ExercíciosAula2

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Ciências Biológicas
Biologia Molecular Aplicada 2016
Prof. Dr. Daniel Guariz Pinheiro
Exercícios II
05/09/2016
RA Nome Assinatura
QUESTIONÁRIO
1. Seja a seguinte sequência de nucleotídeos de uma das fitas da dupla hélice do DNA: 5’-GGATTTTTGTCCACAATCA-
3’. Responda:
• Qual é o nome do processo de separação da dupla hélice do DNA? E o processo de reunião das fitas?
Desnaturação é o nome que se dá para a separação das fitas e Anelamento é o nome que se dá para a união das
fitas.
• Que agentes podem levar a esse processo? Temperatura elevada; pHs extremos (protonação e desprotonação);
agentes desnaturantes, como a formamida e o dimetil-sulfóxido (DMSO).
• Qual é a sequência da fita complementar no sentido 5’-3’? 5’-TGATTGTGGACAAAAATCC-3’
• Se ela for rotacionada (3’-ACTAACACCTGTTTTTAGG-5’), qual será a sequência da fita complementar no
sentido 3’-5’? 3’-CCTAAAAACAGGTGTTAGT-5’
• Qual é o sentido da síntese de uma nova fita de ácidos nucleicos (DNA ou RNA) ? Qual é o motivo? O sentido
da síntese de uma nova fita é 5’-3’, pois é na extremidade 3’, que está localizado o grupamento hidroxila livre
(-OH), no carbono-3, que é reconhecida pela polimerase, a qual iniciará a síntese desse novo polímero através
das ligações covalentes (fosfodiéster) com o grupamento fosfato ligado à hidroxila do carbono-5 da pentose
do nucleotídeo que será incorporado.
• Seja a seguinte fita de DNA é a fita molde para síntese de uma fita complementar 5’-AGCTTGCAACGTTGCATTAG-
3’. Qual é fita complementar no sentido 5’-3’? 5’-CTAATGCAACGTTGCAAGCT-3’
2. O que é Temperatura de fusão (Melting Temperature)? O que pode alterar essa temperatura? Temperatura em que
50% das moléculas de DNA estão desnaturadas, ou seja, com as fitas de DNA separadas. Essa temperatura pode
ser influenciada pela composição do DNA - maior a quantidade de G+C maior será a temperatura - e concentração
de sal (Na+) - maior concentração dupla hélice mais estável, maior é essa temperatura.
3. O que são os fragmentos de Okazaki? Para que servem? Eles são removidos durante o processo? Os fragmentos
de Okazaki são fragmentos de DNA recém sintetizados na fita atrasada de DNA a partir de um iniciador (primer)
de RNA. Participam do processo de replicação do DNA. Os iniciadores de RNA são removidos com RNAses com
atividade exonucleotídica 5’ => 3’ de uma enzima que pode ser tanto uma “Rnase H” quanto a “polimerase I” do
DNA. Os inicidadores de RNA precisam ser removidos e substituídos por segmentos de DNA, antes dos fragmentos
de Okazaki serem unidos entre si. Os fragmentos de Okazaki que são formados por DNA, eles não são removidos
durante o processo de replicação.
4. Na molécula de DNA de certas células bacterianas, 13% dos nucleotídeos são Adeninas. Qual é a porcentagem dos
outros nucleotídeos? %T = %A = 13%, 100 - 13 - 13 = 74% para C+G, logo %C = %G = 37% (74 / 2).
5. O que é uma sonda de DNA? Para que serve? Em que técnica de Biologia Molecular pode ser empregada? É
uma pequena molécula de DNA fita simples (ssDNA) ou de RNA marcada para posterior detecção, ela pode ser
marcada por exemplo, com um isótopo radioativo (P32) - auto-radiografia - ou fluoróforos - espectroscopia, ou com
alguma outra associação entre ligantes (e.g. biotina e estreptavidina). Ela serve para detectar a presença de uma fita
de ssDNA ou RNA com bases complementares a ela, após hibridação e detecção. A técnica de Southern blotting
utiliza sondas marcadas.
6. Considere a tabela (endonucleases de restrição) e a figura (plasmídeo 5.000 pb) abaixo para responder o questionário
associado:
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Nome Origem Sítio de reconhecimento Tipo Extremidades
e pontos de corte
-A-G/C-T- abruptas -A-G pC-T-
AluI Arthrobacter luteus
-T-C\G-A- -T-Cp G-A-
-T-G-G/C-C-A- abruptas -T-G-G pC-C-A-
BalI Brevibacterium albidum
-A-C-C\G-G-T- -A-C-Cp G-G-T-
-G/G-A-T-C-C- coesivas, -G pG-A-T-C-C-
BamHI Bacillus amyloliquefaciens H
-C-C-T-A-G\G- saliências 5’ -C-C-T-A-Gp G-
-G/A-A-T-T-C- coesivas, -G pA-A-T-T-C-
EcoRI Escherichia coli RY13
-C-T-T-A-A\G- saliências 5’ -C-T-T-A-Ap G-
-A/G-A-T-C-T- coesivas, -A pG-A-T-C-T-
BglII Bacillus globigii
-T-C-T-A-G\A- saliências 5’ T-C-T-A-Gp A-
-G-G/C-C- abruptas -G-G pC-C-
HaeIII Haemophilus aegyptius
-C-C\G-G- -C-Cp -G-G
-A/A-G-C-T-T- coesivas, -A pA-G-C-T-T-
HindIII Haemophilus influenzae Rd
-T-T-C-G-A\A saliências 5’ -T-T-C-G-Ap A-
-G-C/G-G-C-C-G-C- coesivas, -G-C pG-G-C-C-G-C-
NotI Nocardia otitidis caviarum
-C-G-C-C-G-G\C-G- saliências 5’ -C-G-C-C-G-Gp C-G-
-C-T-G-C-A/G- coesivas -C-T-G-C-A pG-
PstI Providencia stuartii
-G\A-C-G-T-C- saliências 3’ -Gp A-C-G-T-C-
-C-A-G/C-T-G- abruptas -C-A-G pC-T-G-
PvuII Proteus vulgaris
-G-T-C\G-A-C- -G-T-Cp G-A-C-
-C-C-C/G-G-G- abruptas -C-C-C pG-G-G-
SmaI Serratia marcescens Sb
-G-G-G\C-C-C- -G-G-Gp C-C-C-
-C/T-C-G-A-G- coesivas, -C pT-C-G-A-G-
XhoI Xanthomonas holcicola
-G-A-G-C-T\C- saliência 5’ -G-A-G-C-Tp C-
-G/A-A-T-T-C- coesivas, -G pA-A-T-T-C-
FunII Fischerella uniformis
-C-T-T-A-A\G- saliências 5’ -C-T-T-A-Ap G-
• Desenhe as extremidades do(s) fragmento(s) da digestão do DNA circular da figura. (Indique a extremidade
5’ livre com p e indique o(s) tamanho(s) de extensão em bases).
1 (Tamanho 2.753 bases de extensão e 2.745 pb - ~ 2.750) :
pos: 2 2.750
pA-A-T-T-C-...-G
G-...-C-T-T-A-Ap
2 (Tamanho 2.255 bases de extensão e 2.247 pb - ~ 2.250 ) :
pos: 2.751 5.000+1
pA-A-T-T-C-...-G
G-...-C-T-T-A-Ap
• Desenhe as extremidades do(s) framento(s) gerados a partir experimento anterior (digestão com EcoRI) após
serem tratamentos com uma enzima 5’-3’ exonuclease que somente degrada DNA fita-simples. Indique o(s)
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tamanho(s) em pb.
1 (Tamanho 2.745 pb) :
pos: 6 2.750
pC-...-G
G-...-Cp
2 (Tamanho 2.247 pb) :
pos: 2.755 5.000+1
pC-...-G
G-...-Cp
• Desenhe as extremidades do(s) fragmento(s) gerados a partir da digestão dos experimentos anteriores (digestão
com EcoRI e enzima 5’-3’ exonuclease) após serem digeridos com PvuII. Indique o(s) tamanho(s) em pb.
1 (Tamanho 1.247 pb) :
pos: 6 1.252
pC-...-C-A-G
G-...-G-T-Cp
2 (Tamanho 1.498 pb) :
pos: 1.253 2.750
pC-T-G-...-G
G-A-C-...-Cp
3 (Tamanho 2.247 pb) :
pos: 2.755 5.000+1
pC-...-G
G-...-Cp
7. Explique o que representa o Dogma Central da Biologia Molecular, e a principal restrição para o fluxo da informação
gênica de acordo com Francis Crick.
O Dogma Central da Biologia Molecular trata justamente do fluxo sequencial da informação gênica, transmitida
de resíduos a resíduos, e engloba os processos biológicos de replicação (DNA a DNA), transcrição (DNA a RNA)
e tradução (RNA a proteína), os quais são frequentes em todas nas células além de outros casos especiais, como
a transcrição reversa (RNA a DNA) e a replicação de RNA, processos observados em infecções virais, além da
tradução a partir do DNA (DNA a proteína) que foi demonstrada somente “in vitro”. A principal restrição a esse
fluxo de informação é o processo de transferência de informação de resíduos das proteínas aos ácidos nucleicos
(DNA ou RNA) (proteína a ácidos nucleicos), ou seja, a informação contida no RNA (ou mesmo no DNA), após ser
traduzida, jamais poderia ser recuperada integralmente a partir da molécula de proteína, pois sabemos que o código
genético é degenerado.
8. Identifique cada processo e componente na imagem abaixo utilizando as letras:
(A) DNA cromossômico;
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(B) DNA recombinante;
(C) Inserto;
(D) Vetor;
(E) Enzima de restrição;
(F)Enzima ligase;
(G) Eletroporação 1;
(H) Célula hospedeira;
9. Abaixo há uma figura que contém representações da mesma molécula de DNA de 15.000 pb. Cada representação
mostra a localização de diferentes sítios de restrição (linhas verticais). Os números entre os sítios de restrição
mostram os tamanhos (em pares de bases) dos fragmentos que serão gerados após a digestão do DNA com as
respectivas enzimas. Desenhe o resultado da eletroforese das 3 digestões e depois o resultado da auto-radiografia
após hibridação com a sonda representada na figura.
1Eletroporação consiste na aplicação de pulsos elétricos curtos de alta voltagem que aumentam o potencial de transporte de mem-
brana, promovendo uma formação transitória de poros aquosos (aumento da permeação de substâncias pelas "aquaporinas") na bica-
mada lipídica da membrana celular, permitindo que macromoléculas migrem através desses poros.
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O quadrado preenchido representa uma sonda marcada com
isótopo radioativo P32.
10. O gene da Amelogenina difere em tamanho no cromossomo X e Y (deleção em intron no AMEL-X) humano.
Abaixo, está um trecho do DNA do cromossomo X, com a região onde está localizada a deleção marcada sublinhada,
o restante é comum a ambos cromossomos. Desenhe pares de primer para amplificar a região de interesse e explique
como diferenciar se uma amostra é de um homem ou de uma mulher. Indique as extremidades.
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5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGTGTTGATTCTTTATCCCAGATGTTTCTCAAGTGGTCCTGAAATGTCAAGGATGGTGGTCGAAGGGTCAAATTCGAGACTA-3'
3'-GGGACCCGAGACATTTCTTATCACACAACTAAGAAATAGGGTCTACAAAGAGTTCACCAGGACTTTACAGTTCCTACCACCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGAT-5'
5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGTGTTGATTCTTTATCCCAGATGTTTCTCAAGTGGTCCTGAAATGTCAAGGATGGTGGTCGAAGGGTCAAATTCGAGACTA-3'
||||||||||||||||||||||||
3' <=CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGAT-5'
3'-GGGACCCGAGACATTTCTTATCACACAACTAAGAAATAGGGTCTACAAAGAGTTCACCAGGACTTTACAGTTCCTACCACCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGAT-5'
||||||||||||||||||||||||
5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG=> 3'
A: homem (X;Y) e B: mulher (X;X)
11. Acompanhe o relato de um crime para auxiliar na identificação do criminoso, descarte o suspeito que não pode ser
o autor do crime e indique o suspeito que provavelmente é o culpado e explique o motivo. Seguindo-se os relatos
de uma adolescente que tinha sido atacada por um estudante, foram identificados 2 suspeitos, que tiveram amostras
de swab bucal colhidas por peritos foresenses para extração de DNA e obtenção de perfis genéticos. Ambos os
suspeitos eram homens. E o resultado da avaliação do perfil de STRs estão representados abaixo:
O suspeito #1 é o provável criminoso. Os perfis do suspeito para todos os marcadores considerados corresponde ao
perfil de genético encontrado na cena do crime
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12. A figura abaixo é uma ilustração simplificada do processo de sequenciamento utilizando a metodologia de Sanger
utilizando marcação das bases com isótopos radioativos (e.g. P32) em 4 reações. Qual é a sequência da fita molde
na orientação 5’-3’?
Fita amplificada: 5'-GAACGTTTCAGAGCTACGTG-3'
Fita molde: 3'-CTTGCAAAGTCTCGATGCAC-5'
Resposta: 5'-CACGTAGCTCTGAAACGTTC-3'