Bacteriologia Molecular.

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Técnicas de biologia 
molecular
da análise de genes e 
produtos gênicos únicos a 
abordagens em larga escala
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os mesmos genes, qual a diferença?
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Dogma central
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Localizando alvos
• Técnicas iniciais para evidenciar 
determinadas moléculas de interesse
• DNA / RNA métodos baseados em 
hibridização
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Hibridização
desnaturação / renaturação de ácidos nucléicos
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Light absorption and temperature in DNA denaturation. (a) Melting of doubled-
stranded DNA can be monitored by the absorption of ultraviolet light at 260 nm. As 
regions of double-stranded DNA unpair, the absorption of light by those regions 
increases almost twofold. The temperature at which half the bases in a double-
stranded DNA sample havedenatured is denoted Tm (for temperature of melting). 
Light absorption by single-stranded DNA changes much less as the temperature is 
increased. (b) The Tm is a function of the G·C content of the DNA; the higher the 
G·C percentage, the greater the Tm. 
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Southern blot
• DNA é hibridizado com uma sonda – um 
fragmento de DNA de seqüência conhecida que 
contém algum tipo de marcação e pode ser 
detectado. 
• Mostra sequências complementares à sonda 
• detecta pequenas quantidades (1 to 10 pg por 
banda) de uma sequência específica 1000 
vezes mais sensível que EtBr
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Southern blot - etapas
• Etapas: amostra de DNA 
submetida à eletroforese 
– mobilidades registradas
• DNA transferido para um 
filtro (nitrocelulose ou 
nylon) criando uma cópia 
do gel
• DNA é imobilizado no 
filtro
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Sothern blot - marcação de sonda
• Incorporação no DNA de nt 
marcado radioativamente (p 
ex. alfa fosfato P-32), ou por 
adição de um grupamento 
químico (digoxigenina ou 
biotina)
• COMO?
• "End labeling“ enzima 
polinucleotídeo quinase 
transfere fosfato terminal de nt 
radioativo P-32-gamma- para 
a extremidade 5’ do DNA
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Sothern blot - Hibridização da sonda ao DNA 
imobilizado no filtro
• A sonda é desnaturada 
(fervida) e adicionada 
(em excesso) em solução 
sobre filtro
• Sonda hibridiza com 
seqüências 
complementares
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Sothern blot - lavagens e detecção
• Lavagens retiram 
excesso de sonda e 
desfazem ligações 
inespecíficas 
(temperatura, força 
iônica) 
• Permanecem as 
ligações específicas 
• Revelação com base 
na marcação da 
sonda 
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Sothern blot - revelação
• Sonda radioativa- filtro 
é exposto a filme raio X, 
revelado
• Sonda marcação 
química – filtro é 
exposto a anticorpo 
conjugado a enzima (p 
ex. fosfatase alcalina) + 
substrato que pode 
gerar produto colorido 
ou luz
• a posição da sonda é 
revelada
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os mesmos genes, qual a diferença?
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Análise dos transcritos: Análise dos transcritos: NorthernNorthern BlotBlot
• Extrair RNA dos organismos ou tecidos
• eletroforese de RNA 
• transferência do RNA para uma membrana
• marcação de sequências conhecidas 
(sondas)
• Hibridização para localizar sequências alvo 
• Visualização e 
• quantificação do sinal 
• de hibridização
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Análise da expressão de proteínas: Análise da expressão de proteínas: 
WesternWestern BlotBlot
• Extrair proteínas das 
células 
• eletroforese 
desnaturante
• transferência das ptns 
para uma membrana
• Reação com anticorpo
• 2o anticorpo marcado
• Visualização e 
• quantificação do sinal 
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Sequenciamento de DNA
• Reação de sequenciamento -
replicação de DNA
• molde: DNA plasmídeo, fragmento ou 
produto de PCR (200 ng)
• um primer 20 nt complementar a uma 
região de uma das fitas de DNA
• tampão + dNTPs
• enzima variante da Taq polymerase
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Reação de polimerização
• Desnaturação do DNA 96oC 10 min + formamida
• PCR 96oC 10’’, 50oC 5´´, 60oC 4 ´25 X
• 2 fitas de DNA molde se separam, primer anela a 
uma delas especificamente, 
polimerase estende 
o primer
• apenas uma fita é 
sintetizada, não 
amplifica DNA
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• dideoxinucleotídeos -
sem 3' OH 
• ao serem adicionados 
à extremidade do DNA 
não há como continuar 
a síntese
• atuam como 
terminadores da 
síntese
• a maior parte dos nt 
são normais, uma 
fração são ddNTP
Método término da síntese de DNA por dideoxi-
nt
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dTTP normal em excesso, 
incorporado na maioria dos 
casos, a extensão continua
entrada de ddTTP aleatória, a 
fita para
ao fim milhões de moléculas 
incluem paradas em todas as 
posições de T
todas as moléculas têm o 
mesmo início mas términos 
variados 
tamanhos variados são 
separados por eletroforese
Sequenciamento de DNA - reação Ex: ddTTP
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• Dideoxi nt 
quimicamente 
modificados por 
adição de corante 
fluorescente.
• Reação com os 4 
ddNTPs (A, G, C, T) 
cada um com uma 
cor diferente permite 
ler a seqüência de 
DNA
Sequenciamento de DNA - reação
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Sequenciamento de DNA - automático
Leitura: sequenciador de DNA contém fonte de laser que atravessa 
o gel com um scanner, são registrados os comprimentos de 
onda de emissão quando cada fragmento de DNA passa pelo 
detector. Cada tipo de base com um comprimento de onda 
próprio. 
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Software de análise de sequência fornece a leitura das 
bases e um gráfico com intensidade de sinal, 
qualidade da sequência, tamanho pode chegar a 700 
nt
Sequenciamento de DNA - resultado
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