Cinética Enzimática e Fermentativa

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Cinética Enzimática
Luciana R. B.Gonçalves
Universidade Federal do Ceará
Departamento de Eng. Química
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2
Histórico
3
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Enzimas – Catalisadores
As enzimas não apresentam efeito
termodinâmico global, atuam diminuindo a
energia de ativação;
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Enzimas – Catalisadores
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Sítio catalítico (Asp52 e Glu 35) na
estrutura da lisozima
7
Especificidade Enzimática: sítio ativo
8
E + S E S P + E
Substrato se liga ao 
SÍTIO ATIVO
da enzima
Reação Enzimática
9
Reação Enzimática
10
Reação Enzimática
11
Enzimas: Sítio Ativo
12
Enzimas: Sítio Ativo
13
Reação Enzimática
14
Reação Enzimática
15
Reação Enzimática
16
Cinética com um único substrato
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Progressão dos componentes de uma reação
enzimática simples de Michaelis-Menten
Tempo
concentração
período de indução
(alguns milésimos
de segundo!!!)
velocidade inicial
(de alguns segundos até muitos
minutos, conforme a reacção)
18
Mecanismo de ação enzimática e
cinética de reação
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
0,075
0,080
0,085
0,090
0,095
0,100
0,105
0,110
0,115
0,120
 
 
v 
(m
m
ol
/m
in
)
S (mM)
Sk
SV
v
m 
 max
Cinética de Michaelis-Menten:
19
Cinética de Michaelis-Menten
Hipóteses:
1. A etapa de ligação do substrato e a formação com
complexo ES é rápida em relação à velocidade de formação
do produto;
2. A concentração de substrato se mantém relativamente
constante durante o tempo de reação ([S0] ≈ [St ]). Isto
se deve ao fato de utilizarmos medidas de velocidade
inicial: [S0]≫[ET ].
3. A formação do produto é irreversível, uma vez que a
concentração durante o ensaio é baixa;
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Modelo estacionário:
A concentração do ES é constante ao longo do ensaio, ou
seja, d[ES]/dt = 0).
Cinética de Michaelis-Menten
21
Modelo estacionário:
A velocidade de formação do produto é a etapa limitante:
Sabemos ainda que: e Vmax = kcat[ET ],
Assim:
Vmax
Sk
SV
v
m 
 max
Cinética de Michaelis-Menten
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[S]≪Km
[S]≫Km
Cinética de Michaelis-Menten
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Velocidade inicial em função da concentração de substrato para uma enzima
com Vmax = 80 nM min−1 and Km = 37 μM.
Cinética de Michaelis-Menten
24
Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition
25
S (mM) V (mmol/l min)
0 0
8,3 12,6
10 15,7
12,5 18,4
16,7 23,5
20 25,1
25 40,2
33,3 37,9
40 40,3
50 43,2
60 48
80 50,4
100 69,7
150 61,3
200 66,4
A reação enzimática foi
acompanhada em laboratório
e os seguintes dados de
velocidade em função da
concentração inicial de
substrato foram obtidos:
a) A reação pode ser
representada pela equação
de Michaelis-Menten?
b) Em caso afirmativo,
quais as constantes cinéticos
do modelo?
Cinética de Michaelis-Menten
26
km = 60,8 mM
Vmax = 107,5 mmol/L min
Cinética de Michaelis-Menten
27
km = 37,7 mM 
Vmax = 79,1 mmol/L min
Cinética de Michaelis-Menten
Gráfico de Eadie-hofstee
28
Usando o solver do excel para calcular Km e Vmax
Km = 38,6003 mM n=15
Vmax = 81,0785 mmol /L min p=2
S (mM) vexp (mmol/l min) velocidade calc (Vexp-Vcalc)^2
0 0
0,0000 0
8,3 12,6
14,3485 3,05742703
10 15,7
16,6827 0,965718978
12,5 18,4
19,8332 2,053974969
16,7 23,5
24,4847 0,969608959
20 25,1
27,6717 6,613609195
25 40,2
31,8703 69,38354196
33,3 37,9
37,5508 0,121943185
40 40,3
41,2612 0,923826234
50 43,2
45,7552 6,529048102
60 48
49,3377 1,789372662
80 50,4
54,6902 18,40621126
100 69,7
58,4981 125,4832885
150 61,3
64,4844 10,14033454
200 66,4
67,9618 2,439150662
sum quad = 19,14438894
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Cinética de Michaelis-Menten
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Inibição da atividade enzimática
Muitas substâncias afetam a atividade das moléculas
enzimáticas combinando-se com elas, influenciando
negativamente a ligação do substrato ou a velocidade
de reação.
Essas substâncias designam-se inibidores. São em geral
classificadas conforme o seu modo de ação.
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Inibição competitiva
substrato S inibidor competitivo I
Um inibidor competitivo é uma molécula que
compete diretamente com o substrato pelo
centro de ligação ao enzima.
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Inibição competitiva
33
Inibição competitiva
34
A molécula de inibidor liga-se a enzima num local diferente
do centro ativo, alterando a conformação da proteína
enzimática, o que a torna inativa.
substrato S substrato S
inibidor não
competitivo I
Inibição não-competitiva
35
Inibição não-competitiva
36
Inibição não-competitiva
37
Inibição não-competitiva
38
 )][1]([)][1
][max
II
m
K
I
S
K
I
K
SV
v


Inibição não-competitiva
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+I-I
A inibição acompetitiva caracteriza-se pelo
fato de o inibidor se ligar exclusivamente ao
complexo ES e não ao enzima livre.
Inibição acompetitiva
40
][
][
1
][
][
1
max
S
K
I
K
S
K
I
V
v
I
m
i




ou








i
m
K
I
SK
SV
v
][
1][
][max
Inibição acompetitiva
41
Inibição competitiva:
Inibição não-competitiva:
Inibição acompetitiva:
42
Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition
43
Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition
44
Inibição Não Competitiva
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46
Inibição pelo produto
 ][)][1
][max
S
K
P
K
SV
v
P
m 

 ][)][1
][max
S
K
P
K
SV
v
P
m 

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Inibição pelo substrato
S
m
K
S
SK
SV
v
2
max
][
][
][


0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
0,08
0,10
0,12
 
 
v 
(m
m
ol
/m
in
)
S (mM)