Aulas 9 e 10 - Cromatografia

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CROMATOGRAFIA
INTRODUÇÃO:
A cromatografia envolve uma série de processos de separação de misturas, acontece pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciado por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade. 
A cromatografia pode ser utilizada
para a identificação de compostos, por
comparação com padrões previamente
existentes, para a purificação de
compostos, separando-se as substâncias
indesejáveis e para a separação
dos componentes de uma mistura.
As diferentes formas de cromatografia
podem ser classificadas considerando-
se diversos critérios:
1. Classificação pela forma física do
sistema cromatográfico
2. Classificação pela fase móvel
empregada
3. Classificação pela fase
estacionária utilizada
4. Classificação pelo modo de
separação
1. Classificação pela forma física do
sistema cromatográfico
Em relação à forma física do sistema,
a cromatografia pode ser subdividida
em cromatografia em coluna e
cromatografia planar.
EM COLUNA: cromatografia líquida, gasosa e supercrítica.
PLANAR: Centrífuga, em papel e camada delgada.
2. Classificação pela fase móvel
empregada
São de 3 tipos: a cromatografia gasosa, 
a cromatografia líquida e a cromatografia 
supercrítica (CSC). A cromatografia líquida 
apresenta uma importante subdivisão: a 
cromatografia líquida clássica (CLC) e a 
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). No 
caso de fases móveis gasosas, separações podem 
ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por 
cromatografia gasosa de alta 
resolução (CGAR). 
3. Classificação pela fase
estacionária utilizada
Quanto à fase estacionária, distingue- se entre 
fases estacionárias sólidas, líquidas e 
quimicamente ligadas. No caso da fase 
estacionária ser constituída por um líquido, este 
pode estar simplesmente adsorvido sobre um 
suporte sólido ou imobilizado sobre ele. 
Suportes modificados são considerados 
separadamente, como fases quimicamente 
ligadas, por normalmente diferirem dos outros 
dois em seus mecanismos de separação.
4. Classificação pelo modo de
separação
Separações cromatográficas se devem à
 adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou 
misturas desses mecanismos.
CROMATOGRAFIA
PLANAR
COLUNA
CENTRÍFUGA
CCD
CP
CSC
GASOSA
LÍQUIDA
CLÁSSICA
CLAE
CG
CGAR
Cromatografia planar
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica
 de partição líquido–líquido. Baseia-se na 
diferença de solubilidade das substâncias em 
questão entre duas fases imiscíveis, sendo 
geralmente a água um dos líquidos. Este método 
é muito útil para a separação de compostos 
polares, sendo largamente usado em bioquímica.
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma 
técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a 
separação se dá pela diferença de afinidade dos 
componentes de uma mistura pela fase estacionária.
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–sólido. 
A separação dos componentes da mistura ocorre em função da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (líquido ou misturas de líquidos).
O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD É A razão entre a distânc i a p e r c o r r i d a p e l a substância e a distância percorrida pela fase móvel
Cromatografia em coluna
A cromatografia líquida clássica é muito
 utilizada para isolamento de produtos naturais 
e purificação de produtos de reações químicas. 
As fases estacionárias mais utilizadas são sílica 
e alumina, entretanto estes adsorventes podem 
servir simplesmente como suporte para uma 
fase estacionária líquida. Fases estacionárias 
sólidas levam à separação por adsorção e fases 
estacionárias líquidas por partição.
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
A cromatografia em coluna é uma técnica usada para a separação de muitos compostos orgânicos. Essa técnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas
F#5
F#6
Frações provenientes do Fracionamento por Coluna Clássica resultantes analisadas em CCD
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
(CLAE) 
HPLC- HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPH
Fase móvel : solução, solventes (solução tamponada, metanol, acetonitrila)
Fase estacionária: coluna cromatográfica
- Substâncias que podem ser analisadas por HPLC:
Fitocomplexos, antibióticos, diuréticos, fármacos, drogas de abuso, proteínas, a.a., tensoativos, etc..
Ao contrário do GC podem ser analisadas substâncias não voláteis ou termicamente instáveis.
ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE HPLC 
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1) Válvula de injeção de amostra 
-injeção manual (loop)
-injeção automática (amostrador automático)
2) Bombas de pressão:
100 a 500atm - permite velocidade de fluxo razoável para o empacotamento de partículas de 3 a 10m. As vazões normalmente empregadas em HPLC vão de 0,005 até no máximo 4 a 5ml/min.
Injetor
3) Fase móvel: 
A fase móvel deve ser desgaseificada para remover gases dissolvidos que poderiam causar interferências. Utiliza-se ultra-som e bombas de vácuo. Também deve ser filtrada para evitar entupimento da coluna cromatográfica. 
Podem ser utilizados dois tipos de eluição:
-isocrática: quando se mantém a composição da fase móvel constante durante toda a análise cromatográfica.
-programação de gradiente: quando altera-se a composição da fase móvel durante a execução da análise. Utiliza-se dois ou mais solventes com polaridades diferentes
4) Coluna cromatográfica: 
- Fase normal:
Fase estacionária polar (ex. trietilenoglicol)
Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da Fase móvel, o tempo de eluição diminui.
-Fase reversa
Fase estacionária apolar (Ex. hidrocarbonetos, sílica de fase reversa C18)
Fase móvel relativamente polar (água, metanol, acetonitrila)
O componente mais polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da fase móvel, o tempo de eluição aumenta.
Obs. A maioria das separações por HPLC são de fase reversa com empacotamentos ligados de C8 ou C18 siloxanos.
Coluna
5) Detectores: 
A) Detectores UV/Vis
B) Detectores de fluorescência
C) Detectores por índice de refração
D) Detectores eletroquímicos
INSTRUMENTAÇÃO BÁSICA DA CLAE
O detector mais utilizado para separações por 
CLAE é o detector de ultravioleta (Absorção da
 luz na faixa UV – visível)
EB
MIS 6:1
*
Cromatografia Gasosa
Técnica de separação e análise de misturas por 
interação dos seus componentes entre uma fase 
estacionária e uma fase móvel.
CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA 
GC - GAS CHROMATOGRAPHY
Fase móvel : gás de arraste (hélio, hidrogênio, nitrogênio)
Fase estacionária: coluna cromatográfica
- Substâncias que podem ser analisadas por GC:
gases, substâncias voláteis e termicamente estáveis.
Exemplos: etanol, metanol, cocaína, tolueno, benzeno, anfetaminas, praguicidas, óleos essencias
ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE GC 
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Fonte de gás de arraste em um cilindro de alta pressão - 
A escolha do gás de arraste (fase móvel) depende de certos fatores como preço, disponibilidade, pureza e tipo de detector utilizado. 
Gás inerte. 
Associado a fonte de gás estão os reguladores de pressão e os medidores de vazão que permitem controlar e monitorar o escoamento do gás de arraste: a eficiência da técnica varia com a vazão do gás (fluxo).
2) Sistema de injeção de amostra
A amostra líquida é introduzida com a ajuda de uma microseringa de vidro. 
A agulha penetra uma borracha de silicone que é um septo auto-selante. 
A utilização da seringa, de modo ideal, permite uma reprodutibilidade da técnica. 
A temperatura do injetor deve ser tal que o líquido amostral seja rapidamente vaporizado sem haver decomposição térmica (próximo ao ponto de ebulição do componente menos volátil).Temperaturas comuns de análise são da ordem de 200-300C.
3) Coluna: A separação efetiva dos componentes da amostra é realizada na coluna cromatográfica onde o tipo e a quantidade da fase estacionária são fatores importantes para se ter a eficiência desejada.
gás
gás
Coluna cromatográfica
gás
DETECTOR
*
3) Coluna: De acordo com a natureza da fase estacionária, é possível dividir-se a cromatografia em fase gasosa em:
A) Cromatografia gás-líquido (CGL) ou partição: a fase estacionária é uma película delgada líquida não-volátil a qual recobre um sólido inerte denominado suporte. A base para a separação cromatográfica é a distribuição da amostra dentro e fora desta película, ou seja, a partição da amostra entre a fase móvel e a fase estacionária líquida.
B) Cromatografia gás-sólido (CGS) ou adsorção: a fase estacionária é um sólido de grande área superficial, usualmente um adsorvente como carvão vegetal, sílica-gel ou peneira molecular. Empregado na separação de gases como nitrogênio, oxigênio, monóxido de carbono, etc.
3) Coluna:
	Tipos de coluna:
- Empacotada
- Capilar
Em colunas capilares temos uma maior eficiência, uma melhor resolução cromatográfica e um tempo de análise menor.
3) Coluna:
Eficiência da coluna pode ser calculada pelo número de pratos teóricos (N):
N = 16 (TR / Wb)2 = 5,545 (TR / Wh) 2
Um prato teórico é definido como sendo um equilíbrio de distribuição do soluto entre as duas fases; quanto maior o valor de N, mais equilíbrios existirão e a separação será maximizada. 
TR = tempo de retenção
Wb = largura da base do pico
Wh = largura a meia altura do pico
3) Coluna: 
	Resolução:
		A Resolução (R) é uma medida quantitativa da separação de dois picos consecutivos, sendo determinada por dois fatores: TR e Wb.
R = 2 TR / Wb1 + Wb2
3) Coluna: 
	Resolução:
		
4) Forno: 
-Temperatura
	-Análise isotérmica: quando a análise em cromatografia em fase gasosa é realizada com forco mantido à temperatura constante desde o início até o final.
	-Temperatura programada: a temperatura muda durante o decorrer da análise	
A) Balístico B) Linear C) Multilinear
4) Forno: 
4) Forno: 
5) Detectores:
Detector de Ionização de Chama (FID)
Detecta substâncias ionizáveis em chama (hidrocarbonetos)
B) Detector de Condutividade Térmica (TCD)
Todos os compostos. Simples, baixo custo e boa estabilidade
C) Detector de Nitrogênio-Fósforo (NPD)
Excelente para composto que contém N ou P em sua composição. 
D) Detector de Captura de Elétrons (ECD) 
Dispendioso e de estabilidade regular, dispendioso, altamente seletivo
Obs: Em geral utiliza-se temperaturas mais elevadas no detector do que no forno, para evitar condensação de substâncias no detector (contaminação). 
6) Registradores (sistemas de dados)
Impressora (integrador)
-fácil de operar
-preço moderado
Computador (workstation)
-mais caro
-mais flexível, poderoso.
ANÁLISE QUALITATIVA 
 	A identificação de substâncias por cromatografia em fase gasosa se dá através do tempo de retenção (TR) da substância na coluna cromatográfica comparada com padrões.
Injeção de padrão
Injeção de amostra
ANÁLISE QUANTITATIVA 
 	A quantidade de analito (substância) é proporcional à área ou a altura do pico correspondente.
1 ng de substância
2 ng de substância
ANÁLISE QUANTITATIVA 
 	Para se calcular a concentração de uma substância em uma amostra é necessário se fazer uma curva de calibração.
Duas formas:
A) Método do padrão externo
B) Método do padrão interno
ANÁLISE QUANTITATIVA 
 	A) Padrão externo
		Faz-se uma curva com várias concentrações do analito. A seguir injeta-se o extrato da amostra cuja concentração se quer determinar e lança-se no gráfico as áreas obtidas dos picos contra as concentrações dos adicionados.
ANÁLISE QUANTITATIVA 
 	B) Padrão Interno (PI)
		O padrão interno (PI) é um composto que se adiciona à amostra, antes de qualquer manipulação (extração) de forma que não interfira com a análise. O PI tem a função de corrigir possíveis imprecisões durante a manipulação da amostra (fase de extração, injeção da amostra) ou mesmo variações no equipamento de GC.
		O PI também tem a função de monitorar possíveis erros de operação ou procedimentos durante a análise.
		O PI deve ter preferencialmente as seguintes características:
a) nunca ser encontrado na amostra;
b) ser disponível em elevado grau de pureza;
c) ser bem resolvido dos outros picos;
d) ser estruturalmente semelhante ao analito, ou possuir os mesmos grupos químicos do analito.
ANÁLISE QUANTITATIVA 
 	B) Padrão Interno (PI)
Exemplos:
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2
Cocaína
Isopropilbenzoilecgonina (PI)
Propanol (PI)
Etanol
CARACTERÍSTICAS DAS DUAS TÉCNICAS (GC E HPLC) 
-Eficiente, altamente seletivo, largamente aplicável,
-Quando utilizado PI, análises bastante precisas,
-Boa sensibilidade,
-Necessitam de procedimentos de extração da amostra,
-Necessitam de equipamentos específicos e profissionais treinados para operá-los.
-Possibilidade de se detectar várias substâncias em uma mesma análise,
-Há possibilidade de interferentes.
Aplicações práticas da Cromatografia Gasosa:
Química:
Determinação de antioxidantes, nutrientes ou contaminantes em alimentos.
Indústria:
Monotorização de processos industriais.
Saúde:
Análises dos constituintes do sangue.
Análise forense.
Ambiente:
Determinação de resíduos de pesticidas em produtos alimentares, águas ou esgotos.
Determinação de gases e solventes orgânicos na atmosfera, solos ou rios.
A cromatografia gasosa é uma das 
técnicas analíticas mais utilizadas. Além 
de possuir um alto poder de resolução, é 
muito atrativa devido à possibilidade de 
detecção em escala de nano a picogramas.
A diferença entre CG e CGAR está na 
coluna (tubos longos de metais como aço 
ou cobre, vidro ou teflon). Colunas de 
CGAR são maiores em comprimento, 
menores em diâmetro, possuem a fase 
líquida como um filme aplicado diretamente 
às paredes do tubo da coluna e são mais 
eficientes.
Referências Bibliográficas
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos cromatográficos. 5ª ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993.
LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Performance liquid chromatography: fundamental principles and practice. Blackie Academic and Professional, 1995. 
CHAVES, M.H.; Análise de extratos de plantas por CCD: uma metodologia aplicada à disciplina “Química Orgânica”. Química Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562, 1997.
ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M. e BRANDÃO, A.M. Determinação de cafeína em bebidas através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Química Nova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995.
NETO, F.R.A.; CGAR em análise de resíduos. Química Nova, v. 18, n. 1, p.65-67, 1995.
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