Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
CENTRO UNIVERSITÁRIO MAURÍCIO DE NASSAU CURSO DE GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA QUIMICA RELATÓRIOS DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA APLICADA A INDÚSTRIA Danilo Morais Brito Hélio José Da Silva Maria Izabel Medeiros Salvador de Alcântara Mariana Costa Couto Rafaela Maria Oliveira Santoro RECIFE 2016 Danilo Morais Brito, Hélio José Da Silva, Maria Izabel Medeiros Salvador De Alcântara, Mariana Costa Couto, Rafaela Maria Oliveira Santoro. RELATÓRIOS DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA APLICADA A INDÚSTRIA Relatório referente à graduação de Engenharia Química, como requisito parcial para obtenção da primeira nota da disciplina de Bioquímica aplicada a indústria, ministrada pela professora Maria Clara, como pré-requisito para a nota da 1º avaliação. RECIFE 2016 SUMÁRIO 1. AULA PRÁTICA DE EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ............................................... 3 1.1 Introdução .............................................................................................................................. 3 1.2 Metodologia ........................................................................................................................... 5 1.2.1 Materiais e Reagentes ................................................................................................. 5 1.2.2 Procedimento Experimental ........................................................................................ 5 1.3 Resultados ............................................................................................................................. 5 1.4 Conclusão .............................................................................................................................. 6 1.5 Referências Bibliográficas ................................................................................................... 7 2. AULA PRÁTICA DE ENZIMAS .................................................................................................. 8 2.1. Introdução .............................................................................................................................. 8 2.2. Metodologia ........................................................................................................................... 9 2.2.1. Materiais e Reagentes ................................................................................................. 9 2.2.2. Procedimento experimental ........................................................................................ 9 2.3. Resultados ............................................................................................................................. 9 2.4. Conclusão ............................................................................................................................ 13 2.5. Referências Bibliográficas ................................................................................................. 13 3 1. AULA PRÁTICA DE EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 1.1 Introdução Em 1953 os biólogos e biofísicos James Watson e Francis Crick descobriram a estrutura do DNA, o qual cada molécula tinha uma dupla hélice formada por duas cadeias ou fitas compostas de vários nucleotídeos, entretanto, na década de 1940, Erwin Chargaff e seus colaboradores descobriram que as quatro bases nucleotídicas do DNA diferem de suas formas e de acordo com cada espécie, concluindo que: são modificadas as composições das bases do DNA entre as espécies; os DNAs das mesmas espécies com tecidos diferentes isolados possuem a mesma composição de bases; as bases do DNA não se modificam com o passar do tempo; para todos os DNAs celulares, a quantidade de resíduos de adenosina (A) é igual ao de timina (T), e a quantidade de resíduos da guanosina (G) é igual ao de citidina (C), ou seja, A+G = T+C (LEHNINGER, 2002). “Os ácidos nucleicos são necessários para o armazenamento e a expressão da informação genética. Existem dois tipos distintos de ácidos nucleicos: o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA)” (CHAMPE, 2006, p. 393). Ambos trabalham em conjunto para garantir o funcionamento correto das células, sendo os filamentos de RNA formados através de uma sequência de nucleotídeos de DNA da célula.Os três componentes característicos dos nucleotídeos são base nitrogenada, um açúcar pentose e um grupo de fosfato.As principais bases purínicas e pirimidínicas dos ácidos nucleicos são Adenina (A), Citosina(C), Guanina(G),Timina (T) e Uracila (U), sendo esta última pertencente ao RNA na troca com a Timina (T) (LEHNINGER, 2002). As moléculas de DNA contêm duas grandes fitas de nucleotídeos pareadas, cujas bases são unidas através de pontes de hidrogênio: duas entre A e T, e três entre G e C. “Essas pontes de hidrogênio juntamente com as interações hidrofóbicas entre as bases empilhadas, estabilizam a estrutura da dupla hélice” (CHAMPE, 2006, p. 395). Quando estas pontes são quebradas, há a separação das duas fitas de DNA na dupla hélice (CHAMPE, 2006). “As moléculas de DNA são as maiores macromoléculas nas células e são usualmente empacotadas em estruturas chamadas cromossomos. Um único cromossomo pode carregar milhares de genes. Juntos, todos os genes e DNA intergênicos (DNA entre os genes) da célula formam o genoma celular” (LEHNINGER, 2002, p. 713).Alguns genomas mais complexos exigem maiores níveis de organização cromossômica, refletindo em determinados aspectos estruturais, como as sequências de DNA e seus elementos estruturais internos. Pode-se dizer, ainda, que os genomas referem-se ao conjunto básico 4 dos cromossomos de cada espécie, e que essas variações naturais ou induzidas podem ser chamadas de poliploidia(NEVES, L.A.S, 2013) Poliploides podem surgir pela duplicação de células somáticas e pela fusão de gametas citologicamente não reduzidos, sendo essa última à forma mais comum na natureza (DE WETT, 1971), mais especificamente, em algas e em plantas perenes, que se multiplicam assexuadamente, nas plantas de altitudes, e dependendo das quantidades cromossômicas contidas em cada espécie podem ser chamadas de diploides (2x), triploides (3x), tetraploides (4x), e assim sucessivamente. Essas diferenças nos cromossomos conseguem ser identificadas na extração referente a cada substância, como por exemplo, o morango e a cebola (NEVES, L.A.S, 2013). Para se extrair o DNA desses dois produtos e identificar seu tipo de célula ou cromossomo, é preciso preparar uma solução tamponante para se manter o pH da solução com um valor predeterminado e relativamente constante. Quando se altera um dos fatores que influencia um equilíbrio, este sempre se desloca no sentido de anular ou, pelo menos, atenuar o efeito da alteração provocada. E ainda, ao serem introduzidos íons H+, estes são retirados pelos íons A- para formar o ácido HÁ, com isso o pH do meio praticamente não é alterado (BOSQUILHA, 1999). E segundo Lehninger (2002), quando os ácidos ou bases fracos são dissolvidos na água, eles produzem H+ por ionização; bases consomem H+ para ser protonadas. As pontes de hidrogênio entre as moléculas de água tornam a hidratação dos prótons dissociados virtualmente instantânea. Por possuir carga negativa, o DNA se neutraliza com a adição do sal (NaCl) na solução, sendo os íons Na+ responsáveis pela carga do DNA e os íons negativos Cl- pela carga das histonas, fazendo com que as moléculas se enovelem e, posteriormente, haja precipitação do DNA. Com a adição do detergente há a ruptura das membranas biológicaspor serem oriundos dos lipídeos, tornando-se solúveis para extrair as demais proteínas que possuam essa propriedade. E a importância do álcool na solução dar-se-á devido à insolubilidade do DNA no álcool, ou seja, por não se dissolver na presença dessa função orgânica, consegue-se identificar a separação da mistura aquosa dos restos celulares, uma vez que o mesmo se precipita na superfície da solução, formando-se grumos junto a outras moléculas. 5 1.2 Metodologia 1.2.1 Materiais e Reagentes Os materiais utilizados foram bastão de vidro, funil, proveta graduada de 100 mL, béquer de 250 mL, ralador ou picador, peneira, faca, almofariz e pistilo; Os reagentes e soluções utilizados foram cloreto de sódio (NaCl), detergente, álcool etílico gelado (aproximadamente 10º C), água destilada, gelo, cebola e morango. 1.2.2 Procedimento Experimental 1. Ralar a cebola; 2. Coloque em um béquer o detergente, a água e o cloreto de sódio, mexendo a mistura até que os seus elementos se dissolvam completamente; 3. Adicione a esta solução a cebola ralada; 4. Coloque o béquer no banho-maria a 60º por 15 minutos, mexendo de vez em quando; 5. Findado esse tempo aplicar um choque término na solução colocando o béquer no gelo por 5 minutos; 6. Misturar a cebola com a solução por 45 segundos e colocar no gelo por 15 minutos; 7. Filtrar a mistura em uma peneira sem deixar passar a espuma e recolhendo o filtrado em um béquer limpo; 8. Adicione ao filtrado álcool etílico gelado, deixando-o escorrer pela parede do béquer; 9. Verifique a formação de duas fases e o surgimento de fios viscosos de DNA; 10. Mergulhe o bastão de vidro e, com movimento circular em um único sentido, entre as duas fases e enrole os filamentos obtidos; 11. Registrar o ocorrido. 1.3 Resultados Foram separados 12 (doze) morangos para serem macerados no almofariz com pistilo e 2 (duas) cebolas pequenas para serem raladas no ralador. Após o procedimento realizado, ficaram reservados. Em seguida, foram adicionados 120 mL de água destilada em dois béqueres de 250 mL, e adicionou-se 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em cada um. Com o bastão de vidro, foi feita a mistura gradativamente até que o sal (NaCl) estivesse totalmente diluído na água e a solução uniforme. Em seguida, mediu-se em uma proveta graduada de 100 mL uma quantidade de 120 mL de detergente para serem adicionados nas duas 6 soluções. Chama-se esta etapa de solução de extração ou solução tampão, que serve para resistir às variações no pH oriundas da adição ou diluição de ácidos ou bases. Um tampão é uma mistura de um ácido fraco e sua base conjugada ou uma base fraca e seu ácido conjugado, que resiste a variações no pH (SKOOG, 2004). Ainda segundo Harris (1999), uma solução tamponada resiste a mudanças de pH quando ácidos ou bases são adicionados ou quando uma diluição ocorre. Após a preparação da solução tampão e colocados os 120 mL em cada béquer, foi adicionado no primeiro béquer o morango macerado e no segundo a cebola ralada, conforme descrito anteriormente. Após isso, os dois béqueres foram colocados em banho maria a uma temperatura de 60ºC durante o tempo de 15 minutos, mexendo as soluções a cada 5 minutos. Terminado esse tempo, foi colocado no banho de gelo por mais 5 minutos, sem mexer. Logo após, mexeu as soluções com o bastão de vidro por 45 segundos e colocou-as novamente no banho de gelo, por mais um período de 15 minutos. Concluída esta etapa, as soluções foram peneiradas, separadamente, e reservou-se uma quantidade de 100 mL de cada uma em 2 (dois) béqueres limpos. Após essa fase, foi incluído cuidadosamente, pela parede do béquer, o álcool etílico gelado. Quanto à mistura com morango, observou-se com maior nitidez a separação do DNA do composto e sua pectina (grumos aglutinados), devido às altas concentrações de NA+ contidas na solução, assim como,a precipitação da fita de DNA, devido à sua insolubilidade no álcool. Essa reação ocorreu porque o morango tem uma maior concentração de DNA nos seus cromossomos, por ser uma célula decaplóide. Quanto à cebola, observou-se a separação do DNA na divisão entre a solução e o álcool (devido à sua insolubilidade), formando filamentos esbranquiçados e aglomerados no topo do béquer. Os grumos ficaram diferentes do morango porque a cebola tem uma menor concentração de DNA em seus cromossomos, por ser uma célula haplodiplonte (alterna sua vida entre a fase haploide e diploide). 1.4 Conclusão De acordo com os resultamos obtidos, verificou-se que é possível identificar os filamentos do DNA das substâncias através da mistura de uma solução tampão com o álcool etílico. Como o DNA é menos denso que a água e insolúvel no álcool, há uma precipitação na mistura dispersando-as na solução. Foi identificado filamentos de DNA tanto no morango quanto na cebola, no entanto, a diferença identificada na extração de cada uma referiu-se a quantidade de células cromossômicas existente em cada espécie. 7 1.5 Referências Bibliográficas BOSQUILHA, GLÁUCIA ELAINE. Minimanual Compacto de Química: Teoria e Prática.1ª Edição. Rideel Editora, 1999. Pág. 454-470. CHAMPE, P. C. HARVEY, R.A. FERRIER, D.R. Bioquímica Ilustrada. Trad. C. Dalmaz. 3ª Ed. ArtmedEditora, 2006. p. 395 DE WETT, J.M.J. Polyploidy and evolution. Taxon, v.20, n.1, 1971, p.29-35 HARRIS, D.C. Quantitativechemicalana-lysis. 5ª ed. Nova Iorque: W.H. Freeman, 1999. p. 222-233. LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L. e COX, M.M. Princípios de bioquímica. 3ª ed. Trad. A.A. Simões e W.R.N. Lodi. Ed. São Paulo: 2002. p. 71-72; 256. NEVES, L.A.S.; Genética dos poliploides. Universidade Federal de Santa Maria – Centro de ciências naturais e exatas – Rio Grande do Sul: 2013. SKOOG, D.A.; WEST, D.M. e HOLLER,F.J. Fundamentals of analytical chemistry. 7ª ed. Fort Worth: Saunders College, 1996. p. 236. . 8 2. AULA PRÁTICA DE ENZIMAS 2.1. Introdução A qualidade de um alimento esta ligada diretamente ao seu tempo de deterioração, que por sua vez consiste em uma série de fenômenos fundamentais ligados as suas composições (FENNEMA, 2000). No Brasil, a produção das frutas visa atender o consumidor in natura e aquelas que não se apresentam dentro dos padrões são destinadas à alimentação animal ou simplesmente descartadas. As maçãs consideradas desclassificadas para uso de mesa são atualmente consideradas como frutas industriais, pois, com o aumento de produção, algumas unidades industriais e passaram a processá-las agregando valor econômico, uma vez que na composição do custo industrial 25% estão relacionados à matéria-prima (SILVA, 2004, 107f). As enzimas são proteínas com função especifica, elas aceleram consideravelmente a velocidade das reações químicas em sistemas biológicos quando comparadas com reações correspondentes não catalisadas. São também biocatalizadores de natureza proteica que desenvolvem um papel fundamental em processos metabólicos (MOTTA, 2006). A atividade de uma enzima pode ser determinada com base na velocidade de conversão de um reagente adequado (substrato) e está estritamente vinculada aos agentes desnaturantes, pelo fato de sua função catalítica depender da conformação na qual a enzima se apresenta (RIEGEL, 2003) Dentre as enzimas destaca-se a catalase e a peroxidase, que são enzimas de grande interesse na área de alimentos. Elas ocorrem em plantas, animais e microrganismos, e nos animais e vegetais acredita-se que a função delas seja proteger os tecidos contra os efeitos tóxicos da água oxigenada formada durante o metabolismo celular (NEVES [2], 2013). A diferença entre elas está no mecanismo de ação, enquanto a catalase reduz diretamente a água oxigenada a água e gás oxigênio, a peroxidase o fazacelerando a reação da água oxigenada com um substrato. (REMIÃO, 2003). As reações enzimáticas são muito importantes, pois possuem relação direta com diversas reações vitais de organismos vivos. Sabe-se que essas reações tanto podem ser benéficas quanto prejudiciais. Como bom exemplo da ação enzimática destaca-se o aroma da cebola, o processo digestório que sem ação enzimática duraria um tempo maior; porém tem-se como exemplos ruins o escurecimento de certos vegetais que os deixam com menos nutrientes (VOET, 2006). 9 2.2. Metodologia 2.2.1. Materiais e Reagentes As vidrarias utilizadas foram: faca, ralador, peneira, 5 Becker de 250 mL, 6 tubos de ensaio; Os reagentes e soluções utilizados foram: Água destilada, Reagente de biureto, Peróxido de Hidrogênio (água oxigenada) -���� (��) e Guaiacol ����. 2.2.2. Procedimento experimental 1. Preparo do extrato enzimático Lave e descasque uma maçã de tamanho médio; triture no ralador; filtre, através de uma peneira, e armazene o filtrado enzimático em um Becker. 2. Caracterização das enzimas Em um tubo de ensaio adicione 5 gotas do filtrado (solução enzimática) e em seguida 2 mL de água destilada. Em um segundo tubo de ensaio adicione 2 mL de água destilada. Agite e adicione 2 mL do reagente de biureto em cada um dos tubos; 3. Teste da atividade das enzimas a) Teste para catalase Em um tubo de ensaio adicione 5 gotas de água oxigenada 10V; noutro tubo adicione 5mL do filtrado enzimático mais 5 gotas de água oxigenada; tampando a boca dos tubos, misture os conteúdos por inversão, sem agitar; deixe em repouso por alguns minutos; observando o resultado. b) Teste para peroxidase Numere dois tubos de ensaio e transfira 2 mL do filtrado de maçã mais 2 mL de água destilada para cada um deles; aos dois tubos de ensaio, adicione 1 mL da solução de guaiacol 0,5%; coloque, apenas no tubo 1, 5 gotas de água oxigenada 10V; agite; observe as alterações ocorridas durante um período de aproximadamente 3 minutos; 2.3. Resultados Na primeira solução de filtrado enzimático com água e solução de biureto, houve uma mudança na coloração podendo ser vista através da figura 1. O reativo de Biureto é baseado na reação de sulfato de cobre em meio alcalino e devido a sua alta sensibilidade é utilizado para verificar a presença de proteínas, sua coloração azul é justificada pela presença do cátion �� . 10 Diluído em água apresentou uma coloração azul clara, devido à interação peptídica feita do cátion �� com a água, estas ligações são muito parecidas com as ligações peptídas estabelecidas entre os aminoácidos durante a formação dos peptídeos e posteriormente as proteínas (NEVES [1], 2013), como pode ser visto na Figura 2. Porem na presença do filtrado enzimático o mesmo apresentou coloração verde, caracterizando a presença de enzimas na reação e ligações peptídicas. Na segunda solução de água oxigenada e filtrado enzimático houve um escurecimento maior e mais rápido, seguido de formação de bolhas na reação podendo ser vista na figura 3 e na Figura 4 a comparação com o filtrado enzimático da maçã; Figura 1 – Solução de Filtrado enzimático e Biureto (cor verde) e de Biureto com água (cor azul). Figura 2 – Interação peptídica entre o cátion de �� e Água. 11 Isso ocorre devido à enzima catalase (Figura 5), que funciona como um catalisador natural, onde diminui a energia de ativação, fazendo assim com que ela se processe de forma mais rápida (FOGAÇA, 2016). Degradando Peróxido de hidrogênio em �� e ���. Figura 5 – Enzima catalase. Na terceira solução, para caracterização da peroxidase, a solução de filtrado enzimático, água destilada, guaiacol e peróxido de hidrogênio apresentou escurecimento maior em relação à solução de filtrado enzimático, água destilada e guaiacol, podendo ser percebida através da comparação de coloração na Figura 6; Figura 3 – Solução de filtrado enzimático e peróxido de hidrogênio. Figura 4 – Comparação do filtrado enzimático da maça, com a solução de filtrado enzimático e peróxido de hidrogênio. 12 . A peroxidase difere da catalase, pois precisa de um substrato específico para acelerar a reação de peróxido de hidrogênio, que forma um composto marrom escuro (NEVES [2], 2013), descrito na figura 7: Figura 6 – Comparação de soluções: seta vermelha: Solução de Filtrado enzimático, água, guaiacol e peróxido de hidrogênio. Seta reta: Solução de Filtrado enzimático, água destilada e guaiacol. Figura 7 – Esquema da reação do guaiacol e peróxido de hidrogênio, junto à enzima peroxidase. 13 2.4. Conclusão Observando à extração e caracterização das enzimas catalase e peroxidase ficou evidente que, elas são grandes catalisadores biológicos, ou seja, possuem a capacidade de aumentar a velocidade de uma reação, pois necessitam de menos energia que a reação não catalisada, assim como existem reagentes enzimáticos que desaceleram a atividade enzimática. Isso mostra que cada reação química depende do meio em que estar atuando para desenvolver ou não sua atividade. Portanto, é preciso observar os fatores que interferem na ação enzimática. Na prática usou-se um inibidor enzimático (biureto) que provocou uma desaceleração na ação da enzima e demonstrou as ligações peptídicas na mesma, e o guaiacol que auxiliou a peroxidase na decomposição da água. 2.5. Referências Bibliográficas FENNEMA, O.R. Química de lós Alimentos. 2ed. Zaragoza: Acribia S.A , 2000. FOGAÇA, J.R.V. Porque a água oxigenada faz espuma quando colocada em machucados. Disponível em: <http://http://alunosonline.uol.com.br/quimica/por-que-agua- oxigenada-faz-espuma-quando-colocada-machucado.html> Acesso em: 10 de abril de 2016. MOTTA, V.T. Bioquímica Básica. 2 edição. Ed. Medook. 2011. p. 68 -101. NEVES, VALDIR A. [1] web of Science – extração e caracterização de enzimas. Disponível em: <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.ht m>. Acesso em 10 de abril de 2016. NEVES, VALDIR A. [2] web of Science – extração e caracterização de enzimas. Disponível em: <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/enzimas.htm> Acesso em 10 de abril de 2016. REMIÃO, J.O.R.; SIQUEIRA, A.J.S.; AZEVEDO, A.M.P. Bioquímica: guia de aulas práticas. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2003. p. 214. RIEGEL, R. E. Bioquímica. 3. ed.São Leopoldo: Edunisinos, 2003. SILVA, N. C. C. Avaliação do processo de desalcolização de bebida obtida por fermentação controlada de suco de maçã. 2004, 107f. Tese (Doutorado em Processos Biotecnológicos Agroindustriais) - Universidade Federal do Paraná, Curitiba. VOET, D; VOET, J. G. Bioquímica. 3ª Ed. Artmed: Porto Alegre, 2006.
Compartilhar