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METABOLISMO BACTERIANO: PROVAS BIOQUÍMICAS OBJETIVOS DA PRÁTICA Conhecer os princípios das provas bioquímicas utilizadas na identificação de espécies microbianas. Executar técnicas e interpretar resultados de identificação de espécies bacterianas através de provas bioquímicas. Introdução Por que realizar essa prática? A identificação de bactérias requer a observação e apreciação de caracteres morfológicos, culturais, metabólicos ou bioquímicos, antigênicos ou sorológicos, genéticos, ecológicos, etc. As colorações simples, diferenciais ou estruturais, mesmo se combinadas com diferentes tipos de cultivo e observação das características das colônias, não são suficientes para a identificação de bactérias isoladas. Devem-se utilizar outras técnicas ou metodologias que, combinadas com as outras características descritas anteriormente, possibilitem determinar com precisão qual a bactéria com que se está trabalhando e/ou pesquisando. Principais testes usados para identificação bacteriana ◦ Fermentação de carboidratos ◦ Teste da catalase ◦ Teste de utilização de citrato ◦ Liquefação de gelatina (gelatinase) ◦ Produção de H2S (gás sulfídrico) ◦ Teste do indol ◦ Teste do vermelho de metila (VM) ◦ Teste Voges-Proskauer (VP) ◦ Hidrólise do amido. Embora não fundamentado em reações bioquímicas, o teste de motilidade é de grande utilidade na distinção de gêneros e espécies bacterianas. Introdução Identificação bacteriana Provas bioquímicas: utilização de carboidratos, proteínas, lipídeos, etc. Coliformes termotolerantes Confirmação de E. coli- Teste IMViC (Indol, Vermelho de metila, Voges-Proskauer e Citrato) IMViC Teste com finalidade de diferenciar e identificar bactérias entéricas de natureza patogênica ou não, que atuam principalmente como contaminantes da água e dos alimentos. Detecção de gêneros em testes para coliformes, seus habitats fecais ou não fecais e sua enteropatogenicidade potencial para o homem. MEIOS DE CULTURA Meio SIM (Sulfeto-Indol-Motilidade): peptona (contém o aminoácido triptofano), extrato de carne, ferro peptonizado, tiossulfato de sódio e ágar. Meio Clark-Lubs (meio para VM-VP): peptona, dextrose, fosfato de potássio. Meio citrato de Simmons: citrato de sódio, sulfeto de magnésio, fosfato de dipotássio, fosfato de amônia, cloreto de sódio, ágar, azul de bromotimol. Gelatina Nutritiva PROVA DO INDOL Objetivo: determinar a capacidade do micro- organismo degradar o aminoácido triptofano até indol. Princípio: bactérias que possuem a enzima triptofanase são capazes de degradar triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico e amônia. O indol se acumula no meio e pode ser detectado pela adição do reativo de Kovacs (paradimetilaminobenzaldeído). PROVA DO INDOL O reativo de Kovacs (0,5 mL) contém um aldeído (p-dimetilaminobenzaldeído) que reage com o indol havendo o desenvolvimento de uma cor vermelha. PROVA DO INDOL Procedimento: Transferir micro- organismo a ser testado para o meio SIM. Após incubação a 35oC ± 2oC/ 48h, adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs em cada tubo. Observar se há formação de anel rosa na superfície do meio. Prova do Indol- RESULTADO Positivo: presença de coloração vermelha na superfície do meio. PRODUÇÃO DE H2S Objetivo: demonstrar o processo bioquímico de produção de sulfeto de hidrogênio (gás sulfídrico) por bactérias. Princípio: algumas bactérias são capazes de hidrolizar aminoácidos sulfurosos e produzir H2S. Esse produto pode ser evidenciado pela adição de compostos inorgânicos com ferro. PRODUÇÃO DE H2S A enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio. Na reação positiva a produção de gás sulfídrico em presença de sais de ferro (presentes no meio SIM) forma sulfeto insolúvel de cor negra. PRODUÇÃO DE H2S Procedimento: transferir o micro- organismo a ser testado para o meio SIM (semi-sólido), introduzindo a agulha de inoculação no centro do meio de cultura Incubar a 35oC ± 2oC /24 a 48 h. Após incubação, observar a presença de um precipitado escuro. PRODUÇÃO DE H2S Triptofano +água ácido pirúvico + H2S + amônia H2S + íon férrico sulfeto ferroso (precipitado negro) Resultado: ◦ Positivo para produção de H2S: presença do precipitado escuro no meio. ◦ Negativo para produção de H2S: ausência do precipitado escuro no meio. MOTILIDADE Não é classificado como prova bioquímica e sim fisiológica. Resultado positivo: micro-organismos deslocam a linha de inoculação turvando o meio. Prova Vermelho de Metila O teste VM visa identificar se a bactéria é capaz de produzir ácidos estáveis como produtos finais de fermentação. Na fermentação ácido-mista da glicose são produzidos ácido lático, ácido acético, ácido fórmico que reduzem o pH para 4,4. Prova Vermelho de Metila Objetivo: determinar a capacidade dos micro-organismos para utilizar a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. Prova Vermelho de Metila A adição do indicador de pH (vermelho de metila) revela a acidez do meio. A pH 4, o vermelho de metila adquire cor vermelha, o que indica uma reação positiva. Prova Vermelho de metila Procedimento: transferir o micro- organismo a ser testado para o meio Clark e Lubs (pH 7/ 7,2). Incubar a 35oC ± 2oC /48h. Após incubação, adicionar 4 a 5 gotas do indicador vermelho de metila e observar a coloração final do meio. Prova Vermelho de metila- RESULTADO Resultado positivo para produção de ácidos orgânicos: vermelho. Em meios acidificados, pH menor que 4, indicador torna-se vermelho. Em meios com pH maior ou igual a 6, indicador adquire cor amarela. Prova Voges-Proskauer (VP) O teste VP identifica organismos capazes de produzir acetoína a partir de degradação da glicose através da via butilenoglicolítica. Na fermentação butilenoglicólica são gerados produtos neutros, como o butilenoglicol, cujo o precursor é a acetoína. Prova Voges -Proskauer Objetivo: determinar a capacidade dos micro-organismos de produzirem produtos finais não ácidos ou neutros a partir da fermentação da glicose, como o acetilmetilcarbinol (acetoína) que é oxidado a diacetil. Princípios: a produção de compostos não- acídicos, como acetoína, podem ser identificados pela adição ao meio de cultivo dos reagentes de Barrit (soluções A e B). Prova Voges -Proskauer Procedimento: transferir o micro-organismo a ser testado para o meio Clark e Lubs (pH 7/ 7,2). Incubar a 35oC ± 2oC /48h. Após incubação, adicionar a cada tubo 15 gotas do reagente A de Barrit (-naftol a 5%) e 5 gotas do reagente B de Barrit (solução de KOH a 40%), agitar vigorosamente o tubo, deixar em repouso por 15 a 20 minutos e observar o resultado. Prova Voges -Proskauer A adição do reagente de Barrit (solução de alfa-naftol e metanol absoluto e solução de KOH) permite detectar a presença de acetilmetilcarbinol (acetoína), poisocorre a formação de um complexo rosa/vermelho que dá essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, após a adição do reagente de Barrit representa uma prova positiva. Glicose ácido pirúvico acetoína Acetoína diacetil complexo vermelho (Prova de Voges-Proskauer positiva). Prova Voges –Proskauer- RESULTADO Prova do Citrato Permite diferenciar micro-organismos com base na sua capacidade de utilizar o citrato como única fonte de carbono. Ex: Enterobacter aerogenes e Salmonella typhimurium A bactéria que utiliza citrato como fonte de carbono também é capaz de utilizar os sais orgânicos de amônia como única fonte de nitrogênio. Prova do Citrato O produto final do metabolismo desses sais é a amônia, que eleva o pH do meio. Indicador de pH: azul de bromotimol. O aumento do pH é percebido pela mudança de cor de verde para azul. Prova do Citrato Esta capacidade depende da presença da enzima citratase. Só ocorre na ausência de carboidratos fermentáveis Prova do Citrato Procedimento: transferir o micro-organismo a ser testado para o meio ágar citrato de Simmons, em tubo inclinado (maior concentração de O2). Incubar a 35oC ± 2oC /48h. Após incubação, observar as culturas contidas no tubo, avaliando a presença ou ausência de crescimento e as alterações na cor do meio de verde para azul. Prova do Citrato -RESULTADO + - PROVA DA GELATINASE Princípio: Determina a habilidade do micro-organismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefazem/hidrolisam gelatina. PROVA DA GELATINASE Reação positiva: se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantém-se líquido após refrigeração. Reação negativa: Se o micro-organismo não possui gelatinase, o meio volta a solidificar durante o período em que está no refrigerador. + - PROVA DA GELATINASE Objetivo: demonstrar que algumas bactérias hidrolisam o amido por produzirem uma enzima extracelular: a amilase. Princípio: a ação dessa enzima pode ser evidenciada, cultivando-se a bactéria em meio de cultura contendo amido. PROVA DA AMILASE Objetivo: demonstrar que algumas bactérias hidrolisam o amido por produzirem uma enzima extracelular a amilase. Princípio: a ação dessa enzima pode ser evidenciada, cultivando-se a bactéria em meio de cultura contendo amido. PROVA DA AMILASE Procedimento: ◦ Adicionar 0,2% de amido de milho ao meio (Ágar Nutritivo). ◦ Inocular as culturas a serem testadas na placa, com o auxílio de uma alça de inoculação estéril, em pelo menos duas estrias eqüidistantes. PROVA DA AMILASE ◦ Incuba-se a placa a 35ºC/48 horas. ◦ Após o período de incubação, adicionar várias gotas de lugol sobre as linhas estriadas na superfície do ágar. PROVA DA AMILASE-Resultado Positivo: área ao redor da linha de crescimento apresenta-se clara. Negativo: o meio torna-se azul/escuro, sem regiões claras ao redor da linha de crescimento. PROVA DA CATALASE Verificar a positividade do teste em uma lâmina de vidro comum contendo uma porção do material fresco a ser analisado, em tubos de ensaio com a cultura ou mesmo em placas de Petri com colônias viáveis. PROVA DA CATALASE A formação de bolhas após adição do peróxido de hidrogênio indica a positividade do teste, ou seja a presença da enzima catalase. PROVA DA CATALASE Procedimento: ◦ Tubos de ensaio ou placas de Petri com Ágar Nutritivo são inoculados com as culturas a serem testadas. ◦ Incuba-se a 35ºC por 18-24 horas. ◦ Após o período de incubação, adicionar algumas gotas de peróxido de hidrogênio (Água oxigenada-H2O2) e observa-se a formação ou não de bolhas. PROVA DA CATALASE Positivo: formação de bolhas indica a presença da enzima catalase. Negativo: sem formação de bolhas. Fermentação de Carboidratos Procedimento: ◦ Carboidratos a serem testados (Glicose, Lactose, Sacarose e Manitol) são adicionados ao meio líquido Caldo Vermelho de Fenol e são distribuídos em tubos de ensaio contendo tubos de Durham. Fermentação de carboidratos ◦ Com o auxílio da alça de inoculação, as bactérias são transferidas para o meio de cultura. ◦ Incuba-se a a 35ºC por 24-48 horas. ◦ Após o período de incubação, observar a coloração do meio e a presença ou ausência de bolhas no interior do tubo de Durham. A verificação deste teste é visual, se a bactéria fermentar o carboidrato presente no meio haverá produção de ácidos ou ácidos + gás. Fermentação de carboidratos- RESULTADO Positivo para gás: formação de bolhas no interior do tubo de Durham Positivo para ácido: meio de cultura na cor amarela. Negativo para gás: sem formação de bolhas. Negativo para ácido: meio de cultura na cor vermelha. RESULTADOS Execução do procedimento seguindo as técnicas assépticas e observando a metodologia a ser seguida. Após o período de incubação, anotar os resultados na tabela, comparar com os dados da literatura para fazer a identificação dos micro-organismos testados. Tabela para resultados Gelatinase
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