BIOTECNOLOGIA GENÉTICA APLICADA à PISCICULTURA

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ÍNDICE 
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................2 
2. MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA EM PEIXES...............................................2 
2.1 Triplóides Puros e Híbridos ...........................................................................3 
2.2 Haplóides e Tetraplóides ...............................................................................8 
2.3 Ginogenéticos................................................................................................9 
2.4 Androgenéticos............................................................................................12 
3. REVERSAO SEXUAL EM PEIXES...................................................................13 
3.1 Linhagens Revertidas Monossexuais ..........................................................13 
3.2 Produção de Supermachos .........................................................................16 
3.3 Produção de Superfêmeas ..........................................................................17 
4. MARCADORES MOLECULARES EM PROJETOS DE ICTIOGENÉTICA, ......18 
5. ENGENHARIA GENÉTICA EM PEIXES...........................................................20 
5.1 Produção de Transgênicos..........................................................................20 
5.2 Contribuição dos Transgênicos em Projetos de Piscicultura .......................22 
6. RISCOS BIOLOGICOS POTENCIAIS DE LINHAGENS DE PEIXES 
GENETICAMENTE MANIPULADOS ....................................................................23 
6.1 Riscos Potenciais de Linhagens Cromossomicamente Manipuladas..........23 
6.2 Riscos Potenciais de Linhagens Sexualmente Revertidas ..........................25 
6.3 Riscos Potenciais dos Transgênicos ...........................................................26 
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..................................................................27 
1. INTRODUÇÃO 
 
No decorrer da última década, a contribuição da genética para a piscicultura 
moderna tem abrangido o emprego das técnicas mais recentes usadas em biotecnologia 
e engenharia genética. Algumas dessas biotecnologias genéticas, como as que 
possibilitam a manipulação cromossômica, podem ser usadas também em plantas, porém 
não ainda em aves e mamíferos. Outras, como as que permitem a transferência de genes, 
vêm sendo aplicadas tanto em peixes e outros organismos, como em plantas. 
No presente trabalho são apresentadas e comentadas as principais 
biotecnologias genéticas atualmente aplicadas à piscicultura. Inicialmente é discutida a 
produção de peixes triplóides, tetraplóides, haplóides, ginogenéticos e androgenéticos. A 
seguir, são resenhados vários procedimentos para a obtenção de linhagens de 
neomachos, neofêmeas, supermachos e superfêmeas. Os principais objetivos teóricos 
dos tópicos 2 e 3 deste trabalho são a produção de linhagens de peixes estéreis, 
monossexuais e com altos níveis de consangüinidade. Sob o aspecto prático, as 
linhagens manipuladas cromossômica e hormonalmente podem ser usadas para evitar 
maturação precoce, para possibilitar a produção de peixes maiores, para a obtenção de 
exemplares que apresentem somente o sexo de maior valor comercial e para permitir o 
uso de peixes exóticos artificialmente estéreis no cultivo ou para introdução na natureza. 
As biotecnologias de manipulação cromossômica e reversão sexual precisam ser bem 
conhecidas e compreendidas por todos os que trabalham atualmente em piscicultura 
porque vêm sendo gradativamente incorporadas às rotinas dos programas desenvolvidos 
em nível mundial e, há alguns anos, começaram a ser experimentadas também em nosso 
país, A seguir, no item 4, são apresentados os principais tipos de marcadores 
moleculares, em nível de DNA, que vêm sendo usados em projetos de ictiogenética 
aplicada à piscicultura. 0 tópico 5 diz respeito à aplicação da engenharia genética à 
piscicultura e trata da transferência de genes entre diferentes organismos e peixes. Como 
a engenharia genética apresenta alto grau de sofisticação técnica, dificilmente deverá ser 
usada rotineiramente a curto prazo na área ictiológica, devendo, por mais uma década, se 
restringir apenas a algumas instituições de pesquisa e a grandes empresas agrícolas. 0 
último item do trabalho analisa os riscos bioecológicos potenciais de linhagens de peixes 
geneticamente manipuladas sobre populações selvagens e cultivadas. 
0 presente trabalho é baseado em grande parte na experiência adquirida com os 
projetos que vêm sendo, ou que foram, desenvolvidos em conjunto pelo Laboratório de 
Genética de Peixes do IB/USP (São Paulo), Laboratório de Biologia e Genética de Peixes 
do IB/UNESP (Botucatu) e pelo Centro de Pesquisas e Treinamento em Aqüicultura, 
CEPTA/IBAMA (Pirassununga), Centrais Elétricas de Minas Gerais, CEMIG (Volta 
Grande), Companhia Energética de São Paulo, CESP (Paraibuna), Instituto de Pesca de 
São Paulo (Campos do Jordão) e Projeto Pacu (Terenos), e pretende ser de utilidade no 
planejamento de projetos de biotecnologia genética aplicados à piscicultura, que venham 
a ser desenvolvidos em nosso país. A maioria dos resultados obtidos, até o momento, já 
foi resenhada e publicada. 1,2,3,5,9,10,12,24,25,26,27,28,29,30 
 
2. MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA EM PEIXES 
 
As técnicas de manipulação ou engenharia cromossômica podem ser aplicadas com 
relativa facilidade aos peixes, porque esse grupo de animais geralmente apresenta 
fecundação externa, o que favorece em muito o manuseio de seus gametas. Numerosas 
técnicas têm sido descritas na literatura para a produção de peixes haplóides, triplóides, 
tetraplóides, ou mesmo os que tenham só cromossomos maternos (ginogenéticos) ou só 
paternos (androgenéticos) (Tabela 1)7,20,22,23 
As tecnologias usadas para alterar o número cromossômico dos peixes pertencem a 
duas categorias principais: choques de temperatura ou térmicos e choques de pressão ou 
hiperbáricos. Os choques de temperatura geralmente são aplicados aos ovos logo após a 
fertilização (cerca de 5 - 10 minutos) e, por isso, são chamados de precoces. Os choques 
de pressão são aplicados aos ovos decorridos tempos maiores após a fertilização (cerca 
de 60 - 90 minutos) e, por isso, são chamados de tardios. A finalidade do choque precoce 
é a de atuar na meiose, bloqueando a eliminação do segundo corpúsculo polar do ovócito 
e o choque tardio, de interferir no início da mitose, impedindo a primeira clivagem do 
zigoto quando este vai se tornar um embrião com duas células. 
Na maioria das estações de piscicultura do mundo utilizase o choque térmico em vez 
do hiperbárico, porque a aparelhagem para manutenção de temperaturas constantes 
oferece maior segurança para os operadores e possibilita trabalhar com maiores volumes 
de ovos. Para os choques de pressão usam-se cilindros hidráulicos de aço inoxidável que 
são bastante caros, comportam volumes reduzidos de ovos, operam por vários minutos 
com altas pressões entre 7 e 10 mil psi (psi = libra por polegada quadrada), correndo, 
muitas vezes, riscos de rompimento, principalmente quando o ar dos cilindros não é 
devidamente removido, ou seja, quando não é feito um "sangramento" adequado. Embora 
se possa utilizar tanto choques térmicos quentes quanto frios, parece que os quentes 
produzem melhores resultados em espécies de peixes de águas frias e, ao contrário, os 
choques frios em espécies de águas quentes. Em geral, a temperatura que produz os 
melhores resultados é espécie-específica e se situa na proximidade de seu limiar letal. É 
bastante importante que no decorrer do tratamento térmico os ovos sejam mantidos numa 
temperatura uniforme sem flutuações; isso pode ser conseguido dispondo-se os ovos em 
poucas camadas em um recipiente de vidro que, por sua vez, é mergulhado num banho 
térmico com volume suficiente de água, de modo que a temperaturadesejada seja 
mantida constante. Portanto, o tipo, a intensidade e a duração do tratamento térmico são 
peculiares para cada espécie. 
Há várias técnicas que podem ser usadas para verificar o sucesso das manipulações 
cromossômicas, sendo que um dos métodos mais laboriosos é contar o número de 
cromossomos. Um segundo método é medir o tamanho dos núcleos dos eritrócitos; isto é 
feito corando-se esfregaços de sangue com Giemsa e medindo-se ao microscópio o eixo 
maior do núcleo dos eritrócitos. Um terceiro, é a medida do volume nuclear do eritrócito, 
rotineiramente realizado nas pisciculturas norteamericanas produtoras de carpas capim 
triplóides, com o auxílio do aparelho Coulter Counter Channelyzer, que é caro, porém 
bastante eficiente e rápido. Um quarto método consiste na determinação do conteúdo de 
DNA do núcleo dos eritrócitos por citofotometria de fluxo. Um quinto método utiliza a 
coloração pelo nitrato de prata de um esfregaço de sangue e contagem do número 
máximo de nucléolos existentes nos núcleos dos eritrócitos.' Uma sexta técnica é usar a 
eletroforese. 
 
2.1 Triplóides Puros e Híbridos 
 
A produção de triplóides é o tipo de manipulação cromossômica mais familiar na área 
de piscicultura. 0 interesse que os triplóides despertam se deve a duas características que 
potencialmente eles podem apresentar: maior crescimento que os diplóides e esterilidade 
(Tabela 1). 
Os dois tipos de triplóides mais usados em piscicultura são os puros e os híbridos. Os 
triplóides puros, também chamados de autotriplóides e triplóides intraespecíficos, são 
formados por três conjuntos haplóides de cromossomos provenientes de uma mesma 
espécie. Os triplóides híbridos, também designados como autotriplóides ou triplóides 
interespecíficos, são formados por dois lotes haplóides de cromossomos de uma 
determinada espécie e por um outro lote de outra espécie. 
Tabela 1 - Tipos de biotecnologias genéticas aplicadas à piscicultura 7.20,22,23 
 
Tipo de Biotecnologia Produtos Obtidos Aplicações em Piscicultura 
1. TRIPLOIDIA PURA Linhagens estéreis Controle da reprodução 
Linhagens com maior sobrevivência e 
crescimento 
2. TRIPLOIDIA HÍBRIDA Linhagens híbridas 
estéreis 
Controle da reprodução 
Linhagens com maior sobrevivência e 
crescimento e resistência a doenças. 
3. TETRAPLOIDIA Gametas diplóides Obtenção de linhagens triplóides 
interplóides 
4. HAPLOIDIA Linhagens haplóides Produção de ginogenéticas e/ou 
androgenéticas haplóides 
5. GINOGÊNESE Linhagens 
ginogenéticas 
Produção de linhagens monossexuais de 
fêmeas para casos de determinação do 
sexo tipo XX/XY 
Produção de linhagens altamente 
endocruzadas 
Identificação de sistemas de 
determinação do sexo 
6. ANDROGÊNESE Linhagens 
androgenéticas 
Produção de supermachos 
Produção de linhagens altamente 
endocruzadas 
Criopreservação do germoplasma 
7.REVERSÃO Linhagens de 
neomachos e 
neofêmeas 
Produção de linhagens revertidas 
Produção de supermachos e 
superfêmeas; 
Identificação de sistemas de 
determinação do sexo 
8.DNA RECOMBINANTE Linhagens 
transgênicas 
Linhagens com características vantajosas 
codificadas pelo DNA transplantado 
 
1) Produção de triplóides - Os triplóides são obtidos da seguinte maneira: logo 
após a fertilização comum, os ovos são submetidos a choque térmico ou hiperbárico 
(Tabela 2). Lembremos que, por ocasião da desova, os peixes do sexo feminino eliminam 
o que comumente se costuma chamar de "ovas" ou "óvulos", mas que na realidade são 
ovócitos de segunda ordem. Doravante, por motivo de simplificação, designaremos de 
"óvulos" aos ovócitos de segunda ordem, Estes "óvulos" eliminam o segundo corpúsculo 
polar somente após terem sido fertilizados. Porém, se um "óvulo" recém-fertilizado for 
submetido a um choque térmico ou hiperbárico, o segundo corpúsculo polar não será 
eliminado. Como conseqüência, o ovo resultante irá conter três núcleos haplóides: um 
que é o núcleo feminino do "óvulo", outro que é o núcleo masculino proveniente do 
espermatozóide, e um outro que é o núcleo do segundo corpúsculo polar. Os três núcleos 
haplóides se fundem para formar um zigoto triplóide que, por sua vez, produzirá um peixe 
triplóide. 
2) Como otimizara produção de triplóides- A maioria dos pesquisadores e 
piscicultores usa choques de temperatura ou de pressão. Os choques químicos são 
pouco usados, porque produzem um grande número de "mosaicos" (peixes que contêm 
células com vários graus de ploidia). Os choques térmicos são os mais usados em 
pisciculturas comerciais porque são os operacional mente mais fáceis de aplicação, mais 
baratos em termos de aparelhagem e produtos químicos usados e mais seguros. A 
temperatura exata e a duração do choque térmico que são necessários para a produção 
de triplóides devem ser estabelecidas inicialmente por tentativa e erro. As temperaturas 
quentes ou frias ótimas são aquelas situadas alguns graus acima ou abaixo das 
temperaturas letais inferiores ou superiores para uma determinada espécie. Logo, a 
primeira etapa para se otimizar a produção de triplóides seria a determinação dos limiares 
letais para as temperaturas quentes e frias. 0 tempo exato em que o choque deve 
começar e terminar depende do tempo após a fertilização, no decorrer do qual o segundo 
corpúsculo polar é eliminado. 0 choque deve começar antes do evento da eliminação e 
continuar por tempo suficiente ate que seja improvável a extrusão do segundo corpúsculo 
polar. Por exemplo, em ensaios realizados no Brasil para a produção de triplóides puros 
de carpa comum, cerca de 10 minutos após a fertilização, os ovos foram tratados a O°C ± 
0,2 durante 30 minutos, resultando na produção de 94,7% de triplóides 12 . Estes valores 
usados para a produção de triplóides já foram otimizados para algumas espécies usadas 
na piscicultura brasileira (Tabela 2)3,12,23. 
 
Tabela 2 -Valores otimizados para indução de triploidia por choques térmicos em 
algumas espécies usadas na piscicultura brasileira 
 
Espécie Início do 
choque 
(minutos) 
Temperatura 
do choque 
(ºC) 
Duração do 
choque 
(minutos) 
Freqüência 
de triplóides 
(%) 
Taxa de 
eclosão 
(%) 
Bagre africano 4 5 40 8-100 9-40 
Bagre do canal 5 5 60 100 79 
Carpa capim 4 42 1 67 72 
Carpa comum 10 0-0,2 30 95 52 
Tambaqui 2 39 3 12 82 
Tilápia do Nilo 7 9 30 100 86 
Truta arco-iris 25 26 20 100 87 
 
Certos especialistas acreditam que as espécies de peixes que historicamente 
vivem em águas frias (por exemplo, truta arco-íris e outros salmonídeos) respondem 
melhor a choques térmicos quentes moderados (entre 26ºC e 29ºC), e, ao contrário, em 
espécies provenientes de águas quentes (tais como as carpas comum e chinesas, bagres 
do canal e africano e a maioria das espécies neotropicais), os choques frios fortes (abaixo 
de 4ºC) ou moderados (entre 5ºC e 15ºC) parecem ser mais efetivos na indução de 
triploidia. Este tipo de generalização não é aceito por outros especialistas, tendo em vista 
os excelentes desempenhos obtidos com choques quentes fortes (pouco acima de 40ºC) 
em espécies de águas quentes (tais como tilápias e carpas) e também o sucesso de 
choques frios bastante fortes (pouco abaixo de OºC) na indução de triploidia em 
salmonídeos. 
3) Reconhecimento dos triplóides - Em relação à morfologia externa, os triplóides 
puros e os diplóides geralmente não apresentam diferenças significativas. Em nível 
celular é que se encontram as diferenças mais marcantes, pois o tamanho dos núcleos e 
das células dos triplóides é cerca de um terço maior do que os dos diplóides. A maneira 
mais fácil para identificar triplóides de peixes é através das medidas dos eixos maiores 
dos eritrócitos em esfregaços de sangue corados por Giemsa. Outro procedimento é a 
contagem do número máximo de nucléolos nos eritrócitos, evidenciados após coloraçãocom nitrato de prata. 0 método mais direto para identificar os triplóides puros é o exame 
do número cromossômico. Por exemplo, em trabalho realizado no Brasil12 foi possível 
distinguir claramente carpas comuns triplóides (eixo maior dos eritrócitos = 8,23 ± 0,50 
µm; número máximo de nucléolos = 3; número de cromossomos 3n = 150) das diplóides 
(4,76 ± 0,25 µm; número máximo de nucléolos = 2; número de cromossomos 2n = 100). 
Existem métodos mais sofisticados para a identificação de triplóides, tais como 
estimativas do conteúdo de DNA nuclear por citofotometria e volume celular dos 
eritrócitos por sistemas automatizados como o "Coulter Counter Channelyzer", que é 
bastante eficiente porém de custo elevado, como já mencionado. 
4) Esterilidade, crescimento e sobrevivência - 0 interesse que os triplóides têm 
despertado na piscicultura devese a dois tipos de expectativa: a de que apresentem maior 
crescimento em peso e comprimento e a de que sejam estéreis. Sob o aspecto teórico, 
espera-se que os triplóides sejam maiores do que os diplóides porque suas células 
contêm 33% mais informação genética para o crescimento; além disso, por serem 
estéreis, os triplóides não gastariam energia para a produção de gônadas e gametas, 
para a corte, reprodução e cuidados à prole. 
Quanto ao crescimento, tem-se verificado, de u ma maneira geral, que diplóides e 
triplóides crescem igualmente até o início da idade da primeira maturação. Durante o 
período de maturação sexual os diplóides de ambos os sexos sofrem uma parada no 
crescimento, concentrando suas energias no desenvolvimento das gônadas; entretanto, 
as fêmeas triplóides, não formando gônadas normais, continuam crescendo em peso e 
comprimento e acabam por superar as fêmeas diplóides em 5% a 20% ao final do período 
de maturação. De fato, as fêmeas triplóides apresentam somente gônadas residuais e 
níveis de hormônios sexuais semelhantes aos das diplóides jovens. Os machos triplóides, 
entretanto, apresentam um considerável desenvolvimento gonadal, níveis de hormônios 
sexuais semelhantes ao dos diplóides adultos, mostram características sexuais 
secundárias e apresentam comportamentos de corte. Chegam também a produzir 
quantidade limitada de sêmen bastante fluido, com poucos espermatozóides móveis que, 
quando usados experimentalmente em fecundações artificiais, produzem abortos 
precoces, mostrando ser pouco provável que machos triplóides venham a produzir 
descendência normal e fértil. 
Logo, as fêmeas triplóides não são maiores que as diplóides devido a seu grau de 
ploidia, mas porque apresentam esterilidade gonádica. Conseqüentemente, a produção 
de linhagens monossexuais de fêmeas triplóides parece ser a mais interessante em 
programas de piscicultura que tenham por objetivo a obtenção de peixes maiores, cujos 
tamanhos comerciais ultrapassem a fase de maturação sexual. 
Os triplóides puros usualmente apresentam uma taxa de sobrevivência menor 
(entre 40% e 95%) do que a dos diplóides nas etapas iniciais do desenvolvimento7 . As 
informações até o momento disponíveis não permitem afirmar qual seria a principal causa 
do aumento da mortalidade dos triplóides. Admite-se que poderiam ser três as possíveis 
causas: a) efeito deletério dos choques térmicos sobre as proteínas fibrilares constituintes 
do fuso meiótico e eventualmente também sobre o citoesqueleto celular; b) a 
consangüinidade parcial, devida ao fato de os triplóides apresentarem em geral dois 
genomas femininos; c) o efeito da própria triploidia, em especial sobre o tamanho das 
células. Duas maneiras têm sido usadas com sucesso para atenuar o problema da 
mortalidade precoce dos triplóides puros. Um caminho, desenvolvido apenas 
experimentalmente, mas ainda não inserido na rotina das pisciculturas, consiste em se 
obter linhagens tetraplóides e cruzá-las com diplóides para se obter triplóides, que são 
chamados de triplóides interplóides22 ; estes interplóides apresentam taxas de 
sobrevivência e crescimento semelhantes às dos diplóides 7. Outra maneira que vem 
sendo usada em piscicultura e a produção de triplóides híbridos, cujas taxas de 
sobrevivência e resistência a doenças geralmente superam as dos diplóides híbridos. 
5) Uso de triplóides em programas de piscicultura - A produção de triplóides 
constitui um excelente caminho para se utilizar peixes exóticos em programas de 
piscicultura, minimizando assim possíveis problemas adversos de impacto ambiental. 
A carpa capim é uma espécie exótica na qual as possibilidades dos triplóides vêm 
sendo testadas há alguns anos. Esse peixe herbívoro, originário da China, foi introduzido 
nos EUA em 1963 e, desde então, vem sendo usado no controle biológico da vegetação 
aquática. Em muitos estados norte-americanos, foi banida a entrada da carpa capim, 
porque havia o receio de esta espécie escapar dos tanques de cultivo, reproduzir-se na 
natureza e prejudicar de algum modo as espécies nativas. A primeira possibilidade para 
se evitar a reprodução da carpa capim surgiu quando, em 1978, se verificou que a 
progênie híbrida F1 entre fêmeas de carpa capim e machos de carpa cabeça grande era 
formada por triplóides. Ensaios realizados em 1995 no CEPTA/IBAMA, Pirassununga-SP, 
com estoques brasileiros dessas duas espécies de carpa, possibilitaram também a 
obtenção de cerca de 100% de triplóides híbridos. Como os híbridos recebem dois lotes 
cromossômicos do genoma materno, essas linhagens apresentam a maioria das 
características de carpa capim e são mais vigorosas do que os diplóides híbridos. Em 
1983 conseguiu-se a produção de triplóides puros de carpa capim, com eficiência de 98%. 
A vantagem apresentada por essas novas linhagens de triplóides puros é a de que 
consomem biomassa de vegetação aquática igual à dos diplóides normais e de 3 a 4 
vezes maior do que os triplóides híbridos. Os triplóides puros, devido à sua maior 
capacidade de se alimentar de vegetação aquática e pelo fato de apresentarem tipo de 
esterilidade equivalente à dos triplóides híbridos, têm sido os preferidos ultimamente em 
projetos de piscicultura voltados para a área de controle da vegetação aquática em lagos 
e reservatórios. 
Tabela 3 -Esquemas gerais dos protocolos para a produção de linhagens de peixe 
poliplóides, ginogenéticos e androgenéticos 
 
1. Produção de Linhagens Poliplóides 
 
 CTP ? TRIPLÓIDES 
  
ESPERMATOZÓIDES + ÓVULOS ? OVOS 
  
 CHT ? TETRAPLÓIDES 
 
2. Produção de Linhagens Ginogenéticas e Androgenéticas 
 
 CTP ? GINOGENÉTICOS MEIÓTICOS 
  
- Espermatozóides + Óvulos ? OVOS 
 inativados por UV  
 CHT ? GINOGENÉTICOS MITÓTICOS 
 
- ESPERMATOZÓIDES + ÓVULOS ? OVOS 
 inativados por Co  
 CHT ? ANDROGENÉTICOS 
 
CTP = choque térmico precoce; CHT = choque hiperbárico tardio; 
UV = fonte de ultravioleta; Co = fonte de cobalto 
 
Os triplóides de carpa capim tratados hormonalmente para a indução das fases 
finais da gametogênese mostraram que praticamente todo o esperma produzido é 
anormal; a probabilidade de que um macho triplóide possa produzir descendência fértil é 
tão remota que os triplóides de carpa capim podem ser consideradosestéreis para 
propósitos operacionais de manejo em piscicultura. 
A maioria dos estados norte-americanos somente permite a entrada de linhagens 
100% triplóides em seus territórios. Devido a essa exigência, é necessário verificar o nível 
de ploidia de cada lote de carpa capim a ser usado. Portanto, o controle de qualidade é 
absolutamente necessário neste tipo de agroindústria, o que aumenta os custos de 
produção, mas diminui sensivelmente os riscos ecológicos. Por exemplo, para se ter 
certeza de que todos os exemplares de carpa capim são triplóides, o nível de ploidia de 
cada exemplar deve ser determinado antes de os mesmos serem legalmente estocados 
na natureza. Isso aumenta o custo da carpa capim triplóide em cerca de 400% em relação 
às linhagens diplóides. 
Muitos pesquisadores gostariam de produzir triplóides de algumas espécies 
importantes para o cultivo, tal como as tilápias, para eliminar a reprodução precoce que 
ocorre ainda durante a fase de crescimento destas espécies de peixes. Um pré-requisito 
importante para que esse tipo de biotecnologia seja efetivo e prático numa escala 
comercial é que a desova possa ser facilmente induzida e que uma grande quantidade de 
"óvulos" possa ser facilmente obtida. Algumas espécies, tais como as tilápias, são pouco 
fecundas e se reproduzem de maneira continuada porém assincrônica. A combinação 
destes fatores resulta em que dezenas de milhares de animais reprodutores teriam que 
ser manuseados anualmente para a produção de "óvulos" suficientes para um sistema de 
larga escala. Portanto, seria impraticável basear a piscicultura comercial da tilápia, ou de 
espécies de peixes com características reprodutivas semelhantes, na produção 
continuada de triplóides. 
A possibilidade de se utilizar triplóides no controle populacional de espécies de 
peixes "não desejáveis" em determinados ecossistemas abre perspectivas que precisam 
ser cuidadosamente pré-testadas em condições experimentais. Por exemplo, em 
princípio, existiria a possibilidade de serem usados machos triplóides do tucunaré no 
Pantanal Mato-grossense para se tentar o controle populacional desta espécie que é 
proveniente da Bacia Amazônica, caso ficasse documentado que esses machos triplóides 
se cruzam com fêmeas.diplóides normais e produzem descendência inviável. Esta 
proposta aqui apresentada, e por nós anteriormente Já mencionada e discutida em dois 
encontros técnico-científicos realizados em Pirassununga-SP e em Campo Grande-MS 
em 1995, deveria ser obrigatoriamente pré-testada em sistemas fechados de estações de 
piscicultura apropriadas. Em primeiro lugar, seria necessário produzir os triplóides de 
tucunaré, e a seguir testar o comportamento reprodutivo dos triplóides adultos. Deste 
modo seria possível responder a uma série de perguntas, tais como: os machos triplóides 
de tucunaré desenvolvem ou não gônadas maduras? Será que esses machos triplóides 
irão apresentar comportamento de corte e “espermiar" naturalmente? Caso os machos 
triplóides fertilizem os "óvulos" das fêmeas diplóides normais, serão ou não formados 
embriões? Estes embriões morrem ou não logo nos primeiros estádios de 
desenvolvimento? 0 tamanho populacional dos estoques de tucunarés diplóides normais 
diminui ou não nos tanques-teste, quando neles são introduzidos machos de tucunarés 
triplóides? 
 
2.2 Haplóides e Tetraplóides 
 
1) Haplóides - São organismos que apresentam somente um lote de 
cromossomos. Como possuem um único conjunto cromossômico, qualquer gene com 
efeito detrimental irá se manifestar e, como tal, é pouco provável que a maioria dos 
haplóides sobreviva durante muito tempo. De fato, dados da literatura têm mostrado que 
haplóides, produzidos em cerca de sete espécies de peixes para propósitos 
experimentais, têm mostrado baixa sobrevivência 7. 
Há dois caminhos para se produzirem haplóides e ambos envolvem a destruição 
do material genético de um dos parentais. Um dos modos consiste em fertilizar os 
"óvulos" com espermatozóides que tenham tido seu material genético destruído por raios 
X, raios gama, produtos químicos ou radiação UV. A radiação UV é provavelmente o 
melhor método para destruir o DNA dos espermatozóides, porque outras técnicas podem 
deixar fragmentos cromossômicos viáveis, que podem contribuir para a produção de 
indivíduos diplóides parciais ou que apresentem redução na taxa de sobrevivência. Além 
disso, a radiação UV é mais barata e mais segura que os demais tipos. Os 
espermatozóides tratados com UV ainda permanecem móveis e aptos para fertilizarem e 
ativarem os "óvulos". Uma vez ativados, os "óvulos" iniciam o desenvolvimento 
embrionário, mesmo que o espermatozóide fecundante não mais transporte genes 
funcionais. Como o espermatozóide inativado com UV não contribui com material 
genético, os alelos contidos no núcleo haplóide do "óvulo" serão os únicos a fazerem 
parte do núcleo do "zigoto". Os embriões assim produzidos são ginogenéticos haplóides, 
porque todo o material genético é de proveniência materna. 
Um segundo modo de produzir haplóides é destruir o material genético dos 
"óvulos" com raios X ou raios gama e fertilizar esses "óvulos" com espermatozóides 
normais. Como o núcleo haplóide do espermatozóide será a única contribuição para o 
genoma do "zigoto", o embrião será haplóide. Nesse caso, o embrião será androgenético 
haplóide, porque o material genético será proveniente exclusivamente do parental 
paterno. 
As linhagens de peixes haplóides são interessantes porque possibilitam aos 
pesquisadores estudar certos processos genéticos durante a embriogênese. Sob o ponto 
de vista prático, é bastante importante conhecer como produzir haplóides, porque 
constituem o primeiro passo para a produção de peixes ginogenéticos e androgenéticos 
diplóides. 
2) Tetraplóides - Os tetraplóides apresentam quatro conjuntos haplóides de 
cromossomos em lugar dos dois lotes normais. Os tetraplóides podem ser produzidos 
geralmente por um choque hiperbárico tardio, que bloqueia a primeira divisão mitótica de 
um zigoto diplóide (Tabela 2). Desse modo, foram produzidos em 1984 salmonídeos 
tetraplóides de primeira geração, que mostraram taxas de eclosão variando entre 5% e 
80%, e taxas de sobrevivência e crescimento bastante baixas7,23. 
0 interesse potencial dos tetraplóides em projetos de piscicultura e que podem ser 
usados para a produção de triplóides interplóides estéreis; desse modo ficaria eliminada a 
necessidade de produzir triplóides pelos métodos convencionais de choques térmicos 
precoces. Assim, cruzando-se linhagens tetraplóides com diplóides, produz-se 
descendência chamada de triplóide interplóide. 0 tipo de cruzamento mais conveniente 
seria usar como parentais fêmeas tetraplóides e não machos tetraplóides, porque as 
micrópilas dos "óvulos" de fêmeas diplóides não apresentam diâmetro suficiente para 
receber os espermatozóides produzidos pelos machos tetraplóides, uma vez que esses 
espermatozóides serão diplóides. Uma vez produzidas, as linhagens tetraplóides podem 
ser autoperpetuadas via intercruzamentos, evitando-se assim terem de ser continuamente 
produzidas. Em 1986, uma primeira geração de tetraplóides foi intercruzada e obteve-se a 
segunda geração de tetraplóides, que apresentou taxas de sobrevivência e crescimento 
apenas satisfatórias7,23. Os machos tetraplóides também têm mostrado capacidade de 
fertilização reduzida, em relação aos machos diplóides, aparentemente porque seus 
espermatozóides maiores apresentam dificuldade de penetração nas micrópilas dos 
"óvulos" normais. Atualmente, a tecnologia de tetraploidia se encontra restrita apenas ao 
nível experimental, não tendo sido ainda incluída na rotina de projetos de piscicultura. 
Somente trabalhos futuros dirão sobre as reais possibilidades dos tetraplóides na área 
aplicada. 
 
2.3 Ginogenéticos 
 
As linhagens ginogenéticas apresentam osdois lotes haplóides de cromossomos 
provenientes do parental materno. Em espécies de peixes nas quais a determinação do 
sexo é do tipo XX/XY e as fêmeas são homogaméticas (XX), todos os ginogenéticos 
serão fêmeas. 
Os ginogenéticos têm duas grandes aplicações potenciais em piscicultura: a 
primeira é o controle da proporção sexual pela produção de linhagens monossexuais de 
fêmeas e a segunda, a rápida produção de linhagens altamente consangüíneas7,16,23 
 
1) Produção de ginogenéticos - Há três maneiras principais de produzir linhagens 
ginogenéticas. A primeira é ativando os "óvulos" com espermatozóides que tenham tido 
seu material genético destruído por raios X, raios gama (em geral usando fonte de 60CO) 
ou radiação UV. A radiação gama tem a vantagem de possuir excelente poder de 
penetração, o que facilita o tratamento de grandes'quantidades de esperma. No entanto, 
fragmentos cromossômicos residuais são freqüentemente encontrados na descendência 
de ginogenéticos após a fertilização com espermatozóides irradiados com radiação gama; 
como tais fragmentos podem reduzir a sobrevivência dos ginogenéticos, dá-se preferência 
à inativação dos espermatozóides por UV. 
0 procedimento para o tratamento dos espermatozóides por UV é relativamente 
simples: inicialmente, o esperma é diluído de modo a que possa ser espalhado numa 
camada bem fina em uma placa de vidro e exposto a uma fonte de UV de uma lâmpada 
germicida. Grande número de "óvulos" pode ser fertilizado quando colocados diretamente 
na placa de vidro na qual foi feita a inativação dos espermatozóides. Normalmente, com 
exposições apropriadas à radiação UV, nenhum fragmento cromossômico paterno 
permanece nos espermatozóides. É possível que alguns dos peixes produzidos durante o 
processo acima descrito sejam diplóides normais, visto que também espermatozóides 
não-inativados podem fertilizar os "óvulos". Para evitar esse tipo de ocorrência, alguns 
pesquisadores usam espermatozóides de outras espécies que sabe-se, produzem 
embriões híbridos não-viáveis. Um segundo modo para se confirmar a não-transmissão 
do genoma do parental paterno é usar esperma de doadores que sejam homozigotos para 
genes marcadores dominantes. Por exemplo, espermatozóides de truta arco-íris 
pigmentada homozigota podem ser usados para ativar "óvulos" de fêmeas albinas; nesse 
caso, toda a descendência Albina será ginogenética, enquanto a descendência 
normalmente pigmentada será diplóide normal. Logo após a ativação, os "óvulos" são 
submetidos a choques precoces para impedir a eliminação do segundo corpúsculo polar 
(Tabela 3). Os ovos assim produzidos conterão dois núcleos haplóides: o núcleo do 
"óvulo" e o núcleo do segundo corpúsculo polar; os dois núcleos se fundem para formar 
um núcleo diplóide contendo os dois conjuntos de cromossomos originários do parental 
materno. 
Uma segunda técnica para produzir ginogenéticos começa do mesmo modo que a 
anterior: numa primeira etapa, os "óvulos" são ativados por espermatozóides que tiveram 
seu material genético destruído por radiação. Assim, serão produzidos ginogenéticos 
haplóides. Quando o zigoto haplóide inicia a primeira clivagem, é dado um choque tardio 
que bloqueia a primeira divisão mitótica. Desse modo, os dois núcleos haplóides se 
fundem e formam um zigoto diplóide, com dois lotes cromossômicos provenientes do 
parental materno. 
Os ginogenéticos produzidos pela supressão da primeira clivagem (chamados de 
ginogenéticos mitóticos) são homozigotos para todos os seus locos e apresentam 100% 
de consangüinidade. A maioria desses tipos de ginogenéticos apresenta baixas taxas de 
sobrevivência (ao redor de 1,5%), devido à expressão dos genes detrimentais recessivos 
que podem existir em maior ou menor quantidade nessas linhagens. Os ginogenéticos 
produzidos pelo bloqueio da eliminação do segundo corpúsculo polar (chamados de 
ginogenéticos meióticos) são, por definição, altamente consangüíneos, porém apresentam 
certo nível de heterozigose devido à ocorrência de permuta durante a meiose. Na 
literatura não há uma concordância geral a respeito dos níveis exatos de consangüinidade 
apresentados pelos ginogenéticos meióticos; segundo certos autores os níveis de 
consangüinidade seriam ao redor de 45% e 65%, e segundo outros entre 33% e 100%. 
Uma terceira biotecnologia que pode ser usada para produzir ginogenéticos 
consiste em fertilizar "óvulos" de fêmeas tetraplóides com espermatozóides cujo DNA 
tenha sido inativado por radiação. Como as fêmeas tetraplóides produzem "óvulos" 
diplóides, não há necessidade de os "óvulos" serem submetidos a choques precoces para 
a produção de complemento cromossômico diplóide. Em 1988, linhagens ginogenéticas 
de truta arco-íris foram produzidas por meio dessa técnica. Embora esses tipos de 
ginogenéticos sejam consangüíneos por definição, devem apresentar níveis 
consideravelmente maiores de heterozigose do que os ginogenéticos produzidos a partir 
de parentais maternos diplóides. De fato, tem-se verificado na literatura que esse tipo de 
ginogenético apresenta pouca redução nos níveis de heterozigose. 
2) Controle da proporção sexual- Um dos interesses da ginogênese em 
piscicultura é a possibilidade de produção de linhagens monossexuais de fêmeas. A 
produção de linhagens ginogenéticas poderia constituir potencialmente um caminho para 
o controle da reprodução. Entretanto, a ginogênese apresenta várias desvantagens 
quando proposta em projetos de piscicultura visando ao controle da reprodução. Um dos 
problemas é que os ginogenéticos são altamente consangüíneos. Se, por um lado, é uma 
grande vantagem dispor de diferentes linhagens consangüíneas para serem 
intercruzadas, seguindo-se o mesmo padrão de procedimento genético usado para a 
obtenção do milho híbrido, por outro lado é desvantajoso no caso em que os peixes 
ginogenéticos tenham que ser soltos na natureza, pois apresentam taxas de 
sobrevivência substancialmente menores do que as dos peixes normais. Um segundo 
problema relativo ao uso da ginogênese para finalidades de controle populacional é que, 
embora a descendência dos ginogenéticos possa ser unissexual, ainda permanece fértil. 
Portanto, a introdução acidental ou produção ocasional de machos em um projeto de 
ginogênese para controle populacional pode levar ao estabelecimento de uma população 
não desejável. Logo, em projetos para o controle da reprodução, parece ser preferível a 
utilização da esterilidade por triploidia induzida ou por tratamentos hormonais do que a 
monossexagem por ginogênese. No entanto, a ginogênese pode ser bastante útil na 
produção indireta de linhagens monossexuais de fêmeas. Nesses tipos de programas, 
uma linhagem ginogenética constituída somente por fêmeas pode ser tratada 
hormonalmente e revertida sexualmente em machos funcionais. Como os peixes 
resultantes serão geneticamente fêmeas e funcionalmente machos, quando cruzados com 
fêmeas normais irão produzir descendência constituída somente por fêmeas. Este tópico 
será retomado em detalhe no item 3- Reversão Sexual em Peixes do presente trabalho. 
3) Linhagens consangüíneas - Na área de pesquisa ictiogenética, verifica-se que 
a aplicação da ginogênese para a produção de linhagens consangüíneas torna-se cada 
vez mais importante; porém, as possibilidades de aplicação prática da ginogênese no 
manejo genético em projetos de piscicultura são ainda muito incertas, embora bastante 
promissoras. 
Em certas espécies de peixes, tais como a truta arco-íris, os estoques cultivados 
apresentam uma grande similaridade genética, como sugerem os estudos efetuados com 
auxílio dos marcadores genético-bioquímicos. Nessas condições é pouco provável que 
cruzamentos entre estoques muito pouco diferentes sob o aspecto genético dêem lugar a 
fenômenos de heterose ou vigor híbrido, em que o desempenho das progênies seja 
superior ao melhor estoque parental.Para casos como estes, uma das idéias dos 
geneticistas tem sido criar linhagens biologicamente bastante distintas. Um dos caminhos 
clássicos é o da consangüinidade, que possibilitaria, teoricamente, obterem-se as 
chamadas linhagens "puras", nas quais os indivíduos seriam, em princípio, geneticamente 
muito semelhantes entre si. Sob esse aspecto, o ponto mais interessante a se considerar 
é o de que duas linhagens consangüíneas seriam, em média, bastante mais diversificadas 
geneticamente do que duas outras não-consangüíneas. Portanto, cruzando-se duas 
linhagens consangüíneas diferentes, poder-se-ia esperar o aparecimento do fenômeno da 
heterose. Por este método, obteve-se o milho híbrido, que mais do que triplicou a 
produção deste cereal nos EUA após 1960. 
Para se obterem linhagens altamente consangüíneas nos animais, o 
procedimento clássico consiste em cruzamentos entre irmãs e irmãos inteiros, que são 
repetidos ao longo de gerações sucessivas. Esta forma de consangüinidade programada 
tem se mostrado muito eficiente na produção de linhagens "puras" de camundongos 
usados em laboratório. Ocorre, porém, que o intervalo entre duas gerações sucessivas, 
sendo bastante maior nos peixes cultivados do que nos camundongos, demandaria um 
mínimo de vinte anos de trabalho. A saída para tornar este método mais promissor tem 
sido a obtenção mais rápida de peixes altamente consangüíneos via ginogênese. Na 
prática, há vários obstáculos para se usar rotineiramente a ginogênese em programas de 
piscicultura. Um dos principais problemas é que as tecnologias de ginogênese são mais 
complicadas que os esquemas clássicos de cruzamentos entre irmãos; outro problema 
sério é que a ginogênese mitótica maximiza tanto os níveis de consangüinidade em 100% 
em uma única geração, como também maximiza as taxas de mortalidade e de anomalias. 
Um caminho alternativo que vem sendo adotado é um aumento gradual da 
consangüinidade das linhagens: para isso usa-se a ginogênese por retenção do segundo 
corpúsculo polar, que resulta em aproximadamente 45% a 65% de consangüinidade por 
geração, alternada com cruzamentos entre irmãos, que produz 25% de consangüinidade 
por geração7,6,20. Usando-se este esquema alternativo, a produção de linhagens 
ginogenéticas já começa a fazer parte da rotina de algumas pisciculturas européias, 
sendo o caso mais conhecido dos brasileiros o das chamadas carpas húngaras 17 . 
4) Identificação de sistemas de determinação do sexo -A produção de linhagens 
ginogenéticas auxilia na caracterização e distinção de sistemas de determinação do sexo 
em espécies de peixes em que a fêmea seja homogamética ou heterogamética. Quando a 
fêmea for homogamética, a ginogênese irá produzir somente fêmeas; quando a fêmea for 
heterogamética a ginogênese irá produzir números iguais de machos e fêmeas. Estes 
tipos de resultados não provam em definitivo qual seria o sistema de determinação do 
sexo na espécie testada; mas, devido ao fato de os sistemas XX/XY (igual ao de 
mamíferos) e ZZ/ZW (igual ao de aves) serem os mais comuns dentre os nove 
mecanismos de determinação do sexo existentes em peixes, a ocorrência de 
ginogenéticos constituídos somente por fêmeas sugere que a espécie em questão 
apresente o sistema XX/XY, enquanto que a ocorrência de 50% de machos e 50% de 
fêmeas sugere que a espécie em teste apresente o sistema ZZ/ZW. 
 
2.4 Androgenéticos 
 
Os androgenéticos são linhagens de peixes que apresentam unicamente o 
genoma paterno. 
1) Produção de androgenéticos - As linhagens androgenéticas podem ser 
produzidas por dois métodos; o mais comumente usado consiste em fecundar um "óvulo", 
cujo material genético tenha sido destruído por raios X ou raios gama, com um 
espermatozóide normal. Deste processo resulta um androgenético haplóide. Quando o 
zigoto androgenético haplóide vai sofrer a primeira clivagem mitótica, é dado um choque 
hiperbárico tardio para impedir a divisão celular, e os dois núcleos haplóides se fundem 
para formar um núcleo diplóide (Tabela 3). Todos os cromossomos do peixe 
androgenético provêm do parental paterno, e os animais assim produzidos são altamente 
consangüíneos. Como o complemento cromossômico diplóide provém de um único lote 
que se autoduplicou, os níveis de homozigose e de consangüinidade são ambos da 
ordem de 100%. Essas linhagens androgenéticas apresentam taxas de sobrevivência ao 
redor de 5%, devido à expressão dos alelos recessivos detrimentais7. 
Uma segunda técnica, que pode ser usada para a produção de androgenéticos, 
consta em fertilizar os "óvulos", cujo material genético tenha sido destruído por radiação, 
com espermatozóides de machos tetraplóides. Como se sabe, os machos tetraplóides 
produzem espermatozóides diplóides e, assim,os zigotos resultantes seriam diplóides. 
Desse modo, em 1990 foram produzidas nos EUA trutas arco-íris androgenéticas23. 
2) Androgenéticos e supermachos - Nos casos em que os androgenéticos 
sobrevivem até o período de primeira maturação sexual, é possível usá-los para a 
produção de supermachos (YY), nas espécies cujos sistemas de determinação do sexo 
sejam do tipo XX/XY. Nestes casos os machos são heterogaméticos, de modo que 
metade dos androgenéticos produzidos será de supermachos. 
3) Androgênese e conservação genética - Os androgenéticos apresentam uma 
aplicação potencial bastante interessante na área de manutenção do germoplasma e 
conservação de espécies de peixes em perigo de extinção. Através da androgênese, 
pode-se recuperar o material genético de espécies cujas amostras de esperma tenham 
sido criopreservadas em bancos de germoplasma. Como atualmente a tecnologia para 
preservação de "óvulos" de peixes ainda não é satisfatória, a única via prática para a 
estocagem e recuperação genética na área ictiológica é fertilizar "óvulos" recém-obtidos 
com esperma criopreservado. Usando-se a androgênese, o genoma de espermatozóides 
criopreservados pode ser recuperado, mesmo que a espécie venha a se extinguir. Este 
tipo de abordagem não é geneticamente completo, porque o DNA mitocondrial, que é 
herdado por via materna, não poderá ser recuperado por androgênese 3,6. 
 
3. REVERSAO SEXUAL EM PEIXES 
 
A manipulação de gametas, ovos e embriões podem ser realizados com maior 
facilidade em peixes do que em outros animais, porque esse grupo geralmente apresenta 
fecundação e desenvolvimento externos. Valendo-se do desenvolvimento externo dos 
peixes, os geneticistas e piscicultores conseguem controlar o sexo fisiológico desse grupo 
de animais através da adição de hormônios esteróides anabolizantes no seu alimento ou 
na água em que vivem. A razão pela qual é possível controlar o sexo fisiológico dos 
peixes é que, enquanto o sexo genético é determinado por ocasião da fecundação, o sexo 
fisiológico não é. Durante o início da embriogênese, um embrião de peixe não é nem 
macho nem fêmea, porque não possui ovários, testículos ou outras características 
associadas aos sistemas reprodutores. Ao contrário, um embrião de peixe possui 
precursores embriológicos de ovários e testículos (células germinativas primordiais) e, 
nesse estádio, um embrião é "totipotente" porque pode se desenvolver em um macho ou 
em uma fêmea. Em um determinado momento específico durante o desenvolvimento 
embriológico (momento que é diferente para cada espécie), um sinal químico originado de 
um gene ou de um conjunto de genes “informa" ao tecido totipotente em que direção se 
desenvolver. Uma vez que isso ocorra e o tecido pré-gonadal complete seu 
desenvolvimento, o peixe se torna fisiologicamente macho ou fêmea. Após essa etapa, 
não é mais possível alterar o sexo fisiológico, exceto por técnicas radicais, tais como a 
cirurgia gonadal, que têm mostrado pouco sucesso. 
Há um pequeno espaço de tempo, que varia de espécie para espécie, durante o 
qual o sexo fisiológico pode ser alterado. Se um peixe ingereou absorve esteróides 
anabolizantes durante esse período, o esteróide pode interferir diretamente no 
desenvolvimento das células totipotentes. Esta tecnologia tem sido bastante pesquisada 
nos últimos vinte anos e vem sendo rotineiramente aplicada em programas de piscicultura 
envolvendo, por exemplo, tilápias, salmonídeos e ciprinídeos. 
 
3.1 Linhagens Revertidas Monossexuais 
 
1) Produção de linhagens monossexuais em uma etapa - Para se alterar em uma 
única etapa o sexo fisiológico de peixes, as larvas e alevinos devem ser, ou alimentados 
com ração contendo andrógenos (hormônios masculinos) ou estrógenos (hormônios 
femininos), ou mantidos por certo tempo em água contendo concentrações diluídas 
desses mesmos hormônios. As dosagens exatas de hormônios e os tempos durante os 
quais 'devem ser administrados são fatores importantes no sucesso dos programas de 
reversão sexual em peixes 20,31. 
0 procedimento de reversão sexual em uma única etapa tem sido bastante usado 
na piscicultura das tilápias (Tabela 4). Uma das principais metas no cultivo de tilápias tem 
sido produzir linhagens monossexuais de machos com a finalidade de impedir a 
reprodução precoce e descartar as fêmeas que crescem mais devagar que do os machos. 
Para essa finalidade, as larvas de tilápia do Nilo por exemplo, são alimentadas com ração 
contendo 40 mg de 117-alfa-metiltestosterona/ kg de dieta durante um período de 60 dias. 
Essa dosagem usualmente reverte 100% das fêmeas em machos. 
 
Tabela 4 -Esquema geral do protocolo para a produção direta de linhagens revertidas 
de machos ou fêmeas em peixes com determinação do sexo tipo XX/XY 
 
ETAPA ÚNICA: Produção direta de linhagens revertidas 
 
FASE DE VIDA Larvas Indiferenciadas 
  
 ⊥ 
TIPO DE ESTERÓIDE ANDRÓGENOS ESTRÓGENOS 
 ↓ ↓ 
SEXO FISIOLÓGICO MACHOS FÊMEAS 
SEXO GENÉTICO MACHOS REVERTIDOS FÊMEAS REVERTIDAS 
 ou NEOMACHOS (XX) ou NEOFÊMEAS (XY) 
 MACHOS NORMAIS (XY) FÊMEAS NORMAIS (XX) 
 
Nas pisciculturas de truta arco-íris, onde uma das finalidades seria produzir 
populações monossexuais de fêmeas, as larvas indiferenciadas são alimentadas com 
ração contendo 20 mg de 17-beta-estradiol/kg de dieta durante um período de 40 dias, 
obtendo-se normalmente 100% de fêmeas revertidas. 
0 consumo de peixes revertidos sexualmente por administração de esteróides 
anabólicos pode levantar uma série de questões na área de saúde pública, conforme 
deverá ser discutido mais detalhadamente no item 6 - Riscos Potenciais de Linhagens de 
Peixes Geneticamente Manipulados, do presente trabalho. Este tipo de problema pode 
ser contornado, em parte, pela incorporação do processo de reversão sexual em 
programas de piscicultura que possibilitem a produção de linhagens monossexuais de 
fêmeas para espécies com sistema de determinação do sexo tipo XX/XY e de linhagens 
monossexuais de machos, para espécies com sistema de determinação do sexo tipo 
ZZ/ZW. 
2) Produção de linhagens monossexuais de fêmeas em duas etapas - É 
relativamente fácil obter matrizes que sejam capazes de produzir linhagens constituídas 
somente de fêmeas em espécies de peixes que possuem o sistema de determinação do 
sexo tipo XX/XY. Nesse caso, são usados andrógenos para produzir neornachos XX 
(Tabela 5). 
Numa primeira etapa, as larvas sexualmente indiferenciadas são alimentadas com 
ração contendo andrógenos ou mantidas em banho de água, também contendo 
hormônios. Os peixes são criados até que possam ser sexados e, então, são separados 
em duas categorias: fêmeas, que são descartadas e machos, que são guardados. 
Tabela 5 - Esquema geral do protocolo para a produção de linhagens monossexuais de 
fêmeas em espécies de peixes com sistema de determinação do sexo tipo 
XX/XY 
 
1. Etapa: Produção de linhagens de machos revertidos (XX) 
 
- Larvas indiferenciadas → Andrógenos → Machos revertidos (XX) e Machos normais (XY) 
 
2. Etapa de Progênie para identificação dos machos revertidos (XX) 
 
- Fêmeas normais (XX) x Machos revertidos (XX) → 100% de Fêmeas normais (XX) 
 
- Fêmeas normais (XX) x Machos normais (XY) → 50% de Machos normais (XY) + 
 
 + 50% de Fêmeas normais (XX) 
 
Guardar Linhagens de Machos Revertidos (XX) 
 
É impossível separar os neomachos ou machos revertidos tipo XX dos machos 
normais XY pelo simples exame de características sexuais externas. Assim, numa 29 
etapa é necessário realizar um teste de progênie para identificar os machos revertidos, 
dos normais. Para esta finalidade, são feitos cruzamentos entre casais de fêmeas normais 
e machos tratados hormonalmente e cada família é criada separadamente até que a 
descendência possa ser sexada. Caso a descendência se mostre constituída por 50% de 
fêmeas e 50% de machos, o macho parental é do tipo XY e deve ser descartado. Se, por 
outro lado, a descendência for constituída somente de fêmeas, então o macho parental 
testado é um neomacho tipo XX e deve ser mantido, porque são estes tipos de matrizes 
que servirão para a produção de linhagens monossexuais de fêmeas. 
Vários programas em piscicultura têm sido desenvolvidos para a produção de 
linhagens monossexuais de fêmeas como, por exemplo, em carpa capim, truta arco-íris e 
salmão do Atlântico. No caso da carpa comum, foram produzidos ginogenéticos revertidos 
(ginogenéticos em carpa comum são todos fêmeas XX) e criada uma linhagem que 
produzia somente filhas. Tanto na truta arco-íris como no salmão do Atlântico, não é 
necessário realizar o teste de progênie, porque os machos revertidos ou neomachos XX 
apresentam dutos espermáticos incompletos, o que significa que o esperma não pode ser 
normalmente liberado desses machos, mesmo por compressão abdominal. Devido a isso, 
o esperma de machos revertidos XX de trutas arco-íris somente pode ser obtido através 
do sacrifício dos animais. Portanto, os machos de truta arco-íris e de salmão do Atlântico 
podem ser caracterizados como neomachos (XX) ou como machos normais (XY) pelo 
exame dos dutos espermáticos. 
3) Produção de linhagens monossexuais de machos em duas etapas - Para se 
obterem matrizes que sejam capazes de produzir linhagens monossexuais de machos em 
espécies com sistema de determinação do sexo tipo ZZ/ZW, as larvas devem ser 
revertidas sexualmente com estrógenos. Assim são produzidas linhagens de neofêmeas 
ZZ. 0 único modo de diferenciar as neofêmeas ZZ de fêmeas normais ZW é através do 
teste de progênie das fêmeas. As fêmeas normais ZW produzem descendência 
constituída de 50% de machos e 50% de fêmeas, e devem ser descartadas. Por outro 
lado, neofêmeas ZZ irão produzir 100% de descendentes machos e serão estas as 
matrizes que deverão ser guardadas porque são capazes de produzir linhagens 
monossexuais de machos. Em certos casos, como verificado em tilápias da espécie 
áurea, algumas fêmeas produzem famílias somente de machos e outras famílias 
constituídas por machos e hermafroditas. As razoes para o insucesso parcial de 
programas com esta espécie de tilápia não são completamente conhecidas, mas podem 
ser devidas à contaminação com cromossomos sexuais de outras espécies, em 
decorrência de hibridação ou introgressão,ou devidas a genes modificadores do sexo. 
 
3.2 Produção de SupermachosA maioria das espécies utilizadas em piscicultura apresenta sistema de 
determinação do sexo tipo XX/XY Nesses casos, a obtenção de linhagens monossexuais 
de machos pode ser feita através da produção de matrizes de supermachos (machos que 
são YY em vez de XY). A Tabela 6 apresenta um esquema do roteiro em três etapas, 
necessário para a produção de supermachos. A primeira etapa deste programa consta de 
se alimentarem larvas sexualmente indiferenciadas com ração contendo estrógenos, com 
a finalidade de produzir neofêmeas ou fêmeas revertidas (fêmeas que geneticamente são 
machos XY, mas que fenotipicamente e fisiologicamente são fêmeas). Quando são 
sexados, verifica-se que os peixes tratados por hormônios se enquadram em três 
categorias: machos normais XX, neofêmeas revertidas XY e fêmeas normais XX. Os 
machos normais XY devem ser descartados porque não serão usados neste tipo de 
programa. As fêmeas normais XX também não são usadas neste tipo de programa de 
piscicultura, mas e impossível separá-las das neofêmeas XY examinando-se apenas as 
características sexuais externas. Portanto, a segunda etapa do programa consta da 
realização do teste de progênie para identificar as fêmeas revertidas XY e se poder 
descartar as fêmeas normais XX. Isto é feito pelo cruzamento de cada fêmea com um 
macho normal e, então, pelo cultivo de cada família em tanques individuais, até que a 
descendência possa ser sexada. As fêmeas que produzirem descendência constituída por 
50% de fêmeas e 50% de machos, são geneticamente XX e devem ser descartadas. Por 
outro lado, as fêmeas que produzirem 75% de descendentes machos, são neofêmeas XY 
e devem ser mantidas. No entretanto, neste ponto, as neofêmeas XY são menos 
importantes do que os 25% de seus descendentes que são supermachos YY, como 
indicado na Tabela 5 22,31. 
 
Tabela 6 - Esquema geral do protocolo para a produção de supermachos em espécies 
de peixes com sistema de determinação do sexo tipo XX/XY 
 
1. Etapa: Produção de linhagens de fêmeas revertidas 
 
- Larvas indiferenciadas → Estrógenos → Fêmeas Normais XX + Fêmeas revertidas XY 
 
2. Etapa: Teste de progênie para identificar fêmeas revertidas 
 
- Fêmeas revertidas XY x Machos normais XY → 25% Fêmeas normais XX + 
- +50% Machos normais XY 
- 
3. Etapa: Teste de Progênie para identificar os supermachos 
 
- Fêmeas normais XX x Supermachos YY → 100% Machos 
- Fêmeas normais XX x Machos normais XY → 50% Machos normais XY 
- + 50% Fêmeas normais XX 
 
Guardar as Linhagens de Supermachos YY 
 
Os supermachos são o objeto principal deste tipo de programa de reversão 
sexual, porque são as matrizes capazes de produzir descendência constituída somente 
de machos. Infelizmente é impossível separar machos normais XY e supermachos YY 
pelo exame das características sexuais externas, de modo que é necessário, numa 
terceira etapa, realizar um teste de progênie para identificar os supermachos, guardar 
essas linhagens, e descartar as linhagens de Machos normais. As linhagens de machos 
que produzirem descendência constituída por 50% de fêmeas e 50% de machos devem 
ser descartadas e aquelas que produzirem 100% de machos devem ser guardadas, 
porque são constituídas por supermachos, ou seja, são matrizes capazes de produzir 
descendência formada por 100% de machos, quando cruzadas com fêmeas normais, sem 
o uso de hormônios anabolizantes. 
Programas para a produção de supermachos têm sido levados a efeito, por 
exemplo, com truta arco-íris, bagre do canal e tilápia do Nilo. As matrizes de supermachos 
podem ser produzidas também pela combinação das biotecnologias de reversão sexual e 
ginogênese, conforme esquematizado na Tabela 7 para espécies com sistema de 
determinação do sexo do tipo XX/XY. Esse procedimento se mostrou bastante satisfatório 
na produção de linhagens monossexuais de machos de tilápia do Nilo20,22,31. 
 
Tabela 7 - Esquema geral do protocolo para a produção de supermachos combinando 
reversão sexual e ginogênese em peixes com o sistema de determinação do 
sexo tipo XX/XY 
 
1. Etapa: produção de linhagens de fêmeas revertidas XY 
 
- Larvas indiferenciadas → Estrógenos → Fêmeas normais XX + Fêmeas revertidas XY 
 
2. Etapa: produção de supermachos ginogenéticos 
 
Fêmeas revertidas XY x Machos normais XY com espermatozóides inativados por UV → 
Ovos → Choque Térmico Precoce para restaurar a diploidia → 50% Fêmeas ginogenéticas 
XX + 50% Supermachos ginogenéticos YY 
 
Fêmeas normais XX x Machos normais XY com espermatozóides inativados por UV → ovos 
→ Choque Térmico Precoce para restaurar a diploidia → 100% Fêmeas ginogenéticas 
 
Guardar as Linhagens de Supermachos Ginogenéticos YY 
 
Um pré-requisito, absolutamente necessário para o sucesso dos programas 
produção de supermachos com tilápias, é começar sempre com espécies "puras", porque 
linhagens resultantes de hibridação ou introgressão, por exemplo, entre tilápia do Nilo 
(com sistema de determinação do sexo do tipo XX/XY) e tilápia da espécie homorum (com 
sistema de determinação do sexo do tipo ZZ/ZW), irão apresentar uma mistura de 
sistemas de determinação do sexo, o que tornará bastante difícil, senão impossível na 
prática, levar avante qualquer programa bem sucedido de produção de supermachos com 
tilápias. 
 
3.3 Produção de Superfêmeas 
 
As matrizes de superfêmeas (WW) possibilitam a produção de linhagens 
monossexuais de fêmeas em espécies de peixes que apresentam o sistema de 
determinação do sexo tipo ZZ/ZW. 
A primeira etapa'para a produção de superfêmeas consiste na alimentação de 
larvas sexualmente indiferenciadas com dietas contendo andrógenos, com a finalidade de 
produzir machos revertidos ZW. Quando os peixes puderem ser sexados, são separados 
em duas categorias: fêmeas normais ZW, que são descartadas e machos, que são 
mantidos. Há dois tipos de machos, os neornachos ZW e os machos normais ZZ, os quais 
são impossíveis de serem separados pelo exame das características sexuais externas. 
Para identificar os machos revertidos ZW, é necessário, numa segunda etapa, 
realizar o teste de progênie. Os machos que produzem descendência constituída por 50% 
de fêmeas e 50% de machos são geneticamente ZZ e devem ser descartados e, os que 
produzem 75% de fêmeas são machos revertidos ZW e devem ser mantidos. Cerca de 
25% das fêmeas produzidas por machos revertidos ZW, serão constituídas por 
superfêmeas WW, que devem ser mantidas, e por cerca de 50% de fêmeas normais ZW, 
que podem ser descartadas. As matrizes de superfêmeas WW produzem descendência 
constituída por 100% de fêmeas normais ZW, quando cruzadas com machos normais ZZ. 
0 único meio para se diferenciar as superfêmeas das fêmeas normais é realizar numa 
terceira etapa, um outro teste de progênie. Caso a proporção sexual da descendência 
desse teste for constituída por 50% de fêmeas e 50% de machos, sabe-se que a parental 
fêmea é geneticamente normal ZW e deve ser descartada; por outro lado, se toda a 
descendência do teste for constituída somente por fêmeas, então a parental materna será 
a matriz superfêmea WW que está sendo procurada e deve ser mantida porque, quando 
cruzada com machos normais ZZ, produzirá somente uma descendência de fêmeas ZW 
23,31. 
Poucas espécies importantes para a piscicultura apresentam sistema de 
determinação do sexo tipo ZZ/ZW, como por exemplo, o bagre africano, a tilápia homorum 
e a enguia japonesa, porém é pouco provável o interesse na produção comercial de 
linhagens monossexuais de fêmeas, por exemplo, no caso das tilápias, uma vez que, 
neste grupo são os machos que apresentam maior interesse econômico, pois crescem 
mais que as fêmeas. 
Os programas de reversão sexual em piscicultura desenvolveram-se tanto que, 
sob o ponto de vista comercial, são atualmente os grandes responsáveis pela *produção 
de peixes em larga escala em váriospaíses. Por exemplo, cerca de 50% da truta arco-íris 
produzida no Reino Unido e 40% do salmão "chinook” produzido no Canadá, são 
provenientes de linhagens monossexuais de fêmeas produzidas por matrizes 
sexualmente revertidas, conforme procedimento sumarizado na Tabela 5. 
 
4. MARCADORES MOLECULARES EM PROJETOS DE ICTIOGENÉTICA, 
 
Nos últimos anos, tem havido um crescente aumento no uso de marcadores 
moleculares ao nível do DNA, em projetos de ictiogenética aplicados à piscicultura 4. 
Na Tabela 8, encontram-se resumidas informações gerais sobre os principais 
marcadores moleculares mais usados na área de ictiogenética e sobre o grau de 
contribuição de cada tipo de marcador para estudos genético-evolutivos. 
1) mtDNA - o DNA mitocondrial (mtDNA) é de natureza haplóide, apresenta 
molécula circular, não é recombinante, é transmitido via materna e contém cerca de 16 a 
20 mil pares de bases. Quando o mt DNA é digerido por enzimas de restrição (enzimas 
que clivam a molécula de DNA em locais específicos) e submetido a eletroforese, 
originam-se até cerca de 10 fragmentos por indivíduo, que são chamados RFLP 
(“restriction fragment length polymorphism"). Esses fragmentos podem variar ou por 
substituições de bases que causam ganho ou perda de sítios ou pela inserção/deleção de 
mutações que mudam o comprimento dos fragmentos. Diferentes enzimas de restrição 
reconhecem e clivam seqüências de 4, 5 ou 6 bases; por exemplo, a Xba 1, derivada da 
bactéria Xanthomonas badrii, atua sobre seqüências T^ CTAGA (^ = ponto de clivagem). 
0 mt DNA tem sido o marcador molecular mais usado em vários projetos na área 
ictiogenéticas,10,14,15. 
2) scn DNA - é um tipo de DNA nuclear de cópia única ("single-copy"), presente 
somente uma vez no genoma haplóide, sendo por isso também designado não-repetitivo. 
Engloba cerca de 70% do genoma dos mamíferos e geralmente é visualizado pela análise 
dos RFLP. 
 
3) DNA repetitivo interdisperso - é uma categoria de DNA nuclear constituída por 
elementos repetitivos longos (LINE) e curtos (SINE), que ocorrem múltiplas vezes, cerca 
de centenas de milhares, no genoma. Normalmente é visualizado também pela análise 
dos RFLP. 
4) DNA satélite - é um tipo de DNA nuclear, repetitivo, que contêm seqüências 
curtas que se repetem em tandem. 
Um dos tipos mais conhecidos de DNA satélite é o minissatélite multilocos, que 
dá origem ao chamado "DNA fingerprinting". 0 minissatélite multilocus é constituído por 
duas a várias centenas de cópias de seqüências curtas de DNA com 9 a 100 bases, 
muitas vezes concentradas nas regiões teloméricas. Quando esse tipo de DNA é cortado 
por enzimas de restrição, produz padrões bastante complexos que se parecem com um 
padrão de código de barras, que é característico para cada indivíduo, sendo por isso 
chamado de "DNA fingerprint". Até o momento existem na literatura boas e más notícias a 
respeito do "DNA fingerprint. Primeiro as boas. o desempenho e a aplicação desta técnica 
nos últimos anos tem sido cada vez mais promissores. Agora as más. É ainda uma 
técnica cara, com custos de U$ 50 a 100 por animal. 
Um outro tipo de DNA satélite é o chamado minissatélite loco-único também 
designado por VNTR (“variable number of tandem repeats"), cujo polimorfismo se deve a 
variação no comprimento dos alelos. Há alguns anos foi possível confirmar a presença e o 
potencial do VNTR no salmão do Atlântico 4. 
 
Tabela 8 - Principais tipos de marcadores moleculares ao nível de diferentes classes de 
DNA e o grau de desempenho em estudos genético-evolutivos 
 
Tipos de Marcadores 
e contribuição 
mt DNA scn DNA Repetições 
interdispersas 
VNTR Micros-
satélites 
RAPD 
Análise de 
Genealogias 
NA B NA E S B 
Genética de 
Populações 
B B NA B E S 
Detecção de Zonas 
Híbridas 
B/E S B NA NA NA 
Filogenias 
 
E B E NA NA NA 
E - excelente; B - boa; S - satisfatória; NA - não adequada 
 
Outro tipo ainda de DNA satélite é o microssatélite formado por seqüências 
simples de 1 a 6 bases repetidas de 5 a 100 vezes em cada loco e, usualmente, 
espalhadas ao longo do genoma. Por exemplo, a unidade CA pode ser encontrada repe-
tida 50 vezes em tandem. 0 número de repetições pode ser altamente variável, dando 
origem a um amplo Polimorfismo, que pode ser detectado via eletroforese. Os 
microssatélites exibem atributos que os tornam favoráveis como marcadores genéticos 
em vários projetos de piscicultura. São abundantes, apresentam altos níveis de variação 
alélica, e são bastantes úteis em várias situações: por exemplo, em espécies que 
apresentam baixo nível de variação com marcadores genético-bioquímicos (isozimas) ou 
moleculares (mt DNA) como por exemplo o salmão do Atlântico, espécie na qual vários 
microssatélites exibem mais do que 25 alelos e níveis de heterozigose que excedem 90%. 
Se, por um lado, o uso de microssatélites é bastante favorável porque seus alelos se 
comportam como marcadores mendelianos codominantes, por outro lado apresentam 
menores informações sob o aspecto filogenético4. 
 
5) RAPD("random amplífied polymorphic DNA")- consiste de regiões arbitrárias do 
DNA, mas de seqüências conhecidas, constituídas por 10 a 20 bases do genoma, que 
são amplificadas pela técnica chamada PCR ("polymerase chain reaction") e cujos 
produtos podem ser detectados por eletroforese. 0 RAPD foi usado com sucesso, por 
exemplo, na distinção de tilápias, evidenciando sua utilidade em investigações aos níveis 
taxonômicos de subespécies e espécies4. 
 
5. ENGENHARIA GENÉTICA EM PEIXES 
 
A engenharia genética é um tipo de biotecnologia molecular pela qual um ou mais 
genes são transferidos ou transplantados de organismos de uma espécie chamada 
doadora, para organismos de outra espécie chamada receptora, que será constituída 
pelos indivíduos transgênicos. 
 
Os programas com peixes transgênicos, a nível mundial, estão ainda em fase 
experimental e acredita-se que comecem a ser incorporados na rotina da piscicultura até 
o final da década de noventa 6,11,18,19. 0 tipo de tecnologia usada pela engenharia genética 
é de tal ordem sofisticado, que praticamente nenhum pesquisador ou piscicultor 
independente terá condições de desenvolver sozinho tal tipo de programa. Além disso, 
em muitos países já há uma série de leis federais, estaduais e até municipais regulando e 
disciplinando sobre pesquisas na área de engenharia genética. Há também o receio de 
que o escape de animais transgênicos para a natureza possa apresentar riscos de 
impactos ambientais ainda não totalmente conhecidos. Esses fatos, somados ao tipo de 
legislação, problemas éticos, morais e filosóficos sobre a produção de transgênicos, 
acrescidos ainda aos problemas de financiamento de projetos nessa área, leva a crer que 
a engenharia genética de peixes permanecerá durante vários anos ainda no âmbito de 
certas instituições de pesquisa e de algumas grandes empresas agroindustriais6,19. 
 
5.1 Produção de Transgênicos 
 
As etapas básicas para a produção de peixes transgênicos são: a) clonagem 
gênica, ou seja, a escolha e a obtenção de um determinado gene que, por exemplo, 
codifique a produção de hormônio do crescimento; b) microinjeção do gene escolhido nos 
ovos da espécie receptora; c) incorporação ou inserção do gene transferido no 
cromossomo da espécie receptora; d) expressão do gene inserido; e) transmissão do 
gene transplantado. 
 
1) Clonagem gênica - Para a obtenção de um determinado gene de um doador, 
existem três caminhos principais. 0 primeiro é recorrer às chamadas "bibliotecas gênicas", 
ou seja, há estoques de genes anteriormente já clonados e guardados em muitos 
laboratórios em várias partes do mundo. 0 segundo, é clonar os genes de maneira direta, 
ou seja, removendo o gene dos cromossomos da espécie doadora por digestão do DNA 
nuclear com auxílio de enzimas de restrição.Após a obtenção dos fragmentos e a 
identificação dos seus conteúdos gênicos, o gene a ser transplantado é inserido em 
plasmídios bacterianos (pequenos anéis de DNA localizados no citoplasma das 
bactérias), cortando-se esses plasmídios com enzimas de restrição, ligando-se o gene 
escolhido ao plasmídio, e então fechando-se os plasmídios com ligases (enzimas de 
reparo do DNA). 0 complexo gene-plasmídio é, então, transferido para uma bactéria, com 
auxílio de um choque térmico e, então, as bactérias são cultivadas e multiplicadas. As 
bactérias replicam os seus plasmídios ao se dividirem e, deste modo, são produzidas 
milhões de cópias do plasmídio e do gene a ele ligado. As bactérias são cultivadas até 
que haja material suficiente e depois são mortas e rompidas para a liberação dos 
complexos plasmídios-genes a serem transplantados. Os plasmídios são então isolados e 
purificados e o gene que interessa é isolado e removido. Um terceiro caminho é o método 
de clonagem indireta que começa com a extração do RNA do tecido, sua purificação e 
seu uso como modelo para sintetizar o DNA complementar (c DNA). A vantagem em se 
usar o material nuclear é que este material engloba as diferentes partes do gene, tais 
como o promotor e o espaçador que, normalmente, não são obtidos durante a transcrição. 
No entretanto, o c DNA contém apenas aquelas seqüências do nucleotídio que codificam 
para o trecho específico do RNA ativo na transcrição da molécula de proteína; por essa 
razão é necessário usar outros promotores para possibilitar a ativação do gene c DNA. 
Esses promotores não são específicos e podem ser usados para uma variedade de genes 
codificadores. Por exemplo, o plasmídio usado no caso do famoso gene para o hormônio 
do crescimento de rato que foi transplantado para camundongo em 1982, também incluía 
um promotor. Este mesmo plasmídio também foi usado em truta arco-íris. A maioria dos 
trabalhos com peixes tem usado DNA clonados para outros organismos, porém vários 
programas vêm sendo desenvolvidos visando a clonagem gênica em peixes; nesse 
sentido, já foram clonados os genes para o hormônio do crescimento do salmão "chum" 
em 1985, da truta arco-íris em 1988 e do salmão do Atlântico em 198919. 
2) Microinjeção de DNA nos ovos -Cerca de um milhão de cópias do DNA 
purificado devem ser injetadas em cada ovo. Os ovos de peixes são bastante favoráveis 
para esse tipo de procedimento, porque são grandes (geralmente têm mais de 1 mm de 
diâmetro), a fertilização é externa e pode ser controlada, as injeções não exigem 
micromanipuladores especiais e os ovos são fáceis de incubar. Existem"duas dificuldades 
principais relativas à manipulação dos ovos de peixes. Uma delas se deve à presença do 
córion, que é uma membrana externa envoltória do ovo. Em algumas espécies, como no 
caso do peixe dourado japonês, há necessidade de usar produtos químicos ou enzimas 
proteolíticas para remover o córion. Os ovos dos salmonídeos resistem à retirada do 
córion, que deve ser puncionado previamente com uma agulha sólida, antes da 
introdução da agulha para microinjeção do DNA. Sabe-se que a microinjeção do DNA no 
núcleo dos zigotos parece produzir melhores resultados do que injeções no citoplasma. 
Uma outra desvantagem dos ovos de peixes é que os núcleos são pequenos e não são 
visíveis, como ocorre com os núcleos dos zigotos de mamíferos; isto faz com que as 
injeções do DNA a ser transferido atinjam geralmente o citoplasma mais ou menos 
próximo do núcleo do zigoto. Centenas de milhares de cópias precisam ser injetadas em 
cada ovo, porque um grande número será destruído pelas enzimas celulares. 
3) Incorporação do gene transferido - As primeiras indicações do sucesso do 
transgenismo, ou seja, de que o DNA transferido foi incorporado ao genoma hospedeiro, 
irão surgir durante o período de intensa replicação do DNA, que acompanha os rápidos 
estádios de divisão celular do embrião jovem. A replicação conjunta do DNA introduzido e 
do DNA receptor pode ser detectada após a extração e detecção por sondas que hibridam 
especificamente com o DNA introduzido. 
Mesmo que o DNA transferido seja incorporado ao genoma do hospedeiro, os 
genes podem estar "danificados", de modo que pode ocorrer que somente uma parte do 
genoma venha a ser incorporada, os genes podem vir a ser incorretamente incorporados, 
ou incorporados no lugar errado. Mesmo que ocorra incorporação correta, a mensagem 
codificada pode não ser apropriadamente transcrita em RNA mensageiro, bloqueando 
assim a produção do produto gênico. 
4) Expressão do gene inserido - Tendo sido produzidos peixes transgênicos, a 
questão que se segue é saber se o novo gene transplantado está ou não transcrevendo 
em RNA e se o RNA está sendo traduzido em proteína. A expressão do gene inserido 
pode ser monitorada testando-se o RNA mensageiro dos tecidos transgênicos por testes 
imunológicos apropriados. A transferência bem-sucedida de um determinado gene não é 
garantia de sucesso. Os genes contêm reguladores e promotores que os ligam ou 
desligam em situações determinadas e, também, estes tipos de genes precisam ser 
transplantados junto com os genes estruturais. Logo, os complexos formados pelos genes 
estruturais e reguladores devem ser também injetados, pois suas presenças são 
essenciais para o funcionamento gênico. Por exemplo, as trutas arco-íris transgênicas 
produzidas em 1988 não apresentaram expressão gênica quanto ao hormônio do 
crescimento, porque foi usado na época um promotor de camundongo. 8,19,20 
5) Transmissão dos genes transplantados - A transmissão do DNA transplantado 
é um dos aspectos cruciais dos programas de engenharia genética, porque a finalidade 
desses programas é produzir linhagens de peixes com características vantajosas que 
possam ser transmitidas para a descendência. Em um peixe transgênico, espera-se que 
não só todas as células somáticas, como as germinativas, contenham o gene 
transplantado. Caso o peixe seja um heterozigoto transgênico, com a integração do gene 
transplantado em apenas um loco, então 50% de todos os espermatozóides ou "óvulos" 
produzidos transportarão a nova seqüência e, em cruzamentos com peixes 
não-transgênicos, 50% de toda a descendência será transgênica heterozigota. Caso os 
peixes transgênicos apresentem mais de uma cópia integrada em seu genoma, como, por 
exemplo, em diferentes locais dos cromossomos e em vários cromossomos, a 
descendência será constituída por mais de 50% de transgênicos. Caso, a partir de ovos 
de fêmeas transgênicas heterozigotas, sejam produzidos ginogenéticos mitóticos, cerca 
de 50% da progênie será formada por fêmeas transgênicas homozigotas. 
Evidências de transmissão de características transgênicas têm sido mostradas 
em programas de engenharia genética desenvolvidos na França com trutas arco-íris, nos 
Estados Unidos com a carpa comum, com o peixinho zebra danio e na China com o 
peixinho dourado 113,19,20,23 
 
5.2 Contribuição dos Transgênicos em Projetos de Piscicultura 
 
Atualmente começam a ser testadas em condições de piscicultura nos EUA, 
carpas comuns transgênicas para o gene do hormônio do crescimento. Pesquisas 
equivalentes, conduzidas na China em condições de laboratório, mostraram que o peixe 
dourado transgênico também para o gene do hormônio do crescimento, apresenta 
desempenho quatro vezes superior aos dos normais19. 
Nos EUA e Canadá já foi clonado o gene que codifica proteínas anticongelamento 
existentes no sangue de alguns linguados do Ártico, que permitem a sobrevivência destes 
animais em temperaturas inferiores a O°C. Os salmões do Atlântico não possuem as 
proteínas anticongelamento e morrem nos tanques-rede na região da Escandinávia 
quando as temperaturas caem a -0,7°C. A transferência dos genes para proteínas 
anticongelamento certamente seria muito útil se fosse feita tanto para salmões do 
Atlântico como para espécies