Prática Extração de DNA

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
CAMPUS MINISTRO REIS VELOSO – PARNAÍBA 
CURSO DE BIOMEDICINA 
Disciplina: BIOLOGIA MOLECULAR – AULA PRÁTICA 
Prof. Jefferson Soares de Oliveira 
 
Extração e purificação de DNA com KIT Wizard® Genomic DNA Purification (PROMEGA) 
 
Introdução: 
 
Inúmeros procedimentos para  isolamento de DNA  já  foram relatados na  literatura, seja para DNA genômico, 
plasmidial,  cloroplastial  ou  mitocondrial,  ou  para  diferentes  materiais  (tecido  animal  sólido  ou  líquido,  vegetais, 
microorganismos). De um modo geral, procedimentos padrões são utilizados na maioria dos trabalhos, e modificações 
podem  ser  introduzidas  visando  resolver  alguns  problemas  específicos  da  espécie  em  estudo.  A  maioria  dos 
protocolos de isolamento de DNA envolve cinco etapas básicas: 
1. Lise da parede celular para exposição dos componentes celulares 
2. Adição de um tampão de extração com pH entre 8,0 e 9,0, contendo algum tipo de detergente  (SDS) para 
solubilização das membranas  lipoprotéicas; anti‐oxidantes e quelantes (EDTA) para proteger o DNA da ação 
de nucleases;  sal  (NaCl) para  facilitar a precipitação das  impurezas no  final do procedimento. Para alguns 
materiais,  é  necessária  a  adição  de  agentes  redutores  para  proteger  o  DNA  de  agentes  oxidantes,  ou 
proteinases para facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina 
3. Após a solubilização das membranas, a suspensão é submetida a uma extração com solvente orgânico. Nesta 
extração,  lipídeos, proteínas e a maioria dos carboidratos são retidos na fase orgânica, que é separada por 
centrifugação da fase aquosa. Esta é composta pelos ácidos nucléicos (DNA, RNA) e alguns polissacarídeos. 
Para alguns materiais, é necessária mais de uma extração com solventes orgânicos para garantir uma melhor 
qualidade do DNA isolado.. 
4. Precipitação do DNA contido na fase aquosa, pela adição de um álcool (etanol, isopropanol). Na presença de 
álcool e sal ocorre a precipitação do DNA, algumas vezes visível na forma de um emaranhado de fitas. 
5. Solubilização do DNA, em água ultra‐pura ou em tampão. 
 
Em  geral  estas  etapas  de  extração  são  adequadas  para  o  isolamento  de  DNA  de  boa  qualidade.  Porém, 
dependendo  do  material  utilizado  na  extração,  modificações  podem  ser  realizadas  para  facilitar  o  isolamento  e 
melhorar a qualidade do DNA isolado. 
Especificações técnicas do produto ‐ KIT Wizard® Genomic DNA Purification (PROMEGA) 
 
For Laboratory Use. Each system contains sufficient reagents for 100 isolations of genomic DNA from 300µl of whole 
blood samples. Includes: 
100ml Cell Lysis Solution 
50ml Nuclei Lysis Solution 
25ml Protein Precipitation Solution 
50ml DNA Rehydration Solution 
250µl RNase Solution 
 
Table 1. DNA Yields from Various Starting Materials. 
Species and Material  Amount of Starting Material  Typical DNA Yield 
RNase 
Treatment 
Human Whole Blood   
(Yield depends on the quantity of 
white blood cells present) 
300µl
1.0ml 
10.0ml 
5–15µg
25–50µg 
250–500µg 
Optional 
Optional 
Optional 
 
Protocolo de segundo metodologia descrita pelo fabricante: 
 
Isolamento de DNA genômico de sangue total (volume de amostra 300ul de sangue) 
  
Materiais a serem utilizados 
• microtubos estéreis de 1,5 ml (para amostras de sangue 300 ul) 
• Banho maria, 37 ° C  
• isopropanol, à temperatura ambiente (25 ºC) 
• etanol 70%, em temperatura ambiente (25 ºC) 
• Banho de água, 65 ° C (opcional, para re‐hidratação rápida de DNA)  
 
1. Volume de amostra 300 ul de sangue 
Importante: O sangue deve ser coletado em EDTA, heparina ou citrato (anticoagulantes) para prevenir a coagulação; 
2. Agite  suavemente  o  tubo  de  sangue  até  ficar  bem  misturado  e,  depois,  transferir  o  sangue  para  o  tubo  de 
microcentrífuga de 1,5 ml contendo 900μl de Cell Lysis Solution. Inverter o tubo 5‐6 vezes para misturar; 
3. Incubar a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente (invertendo 2‐3 vezes durante o período de incubação) 
para lisar as células vermelhas do sangue. Centrifugar a 13.000‐16.000 × g por 20 segundos à temperatura ambiente 
(25 0C); 
4. Remova e descarte o máximo possível sobrenadante sem perturbar o sedimento visível branco. Cerca de 10‐20ul de 
líquido residual permanecerá sobre o precipitado (pellet); 
5. Vortexar vigorosamente o tubo até que as células brancas do sangue sejam re‐suspensas (10‐15 segundos); 
6. Adicionar  300ul  de  Nuclei  Lysis  Solution  para  o  tubo  que  contém  as  células  re‐suspensas. Pipetar  5‐6  vezes  a 
solução para lisar as células brancas do sangue. A solução deve ficar muito viscosa. Se a massa de células são visíveis 
após  a mistura,  incubar  a  solução  a 37  0C  até os  aglomerados  serem  interrompidos. Se os  aglomerados  são  ainda 
visíveis depois de uma hora, adicionar mais Nuclei Lysis Solution (Pipete 100ul) e repetir a incubação; 
7. Adicione 1,5μl RNase solution para o  lisado nuclear, e misturar a amostra,  invertendo o tubo 2‐5 vezes. Incubar a 
mistura a 37 ° C por 15 minutos, e depois esfriar à temperatura ambiente; 
8. Adicionar  100ul  de  Protein  Precipitation  Solution  ao  lisado  nuclear,  e  vortexar  vigorosamente  durante  10‐20 
segundos. Pequenos pedaços de proteína podem ser visíveis após vortexar; 
9. Centrifugar a 13.000‐16.000 × g por 3 minutos em temperatura ambiente (25 0C). Um tablete de proteína marrom 
escuro deve ser visível. 
10. Transferir  o  sobrenadante  para  um  tubo  de  microcentrífuga  de  1,5  ml  contendo  300ul  de  isopropanol  à 
temperatura ambiente. 
Nota: Algum  sobrenadante pode permanecer no  tubo  contendo o  sedimento original da proteína. Deixar o  líquido 
residual no tubo para evitar a contaminação da solução de DNA com a proteína precipitada. 
11. Homogeneizar a solução por inversão até que os fios brancos de DNA formam uma massa visível. 
12. Centrifugar a 13.000‐16.000 × g durante 1 minuto à temperatura ambiente. O DNA será visível como uma pequena 
bola branca. 
13. Descartar  o  sobrenadante  e  adicionar  um  volume  70%  de  etanol,  em  temperatura  ambiente,  sobre  para  o 
DNA. Inverta  delicadamente  o  tubo  várias  vezes  para  lavar  o  pellet  de  DNA  e  os  lados  do  tubo  de 
microcentrífuga. Centrifugar como na etapa 12; 
14. Aspirar  cuidadosamente o etanol usando uma pipeta Pasteur ou uma ponteira. O pellet de DNA é muito  solto 
neste momento e os  cuidados devem  ser utilizados para evitar aspirar o  sedimento na pipeta. Inverter o  tubo em 
papel absorvente e deixe secar o pellet de 10‐15 minutos; 
15. Adicionar 100ul de DNA Rehydration Solution para o tubo e hidratar o DNA através da incubação a 65 ° C durante 
1 hora. Periodicamente, misturar a solução batendo o tubo. Alternativamente, hidratar o DNA através da incubação a 
solução durante a noite em temperatura ambiente ou a 4 0C; 
16. Guarde o DNA de 2‐8 0C 
 
Cuidados Importantes 
‐ Ao se trabalhar com solventes orgânicos é indispensável o uso de luvas e jalecos de manga comprida, uma vez que 
estes podem ocasionar queimaduras na pele. 
‐ Ao se  trabalhar com amostras de  tecidos animais e sangue, principlamente humano,  lembrar‐se de que o mesmo 
pode  conter material  infeccioso  oculto,  tais  como HIV  ou  o  vírus  da Hepatite  B.  usar  luvas,  pipetas mecânicas  e 
trabalhar em um  local de segurança biológica apropriada e desinfetar o  local e o material antes do descarte. Tratar 
como lixo hospitalar e consultar a instituição sobre as regras de manipulação e descarte. 
 
 
Bibliografia 
AZEVEDO, M.O.;  FELIPE, M.S.S.; BRÍGIDO, M.M.; MARANHÃO, A.Q.; DE‐SOUZA, M.T.  Técnicas  básicas  em Biologia 
Molecular. Brasília: UNB, 2003. 
Protocolo  online  –  Your  lab’s  reference  book.  Disponível  em:  http://www.protocol‐
online.org/prot/Molecular_Biology/DNA/DNA_Extraction___Purification/. Acesso em 23/10/2010.