Relatório 2 microbio

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Microbiologia
Relatório da prática 2
Presença de microorganismos no ambiente e semeadura de culturas
 
Anissa Naomi Yusuki				8629127
Daniela Carmona Braga 	6830484
Felipe Perucci Atui				
Luma Babolim
Priscila Tavares Carneiro 	8566566
 
Introdução
 
 	Os meios de cultura são soluções nutrientes que vêm sendo usados desde fins do século XIX para o estudo de micro-organismos e apresentam diversas aplicações práticas, pois permitem a identificação, cultivo, isolamento de colônia, replicação e cálculo da taxa de crescimento bacteriano. Podem ser diferenciados conforme sua textura, composição e função.
 	Conforme a textura há três tipos de meios: sólidos, semi-sólidos e líquidos. A principal vantagem dos meios sólidos é permitir o isolamento e análise da morfologia da colônia. Meios semi-sólidos e líquidos são preferíveis para o transporte, pois seus recipientes diminuem a probabilidade de contaminação, e para a diluição de culturas.
 	Conforme sua composição podem ser definidos, complexos ou enriquecidos. Meios definidos são aqueles em que se conhece com exatidão a composição química, em meios complexos a composição química é indefinida, e nos meios enriquecidos adiciona-se componentes nutricionais específicos.
 	E por fim, conforme sua função, os meios podem ser seletivos, quando são adicionados compostos que inibem o crescimento de determinados micro-organismos, ou diferenciais, quando adiciona-se um indicador específico par determinada reação química que permita identificar o micro-organismo.
 	Os meios de cultura sólidos seletivos podem ser usados para mensuração da quantidade de células por contagem de células viáveis em placa, pela semeadura por espalhamento de diluições seriadas do meio de cultura, visando isolar colônias de forma a permitir a contagem e cálculo da taxa de crescimento. A taxa de crescimento pode ser calculada a partir da seguinte fórmula:
X=x0 . Xn
 	As desvantagem desta técnica é existência de diversos fatores de erro, como erros de pipetagem, falta de homogeneização, colônias muito pequenas que dificultam a contagem e a formação de agregados celulares que invalidam o cálculo por estimativa da taxa de crescimento bacteriano.
 
Objetivos
 
Detectar a presença de micro-organismos no meio ambiente em locais à escolha do grupo;
Verificar o crescimento destes micro-organismos coletados, em meio de cultura rico e solidificado, em condição padrão, outro no mesmo meio adicionado com antifúngico e outro adicionado com antibiótico;
Avaliar diferentes técnicas de isolamento de culturas puras.
 
Materiais
 
Atividade 1 - Coleta de microrganismos do ambiente
 
· Placa contendo meio LB ou YT
· Cultura de bactéria crescida por uma noite a 370C
· Alça de platina
· Bico de Bunsen
 
Atividade 2: Método da estria em placa ou esgotamento
 
· Placas de Petri contendo cerca de 20 mL de meio de cultura (LB ou YT) sólido
· Tubos de ensaio contendo 4,5 e 5,0 mL de solução salina como diluente
· Pipetas de vidro
· Placas de Petri contendo álcool
· Alça de Drigalsky
· Suspensão de Bactérias: Cultura líquida de Escherichia coli com 12-24 horas de crescimento em estufa a 37ºC com agitação.
Atividade 3: Método do espalhamento com alça de Drigaslky
· Alça de Drigaslky
· Tubos eppendorf de 1,5 mL contendo solução salina (900µL)
·	Pipeta estéril
·	Placa de Petri
 
Métodos
 
Atividade 1 - Coleta de microrganismos do ambiente
 
Para a detecção de microrganismos presentes no meio ambiente, será distribuída para cada grupo 1 placa de Petri contendo meio de cultura rico, solidificado pela adição de ágar (TSA), previamente esterilizado, e também 1 placa do mesmo meio adicionado com antibiótico (ampicilina), e 1 placa do mesmo meio adicionado com antifúngico (anfotericina B). As 3 placas estão divididas em 3 áreas: A, B e C, nas quais deverão ser semeadas amostras de locais distintos utilizando swab umidificado em solução salina, à escolha do aluno (Ex: maçaneta da porta, sola de sapato, notas de dinheiro, etc).
A mesma amostra deverá ser semeada no mesmo quadrante nas 3 placas (TSA, TSA+Amp, TSA+Anf). Alguns grupos poderão deixar as placas abertas durante a aula, para que se depositem microrganismos em suspensão no ar. Ao final da aula, as placas serão incubadas a 30ºC até a próxima aula, para permitir o crescimento dos possíveis micro-organismos, o que irá originar colônias visíveis a olho nu.
 
Atividade 2: Método da estria em placa ou esgotamento
 
Mergulhar a alça de platina, depois de devidamente flambada e resfriada, no meio de cultura com as bactérias. Note-se que dentro da alça fica uma leve camada de líquido (contendo bactérias). Levar esta alça até a placa de Petri contendo o meio de cultura e fazer uma estria da amostra bem junto à borda da placa. Fazer um pequeno traço na parte superior da placa. Flambar a alça e esfriá-la, para iniciar uma nova estria a partir do canto da primeira estria. Flambar novamente a alça, esfriá-la e ir fazendo esgotamentos sucessivos até o centro da placa. Incubar as placas a 37ºC por 24 h, para poder observar as colônias isoladas.
 
Atividade 3: Método do espalhamento com alça de Drigaslky
 
Numerar os 6 eppendorfs de 1,5 mL contendo 900 µL de solução salina
Homogeneizar por agitação o tubo de cultura recebido até que se obtenha uma suspensão homogênea das bactérias. Este processo deve ser repetido toda vez que se for retirar uma amostra dos tubos, diluída ou não.
As amostras deverão ser retiradas dos tubos de ensaio com o auxílio de pipetas estéreis.
 
Diluição seriada:
· Retirar, com o auxílio de uma pipeta, uma amostra de 100 µL da cultura bacteriana não diluída e transferi-la para o eppendorf 1, contendo 900 µL de solução salina (diluição de 10-1). Homogeneizar bem.
· Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 1 e transferi-la para o eppendorf 2, de modo a obter uma diluição de 10-2. Homogeneizar bem.
· Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 2 e transferi-la para o eppendorf 3, de modo a obter uma diluição de 10-3. Homogeneizar bem.
· Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 3 e transferi-la para o eppendorf 4, de modo a obter uma diluição de 10-4. Homogeneizar bem.
· Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 4 e transferi-la para o eppendorf 5, de modo a obter uma diluição de 10-5. Homogeneizar bem.
· Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 5 e transferi-la para o eppendorf 6, de modo a obter uma diluição de 10-6. Homogeneizar bem.
· Semear 100 µL das diluições 10-4, 10-5 e 10-6 no centro das placas de Petri contendo o meio sólido, previamente marcadas com caneta de retroprojetor.
· Com o auxílio da alça de Drigalsky, previamente mergulhada em álcool, flambada e resfriada, espalhar a gota uniformemente na superfície da placa.
· Incubar as placas a 37oC por 24 h.
· Na próxima aula, serão contadas as colônias crescidas nas diferentes placas, para quantificar o número de células viáveis presentes na cultura original.
 
Discussão e Resultados
 
Atividade 1: Coleta de micro-organismos do meio ambiente:
 
Meio sólido rico:
Na coleta a partir da superfície de um aparelho celular houve o crescimento de três tipos de colônia. Duas apresentavam formato circular, elevação pulvinata e margens completas, sendo a de menor tamanho branca e a outra amarela. O outro tipo de colônia, de maior maior que as duas anteriores, tinha forma irregular, relevo, margens onduladas e aspecto seroso. Mas apenas poucas unidades formadoras de colônia de cada tipo cresceram.
 	A segunda coleta foi feita a partir da superfície da torneira de lavagem das mãos do laboratório didático, e também houve o crescimento de poucas colônias de mesma aparência que da coleta anterior, exceto pela ausência da colônia amarela.
A terceira cólera foi feita a partir da superfície interna de um tênis, havendo o crescimento de colônias de igual aparência, porém em grande quantidade.
 	
Meio acrescido de anfotericina B:
Não houve crescimento da colônia serosa em nenhuma das culturas, e novamente a maior taxa de crescimento ocorreu na cultura a partir do tênis.
A anfotericina B é um antifúngico, sendo adicionada com o intuito de eliminar os fungos das placas contendo o meio de cultura e micro-organismos coletados. Em geral, os antifúngicos atuam ligando-se e alterando especificamente os esteróis da membrana celular das células do fungo (ergosterol).
Existem outros antifúngicos, como por exemplo, a nistatina e natamicina, entre outros. Contudo, o mais amplamente utilizado é a anfotericina B.
 	Meio acrescido de ampicilina:
 	Houve crescimento apenas na cultura a partir do tênis, mas de uma colônia branca, com formato filamentoso, elevação umbonata e margens filamentosas.
Houve crescimento apenas na cultura a partir do tênis, mas de uma colônia branca, com formato filamentoso, elevação umbonata e margens filamentosas.
A ampicilina é um antibiótico. Antibióticos são compostos naturais ou sintéticos capazes de inibir o crescimento ou causar a morte de fungos ou bactérias. Podem ser classificados como bactericidas, quando causam a morte da bactéria, ou bacteriostáticos, quando promovem a inibição do crescimento microbiano.
Dessa forma, justifica-se o menor crescimento microbiano em meio acrescido de antifúngico ou antibiótico.
 
Atividade 2: Método da estria em placa ou esgotamento
 
 	A partir do isolamento de colônias por esta técnica, conseguiu-se isolar 11UFC.
 
Atividade 3: Método do espalhamento com alça de Drigaslky
 
 	A partir da diluição seriada de um cultura cultivada em meio líquido, semeou-se as três diluições de menores concentrações, porém nenhuma das placas permitiu a contagem de células viáveis. No cultivo das diluições 10−4 e 10−5 houve a formação de agregados celulares que inviabilizaram a contagem de colônias, e no cultivo da diluição de 10−6 o crescimento não se deu de forma homogênea, inviabilizando o cálculo por estimativa da quantidade de UFC. 
 
Conclusão
 
	Com esse experimento pudemos estudar mais sobre os meios de cultura e como são classificados (quanto à composição, textura e função). 
Fizemos e observamos na prática a cultura de micro-organismos de ambientes comuns a nós no meio sólido com e sem antifúngico e antimicrobiano. Vimos como foi diferente o crescimento dos micro-organismos de acordo com o local de onde foram colhidos e de acordo com o meio onde os cultivamos (bem como sua compostição).
Também pudemos trabalhar mais com técnicas como isolamento de colônias por esgotamento em placa de petri, e espalhamento com alça de Drigaslky após uma diluição seriada de cultura cultivada em meio líquido. Observamos a diferença do crescimento dos micro-organismos de acordo com a ordem da diluição utilizada.
 
Referências
 
· Material expositivo de aula fornecido por meio eletrônico