Crescimento e reprodução � Crescimento • Aumento no número de células � Reprodução • Fissão binária (maioria) • Brotamento (micoplasmas, leveduras) 31 Tortora et al, Microbiologia, 2012 Proteínas importantes no processo de divisão celular em bactérias �Proteínas homólogas às do citoesqueleto de células eucarióticas: • MreB (homóloga à actina) – forma celular, segregação dos cromossomos e localização de proteínas. • FtsZ (homóloga à tubulina) – forma celular regulação da divisão celular e segregação cromossômica. 08/01/2013 17 Proteínas Fts Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Tempo de geração � Tempo necessário para uma célula se dividir, ou para que a população duplique em número. � Fatores que podem influenciar o tempo de geração: • Composição nutricional e as condições físicas de incubação. 08/01/2013 18 Tempo de geração – são variados • Escherichia coli 20 - 30 min • Lactobacillus spp 70 - 85 min • Mycobacterium tuberculosis 18 - 20 horas Tortora et al, Microbiologia, 2012CRESCIMENTO BACTERIANO ⇒ N= 2n O aumento do número de células de uma cultura bacteriana em crescimento exponencial ocorre em progressão geométrica de quociente 2. 08/01/2013 19 Representação gráfica logarítmica x aritmética Curva de crescimento � É um gráfico que mostra a variação do número de células viáveis (capazes de se reproduzir) em função do tempo. � Esta curva é traçada para uma população em um sistema fechado (tubo contendo meio de cultura). • Nenhum novo nutriente é adicionado ao sistema e nenhum produto de excreção metabólico é removido. 08/01/2013 20 Quais são as fases do crescimento microbiano? Tortora et al, Microbiologia, 2012 Métodos para quantificar diretamente o crescimento microbiano � Contagem de colônias em placa • Método Pour-Plate (semeadura em profundidade) • Método de semeadura por espalhamento � Filtração � Contagem direta ao microscópio • Câmara Petroff-Hausser 08/01/2013 21 Diluição seriada– 30 A 300 colônias Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Contagem de colônias em placa 08/01/2013 22 Contagem de colônias em placa � É a técnica mais utilizada na determinação do tamanho de uma população bacteriana. � Vantagem: • As células viáveis são quantificadas. �Desvantagem: • Necessita tempo de incubação, em geral 24h. �Deve-se utilizar a diluição seriada. Contagem de bactérias pelo método de filtração Tortora et al, Microbiologia, 2012 Quando devemos filtrar? 08/01/2013 23 Contagem direta ao microscópio � Câmara de Petroff-Hausser � Vantagem: • Não necessita de período de incubação – resultado rápido. � Desvantagens: • Existe dificuldade para a contagem de bactérias móveis • São quantificadas células viáveis e mortas. • Limite de resolução do microscópio Tortora et al, Microbiologia, 2012 Câmara de contagem Petroff-Hausser 08/01/2013 24 Métodos indiretos na determinação do número de bactérias � Turbidimetria � Peso seco � principalmente para fungos filamentosos a) fungo é removido do meio por filtração b) seco em dessecador c) posterior pesagem Cultura contínua � Manter uma população microbiana crescendo continuamente em uma taxa particular, na fase logarítmica � Quimiostato Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 08/01/2013 25 Efeitos ambientais no crescimento microbiano �Fatores físicos • Temperatura • pH • Pressão osmótica • Atmosfera gasosa (reposta ao oxigênio) Efeitos ambientais - Temperatura Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Por que logo acima da temperatura ótima, o crescimento cai dramaticamente? 08/01/2013 26 Curva de crescimento x variação na temperatura Curva de crescimento característica de diferentes micro-organimos Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Crescimento de hipertermófilos 08/01/2013 27 Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 pH – acidez ou alcalinidade? � Maioria dos micro-organismos cresce melhor perto da neutralidade (pH 6,5 – 7,5); � Maioria das Bactérias: faixa entre pH 7,0 (neutrofílicos). �Exceções: • Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5). • Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11). 08/01/2013 28 Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Efeitos ambientais – pressão osmótica � Pressão osmótica Tortora et al, Microbiologia, 2012 08/01/2013 29 Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Concentração de sal Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio. Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada. Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações. Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 08/01/2013 30 Classificação de acordo com a atmosfera de cultivo �Aeróbios obrigatórios: 21% de oxigênio. �Anaeróbios obrigatórios: não podem crescer em presença do oxigênio. � Anaeróbios Facultativos: podem crescer na presença do oxigênio ou em anaerobiose. �Microaerófilos: oxigênio de 1 a 15%. �Anaeróbios aerotolerantes: anaeróbios que não morrem com a exposição ao oxigênio. Utilização de oxigênio AERÓBIO ESTRITOS alta [O2] catalase SOD ANAERÓBIO ESTRITO sem O2 ausência: catalase SOD MICRO AERÓFILO baixa [O2] AERÓBIO FACULTATIVO alta e baixa [O2] catalase SOD alta e baixa [O2] SOD ANAERÓBIO AEROTOLERANTES Catalase e a superóxido dismutase reduzem para H2O os compostos tóxicos. Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias. Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 08/01/2013 31 Influência do oxigênio �Anaeróbios • Não utilizam Oxigênio para as reações de produção de energia, podendo ser mortos por ele. �Methanobacterium – anaeróbio estrito �Anaeróbio aerotolerante – Lactobacillus �Anaeróbio facultativo – Escherichia coli �Microaerófilo – Campylobacter jejuni �Aeróbio – Micococcus luteus Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Por que o O2 é tóxico para os anaeróbios? 08/01/2013 32 Enzimas que inativam o O2 tóxico �Superóxido dismutase • Elimina os radicais superóxido, convertendo-os em peróxido de hidrogênio Madigan et al, Microbiologia de Brock, 2010 Incubação de anaeróbios �Métodos de produção de ambiente anaeróbio Tortora et al, Microbiologia, 2012 08/01/2013 33 Incubação �Métodos de produção de ambiente anaeróbio Injeção de N2, H2 e CO2 Tortora et al, Microbiologia, 2012 LABEM 66 08/01/2013 34 Em posse dos conhecimentos adequados, é possível manipular micro-organismos das mais diversas formas
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