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CONTROLE MICROBIOLÓGICO
1.Quais são as principais fontes de contaminação da água? OU De onde vem os microrganismos que contaminam os alimentos? Solo e água, planta, utensílios, trato intestinal do homem e do animal, manipuladores, ração animal, produtos dos animais, ar e pó.
 2. Quais são os grupos de risco? Crianças até dois anos, idosos, imunocomprometidos, imunodeprimidos, gestantes, feto, neonato e recém transplantados. 
3. Como são produzidas as aminas biogênicas? Deem exemplos OU O que são aminas biogênicas? As aminas biogênicas são produzidas através da descarboxilação dos aminoácidos produzidos por determinados microrganismos. Ex: cadaverina, putrescina, histamina, tiramina. As bactérias produtoras do ácido láctico (Lactobacillus, Enterococus) elas possuem um códon capaz de codificar a enzima descarboxilase, que promove a descarboxilação do aminoácido produzindo assim as aminas biogênicas. (Elas podem ser encontradas em queijo, vinho, sucos de fruta, cerveja, iogurte, leite)
4.Fenômeno do Networking Bacteriano ou quórum sense: É um mecanismo molecular do organismo que quando em determinado local exsuda algumas substâncias que influenciam ou produzem efeito na outra bactéria, inibindo ou estimulando o seu crescimento (é uma comunicação entre bactérias).
5.Qual é o principal grupo de microrganismo que causa doença de origem alimentar? Vírus. Sendo os principais: Norovíorus (Calicivírus, Norwalk), Rotavírus, Enterovírus, Hepatite A e Hepatite E.
6. Principal fonte de contaminação de vírus em alimentos: OU Principal forma de contaminação de vírus em alimentos OU por qual via o vírus alcança os alimentos? Via fecal-oral; manipuladores de alimento. 
7.De exemplos de membros da Família Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Salmonella, Protheus, Shigella,Klebsiella, Erwinia. 
8.Qual é um dos principais grupos deteriorantes dos alimentos tanto de origem animal quando vegetal? São gêneros e espécies da Família Enterobacteriaceae.
9.Quais grupos de bactérias são deteriorantes de produtos cárneos? Alguns membros da Família Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. Bactérias produtoras de ácido láctico e deteriorantes de produtos vegetais? Família Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp.
10.Qual o grupo de deteriorantes é benéfico aos vegetais? As bactérias produtoras de ácido láctico são ruins se passarem perto de produtos cárneos, mas não são consideradas deteriorantes para os vegetais uma vez que são responsáveis pela fermentação deles; sendo esta uma característica de interesse ou desejada em determinados produtos. 
11.Descreva os 5 gêneros de fungos e as suas respectivas micotoxinas Ou Relacione gênero e espécie com a micotoxina que o produz. Ácido bissoclâmico – Gênero Byssochlamys spp. ; Citrina e Patulina – Gênero Penecilium spp. ; Ocratoxina A – Gênero do fungo Aspergillus ochraceus; Aflatoxina – Aspergillus spp. ; Fumonisina e Zearalenona – Furasium spp. 
12.Defina bacteriocina – são substâncias produzidas por algumas bactérias que inibem o crescimento de outras bactérias. 
13.Quais os fatores que afetam o desenvolvimento microbiano? Descreva-os OU Descreva os fatores intrínsecos e extrínsecos. Fatores intrínsecos – relacionados com as características próprias do alimento. São eles: 
A) Atividade de água – mede a disponibilidade de água; é a quantidade de “água disponível” que se encontra em um alimento. Quanto maior a Aa, maior será o desenvolvimento bacteriano (deterioração); Quanto menor a Aa, menor será o desenvolvimento bacteriano. Efeitos na variação de Aa: crescimento bacteriano, deterioração química, deterioração da consistência. Redução da Aa no alimento: adição de sal e/ou açúcar, desidratação e congelamento. Quanto menor a Aa, maior será a vida de prateleira, maior a validade do produto; 
B) Potencial hidrogeniônico – acidez; inibe a multiplicação da grande maioria dos microrganismos; ph > 4,5 – baixa acidez; pH 4,0-4,5 – ácidos; pH < 4,0 – muito ácido (Classificação dos alimentos baseada no pH mínimo para a multiplicação e produção da toxina Clostridium botulinum
C) Potencial Oxirredução (Eh) – facilidade com que determinado substrato ganha ou perde elétrons. Perder elétrons = oxidar = Eh + = com oxigênio aeróbio, O2 como receptor final de elétrons; Ganhar elétrons = reduzir = Eh - = sem oxigênio anaeróbio = sem O2 como receptor final de elétrons (essa classificação é baseada na capacidade de utilizarem ou não o O2 como receptor final de elétrons no metabolismo respiratório); MO microaerofílicos: se multiplicam em uma quantidade reduzida de O2, são aeróbios (EX: lactobacilos, estreptococos); MO anaeróbios facultativos: crescem tanto em condições de anaerobiose quanto em aerobiose (EX: Família Enterobacteriaceae); MO aeróbio: Eh +, presença de O2 (EX: Pseudomonas, Bacillus cereus); MO anaeróbio: valor reduzido de Eh, ausência de O2 (EX: Clostridium botulinum, Clostridium perfringes) 
D) Composição química – quanto maior/menor a concentração de micro e macronutrientes no alimento, maior/menor vai ser o crescimento bacteriano; A multiplicação bacteriana necessita de: água, fonte de energia, fonte de nitrogênio, vitamina B e sais minerais (quanto mais completo nutricionalmente o alimento, melhor para a multiplicação de MO; 
E) Fatores antimicrobianos naturais - substâncias naturalmente ou intencionalmente presentes nos alimentos, com a capacidade de impedir ou retardar a multiplicação microbiana (Ex: condimentos – óleos essenciais: eugenol – canela, alicina – alho, timol e isotimol – orégano); 
F) Interações entre microrganismos – produção de metabóltios por um microrganismo que podem afetar a capacidade de sobrevivência e multiplicação de outros microrganismos.
Fatores extrínsecos – são relacionados com o ambiente em que o alimento se encontra. São eles:
A) Temperatura ambiental – a temperatura é o fator ambiental mais importante no crescimento microbiano; eles podem se multiplicar em uma grande faixa de temperatura (psicrófilos 0-20ºC; mesófilos 5-50ºC; termófilos 35-90ºC); 
B) Umidade relativa do ambiente - alimentos conservados com umidade relativa maior que a Aa, tendem a absorver umidade do ambiente e assim aumenta a sua Aa; Quando a umidade relativa é menor que a Aa do alimento, tendem a perder água e assim diminui a Aa; 
C) Composição gasosa do ambiente - atmosfera modificada, determina os tipos de microrganismos que poderão predominar (MO aeróbios – multiplicam na presença de O2; MO anaeróbios – multiplicam na ausência de O2) 
14.Qual a importância desses fatores? Aumentar/prever a vida de prateleira, estabilidade microbiológica, conhecer a capacidade de crescimento e/ou produção de toxinas por microrganismos patogênicos. 
15. Quais são as técnicas utilizadas em placas? OU Descreva os métodos de Spread Plate, Pour Plate, Streak Plate: 
Spread Plate – espalhamento ou técnica de superfície: colocar uma alíquota contendo a bactéria na placa de Petri, em seguida, espalhar com a alça de Drigalski ou alça bacteriológica;
Pour Plate – sobrecamada: colocar uma alíquota contendo a bactéria ou do microrganismo na placa, e em seguida, colocar um Agar por cima do meio de cultura, depois fazer os movimentos para homogeneização (movimento em forma de 8 para a direita e depois para a esquerda 8 vezes). Quando a UFC crescer, será na superfície e no meio de cultura. Também chamado de sobrecamada pois envolve um meio sólido + microrganismo + meio sólido. As bactérias que crescem bem, são as produtoras de ácido láctico (microaerofílicos – exige baixas concentrações de O2).
Streak Plate – riscar: semeia-se ou risca-se com alça bacteriológica com a intenção de separar uma colônia da outra para ver se irá crescer um único tipo de bactéria; se crescer um tipo de coloração diferente, significa que houve contaminação, ou seja, é uma técnica para verificar o grau de pureza. 
16. Os ovos devem ser lavados? OU Deve-se lavar os ovos? Os ovos não devem ser lavados; 1º porque os ovos vendidos que apresentam o selo SIF, já foram higienizados na indústria e 2º como o ovo tem uma cascaporosa, caso tenha algum tipo de contaminação na casca a lavagem contribuirá para internalização dos microrganismos. 
17. Descreva o método de Kirby e Bauer ou de difusão de disco (teste de sensibilidade antimicrobiana -> antibiograma) OU cite um método de sensibilidade antimicrobiana
Técnica destinada à determinação da sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos, também conhecido por Teste de Sensibilidade Antimicrobiana (TSA). Devem-se sempre utilizar culturas de bactérias puras, ou seja, de acordo com a tabela CLSI, deve-se usar cepas ATCC; se não for ATCC, o método está errado. 
Procedimento: 
- Retirar as placas e os frascos com os discos da geladeira cerca de 20-30 minutos para que adquiram a temperatura ambiente antes da execução da prova. 
A) Com uma alça bacteriológica em platina devidamente flambada e resfriada, tocar na colônia recente (18-24 horas). Deve-se pegar de 1 a 3 colônias (é o suficiente)
B) Suspender as colônias em solução salina estéril (NaCl 0,85%) e agitar até se obter uma turvação compatível com o grau 0,5 da escala Mac Farland (1,5x10 elevado a 8 UFC/mL). 
Para este passo deve ser utilizado um tubo aferido na escala 0,5 de Mac Farland como comparativo ou um turbidímetro, Pode-se comprar ou fazer no laboratório com as substâncias químicas necessárias. Se a solução salina estiver mais turva que a escala 0,5 Mac Farland é só diluir acrescentando mais um pouco de solução salina. Já se a solução salina não estiver turva como a escala 0,5 Mac Farland é só acrescentar mais uma colônia de bactérias. 
C) Embeber um swab estéril na suspensão bacteriana, comprimindo-o contra as paredes do tubo para tirar o excesso da suspensão, e semear em seguida de forma suave em todas as direções (5 diluições/3 direções no mínimo) na placa de Petri, contendo Agar Muller Hinton, procurando abranger toda a superfície, para que tenha toda bactéria na placa. 
D) Aguardar (não mais que 15 minutos) a superfície do Agar Muller Hinton secar (tudo tem que estar homogeneizado)
E) Com o auxílio de uma pinça flambada e resfriada, colocar os monodiscos ou multidiscos, sobre a superfície de meio inoculado, exercendo uma leve pressão com a ponta da pinça para uma boa adesão dos discos. Devem-se flambar cada disco para não contaminar os antibióticos. (existe uma disposição padrão dos discos na placa – 90mm – cabem 7 discos na placa, tendo uma disposição de 1cm entre os discos. 
F) Incubar a placa com os discos em estufa bacteriológica a 35ºC +/- 2ºC por 18-24 horas
Resultado:
Com o auxílio de uma régua, paquímetro ou dispositivo semelhante, medir o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco, e consultar uma tabela apropriada (CLSI) para determinar se a bactéria em análise é sensível, intermediária ou resistente ao antimicrobiano testado. 
Quanto ao crescimento do halo: Quanto maior o crescimento próximo do disco = Resistente (menor o halo) e Quanto maior o crescimento longe do disco = Sensível (maior o halo) 
Quanto menor o halo, menos sensível e mais resistente
Quanto maior o halo, mais sensível e menos resistente
18. Temperaturas da rdc216/2004: 
O tratamento térmico deve garantir que todas as partes do alimento atinjam a temperatura de, no mínimo 70ºC; 
Os óleos e as gorduras utilizados devem ser aquecidos a temperaturas não superiores a 180ºC; 
O descongelamento deve ser efetuado em condições de refrigeração a temperatura inferior a 5ºC ou em forno micro-ondas quando o alimento for submetido imediatamente a cocção; 
Para a conservação à quente, os alimentos devem ser submetidos a temperatura superior a 60ºC por no mínimo 6 horas; 
A temperatura do alimento preparado deve ser reduzido de 60ºC a 10ºC em 2 horas. Em seguida o mesmo deve ser conservado sob refrigeração a temperatura inferior a 5ºC, ou congelado a temperatura igual ou inferior a -18ºC;
O prazo máximo de consumo do alimento preparado e conservado sob refrigeração a temperatura de 4ºC, ou inferior, deve ser de 5 dias. Quando forem utilizadas temperaturas superiores a 4ºC e inferiores a 5ºC, o prazo deve ser reduzido de forma a garantir as condições higiênico sanitárias do alimento preparado.
19. RDC12/2001: o plano amostragem determina o número e o tamanho de unidade de amostras a serem analisadas.
m – limite que, em um plano de 3 classes, separa o produto ou lote aceitável do produto de qualidade intermediária aceitável; 
M – limite que, em um plano de 2 classes separa o produto do lote aceitável do inaceitável. Em um plano de 3 classes, o M separa o lote com qualidade intermediária aceitável do lote aceitável – valores acima de M são inaceitáveis; 
n – unidades amostrais do produto ou lote do alimento (representativa n=5 ou indicativa n=1);
c – número de unidades amostrais do produto ou lote que está na qualidade intermediária aceitável. MO ausentes: Salmonella e Listeria monocytogenes.
Amostra indicativa: amostra composta por um número de unidades amostrais inferior ao estabelecido pela norma ou legislação. 
Amostra representativa: é a amostra constituída por determinado número de unidades amostrais. 
Unidade amostral: porção ou embalagem individual que analisará ou amostra que será coletada para análise. 
20. DTA: tudo que pode causar um agravo à saúde individual ou coletiva que pode ser causado por um perigo físico, químico e/ou biológico, que está presente em alimento ou água (potabilidade da água – ausência de E.coli/100mL). 
Infecção: ingestão do microrganismo patogênico que no interior do organismo mais especificamente no TGI irá penetrar na célula e infectar; 
Intoxicação – ingestão do alimento contendo a toxina; 
Toxinfecção – ingestão do alimento contendo microrganismo só que o MO no TGI ao invés de infectar ou entrar na célula, produz uma toxina. 
21. POP de higienização de mãos: 
1. Abra a torneira e molhe as mãos, evitando encostar na pia; 
2. Aplique na palma da mão a quantidade de sabonete líquido suficiente para cobrir todas as superfícies das mãos;
3. Ensaboe as palmas das mãos friccionando-as entre si; 
4. Esfregue a palma da mão direita contra o dorso da mão esquerda (e vice versa) entrelaçando os dedos;
5. Entrelace os dedos e friccione os espaços interdigitais;
6. Esfregue o dorso dos dedos de uma mão com a palma da mão oposta (e vice versa), segurando os dedos, com movimento de vai-e-vem; 
7. Esfregue o polegar direito com o auxílio da mão esquerda (e vice versa) utilizando movimento circular; 
8. Friccione as polpas digitais e unhas da mão esquerda contra a palma da mão direita, fechada em concha (e vice versa) fazendo movimento circular; 
9. Esfregue o punho esquerdo, com o auxílio da palma da mão direita (e vice versa), utilizando movimento circular; 
10. Enxague as mãos, retirando os resíduos de sabonete. Evite contato direto das mãos ensaboadas com a torneira; 
11. Seque as mãos com o papel toalha descartável, iniciando pelas mãos e seguindo pelos punhos. 
22. Análise de risco: (avaliação de risco – processo fundamentado em conhecimentos científicos, envolvendo fases: identificação de perigo, caracterização de perigo, avaliação de exposição, caracterização do risco; gerenciamento de risco; comunicação do risco). 
Identificação do perigo – identificar agentes químicos, físicos e biológicos que podem causar efeitos adversos à saúde e que podem estar presentes em determinado alimento; 
Caracterização do perigo – avaliação qualitativa e/ou quantitativa da natureza dos efeitos adversos à saúde associados com agentes biológicos, físico químicos que podem estar presentes nos alimentos;
Avaliação da exposição – avaliação quantitativa e/ou qualitativa da ingestão provável dos agentes químicos, físicos e biológicos nos alimentos; 
Caracterização do risco: estimativa qualitativa e/ou quantitativa incluídas as incertezas inerentes, da probabilidade de ocorrência de um efeito adverso, conhecido ou potencial e de sua gravidade para saúde de uma determinada população com base na identificação do perigo, sua caracterização e a avaliação da exposição.Gerenciamento de risco: processos de ponderação das distintas opções normativas à luz dos resultados da avaliação de risco e, caso necessário, da seleção e aplicação de possíveis medidas de controle apropriadas, incluídas da medias de regulamentação; 
Comunicação do risco: intercâmbio interativo de informações e opiniões sobre risco entre as pessoas responsáveis pela avaliação de risco, pelo gerenciamento de risco, os consumidores e outras partes interessadas. 
23. Teste imunocromatográfico: Descreva o teste imunocromatográfico e o que ocorre no interior da fita (Elisa sanduíche): Imunocromatográfico:: Fita (com anticorpo) coloca na solução com a amostra, deixa por 10 minutos e se aparecer 1 listra = negativo e se aparecer 2 listras = positivo. Elisa:: a nível microscópico ocorre o Elisa, para isso deve-se comprar o kit para identificação do microrganismo desejado; em seguida pegar uma plaquinha e pegar a primeira solução que contenha o anticorpo do MO que se deseja detectar; o anticorpo tem a capacidade de se fixar no poço, assim coloca-se os anticorpos, espera alguns minutos, e lava para em seguida retirar a água ou excesso no tanque; depois temos que pegar o alimento e triturar para quebrar a membrana da bactéria (detergente ou blender); em seguida pegar uma alíquota da amostra que se deseja utilizar e colocar no poço, se tiver o microrganismo alvo significa que o antígeno da bactéria está presente e assim esse antígeno vai se ligar o anticorpo; no kit vem um anticorpo marcado (enzima) que fica com cor diferente, que vai se ligar ao antígeno, formando o complexo anticorpo-antigeno-anticorpo marcado. 
24. Extração de DNA: 
1ºpasso: quebra da parede ou membrana alvo da extração e para isso utiliza-se método físico (nitrogênio líquido ou de bolas de aço para promover a quebra da parede) e o químico (uso de detergentes SDS e CTAB). 
2º passo: estabilização do DNA liberado após a quebra da membrana e é necessário levar em consideração que a célula tem um mecanismo molecular capaz de promover a degradação do DNA: as enzimas nucleases. Para isso não acontecer acrecenta-se Ca, Mg e EDTA que ajuda a estabilizar o DNA pela neutralização do seu ph. Adiciona-se NaCl para remover as histonas, neutralizar a carga negativa do DNA e facilitar a precipitação em álcool. Para verificar a pureza devemos fazer primeiro a leitura da densidade ótica a 260nm com o espectrofotômetro, depois tirar a cubeta, jogar o conteúdo fora e lavar, depois colocar o branco de novo e analisar a concentração do DNA a 280nm e o resultado do cálculo tem que dar em torno de 1,8 para atestar pureza. Concentração de absorbância – 260 nm e de pureza = 280nm. 1 densidade ótica – 50 microgramas/mL de solução. 
25. PCR: Mix de PCR: DNA molde+ Taq polimerase+ 1 par de primers+ tampão+ nucleotídeos+ água destilada+ cloreto de magnésio. 1º passo: desnaturar (acima de 90C) desnatura o DNA; 2º passo: anelamento dos primers (entre 30-70ºC); 3º passo: extensão (72ºC temperatura ótima para a enzima taq polimerase atuar), adiciona nucleotídeos as 2 fitas de DNA. A DNA polimerase reconhece o primer para sintetizar. 
Diferença de PCR quantitativo para PCR qualitativo: PCR qualitativa só indica presença ou ausência e utiliza gel de agarose. Já a PCR quantitativa indica presença, ausência e também quantidade e não usa gel de agarose e sim uma sonda PROBE (fica entre as fitas de DNA e quando a DNA polimerase passa, emite fluorescência).
Descreva PCR qualitativa: 1º: fazer o PCR no termociclador; 2º: depois é preparado o gel de agarose e quando solidificado é colocado na cama; 3º: depois retira-se o pente, obtendo-se os poços onde serão colocadas as amostras; 4º: a amostra é colocada juntamente com azul de bromofenol e açúcar; 5º: depois se coloca a cama com o gel na cuba e cobre-se com tampão, tampa a cuba e aplica uma voltagem, que faz com que a amostra corra formando bandas; 6º: depois de corrida da amostra, retira-se o gel e cora em Brometo de etídeo, então se tira uma foto (esse corante tem afinidade pelo DNA e fluoresce quando em contato com UV, e isso possibilita a visualização das bandas, sendo essas bandas comparadas com um padrão molecular).
Descreva PCR quantitativa: sabe se tem banda ou não e quanto tem, não usa gel de agarose, o mix é igual, adiciona-se a sonda PROBE em uma das fitas de DNA e no 2º passo se anela aos primers e a sonda. E na extensão a taq polimease quebra a sonda anelada para colocar nucleotídeos e após a quebra há fluorescência. 
26. Gel de agarose: Descreva a corrida eletroforética de DNA em gel de agarose. O gel de agarose para DNa é para separar fragmentos de DNA. 
Na corrida eletroforética como o DNA é carregado negativamente, colocamos na corrida eletroforética o DNA no polo negativo para que ele possa correr, assim no momento que passarmos a voltagem a tendência dele será correr para o lado positivo. 
Para esta corrida preparamos o gel de agarose com o tampão TAE ou TBE. Gel 1% agarose -1g/mL colocar no micro-ondas, espera esfriar e utiliza no processo. Colocamos corante para corar o DNA que vai ser colocado no gel que é o brometo de etídeo, além de açúcar para dar peso e fzer o DNa ficar mais denso e cair no poço, isso será visualizado quando incidirmos a luz ultravioleta. 
Quanto mais agarose colocarmos no gel, mais duro ele fica e mais lentamente o DNA vai passar, e quanto menos diluído a agorase mais mole fica e mais rápido o DNA vai passar. Quanto maior o fragmento de DNA mais devagar ele correr e quanto menos mais rápido, por isso o ideal é um gel menos concentrado para um fragmento maior e mais concentrado para um fragmento menor. 
Depois que se prepara o gel e solidificar, coloca-se na cama, depois faz-se os poços com o pente no gel e em seguida colocar a cama na cuba com a região dos poços voltada para o lado negativo para colocar as amostras contendo DNA. O lado positivo tem uma coloração vermelha e o lado negativo tem uma coloração preta. 
Utilizaremos uma cuba onde colocaremos a cama com o gel de agarose e uma doente de onde obteremos a voltagem. E aplicaremos as amostra de DNA com auxílio da micropipeta no poço feito com um pente no gel de agarose no lado negativo, pois quando ligarmos a corrente eletroforética todos os fragmentos de DNA vao atravessar o gel de agarose. 
Quanto mais quebrado o DNA terá fragmentos menores e mais distante do poço presente exclusivamente no lado negativo, e quanto menos quebrado ele fica mais próximo do lado oposto. Para se ter uma noção do tamanho do fragmento de DNA usa-se o padrão de peso molecular conhecido que bandas com diferentes tamanhos de DNA (de 100 a 50 pares de base).