Aula 4 Cultivo Bacteriano

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Nutrição microbiana
Componentes necessários às células
Meios de cultura
Condições ambientais
Crescimento populacional
Velocidade de crescimento
Tempo de geração
Medidas do crescimento
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De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais.
Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais.
Todos os organismos vivos compartilham algumas necessidades nutricionais em comum:
	- carbono
	- nitrogênio
	- água
NUTRIÇÃO MICROBIANA
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Em algumas situações os microrganismos são estudados em seu hábitat natural.
	Ex.: Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo.
Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório.
	Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais 
	Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas.
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	Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais.
	Os elementos químicos principais para o crescimento das células incluem C, N, H, O, S e P e são denominados de macronutrientes.
O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano (todos requerem carbono)
Os compostos orgânicos são os que contém carbono
 (Exceção para CO2)
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	MACROnutrientes: - Necessários em grande quantidade. 
		 - Tem papel importante na estrutura e metabolismo.
	MICROnutrientes: - Necessários em quantidades mínimas.
		 - Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas
Uma célula típica
Gráf6
		30
		70
Plan1
		
		
		
		
		
						Matéria seca		30
						Água		70
		
		
						C		51
						N		12
						H		7
						P, S, K, Na ...		30
		
								100
Plan1
		
Plan2
		
Plan3
		
		
Gráf7
		51
		12
		7
		30
Plan1
		
		
		
		
		
						Matéria seca		30
						Água		70
		
		
						C		51
						N		12
						H		7
						P, S, K, Na ...		30
		
								100
Plan1
		
Plan2
		
Plan3
		
		
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Fonte de Carbono 
	Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
	- Carboidratos
 	- Lipídeos 
 	- Proteínas
	Deles se obtém energia e unidades básicas para o crescimento celular.
	Utilização de CO2 (microrganismos autotróficos) 
	É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia provém da luz.
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Fonte de Nitrogênio
- É elemento mais abundante depois do C, cerca de 12%
 (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
	► Moléculas orgânicas (aminoácidos, proteínas, etc.)
	► Moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)
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Hidrogênio
Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) 
Função do H:
Manutenção do pH
Formação de ligações de H entre moléculas 
Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da respiração
Oxigênio
 - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos ...)
 - É obtido a partir das proteínas e gorduras.
► Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.
	
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P 	– Sínese de ácidos nucléicos, ATP;
S 	– Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas; 
K 	– Atividade de enzimas;
Mg	– Estabilidade dos ribossomos;
Ca 	– Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de 			 endósporos;
Na 	– Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos;
Fe 	– Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das 	 	 proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Outros macronutrientes:
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Metais são em quantidades muito pequenas (traço) necessários na composição de um meio de cultura:
	Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
► Exercem função estrutural em várias enzimas
	- Nem sempre sua adição é necessária
	- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra
 pura podem apresentar deficiências desses elementos.
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Água
Componente absolutamente indispensável 
	(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)
► Laboratório: destilada, filtrada, deionizada
Outros aditivos
 	Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH. 
►Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos
	Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos
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► Tampões	
	- Carbonato de cálcio
	- Fosfatos
	- Proteínas (peptona)
►Inibidores
	Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger
	Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico	
	
	Outros aditivos
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►Indutores
- A maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.
	
	Ex: celulose induz a celulase
		pectina induz a pectinase
		amido induz a amilase 
►Antiespumantes
 - Cultivos com aeração ocorre a produção de espuma
Remoção de células, perda do produto, contaminação;
Redução do volume do meio
Um antiespumante reduz a tensão superficial das bolhas
	(álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis, ... )
	
	Outros aditivos
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Soluções nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.
Classes
Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)
Complexos (utilizam hidrolisados – caseína, carne, soja, levedura)
Não existe um meio de cultura universal, mas
Existem vários tipos meios para diversas finalidades
Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada.
	
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MEIOS DE CULTURA
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Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais.
 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.
Meio de cultura solidificado com 1,5 % de ágar.
Até 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos.
Robert Koch introduziu os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras).
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Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades.
	Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies
	Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.
Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey
 Fermentar lactose vermelho E. coli
Gram – inibe Gram +
Lactose –
Salmonella, Pseudomas
 e Shigella
Lactose +
Klebsiela, 
Enterobacter,
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Normalmente imitam o habitat normal
	Ex.
	Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de cultura.
	
Meio definido para quimioautotróficas
Meio definido para heterotróficas
Meio complexo para heterotróficas
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Todos os fungos são heterotróficos
	Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja.
	Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias. 
	Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
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Os protozoários são heterotróficos aeróbios com exigências nutricionais complexas
	Muitos não são cultivados in vitro.
	
	Os que são necessitam muitos complementos, como emulsões de tecidos cerebrais, soro fetal, infusão de fígado e células bacterianas.
	Ex: Tetrahymena pyriformis necessita de um meio contendo 10 aminoácidos, 7 vitaminas e sais inorgânicos.
Tetrahymena pyriformis não é patogênico mas é utilizado em pesquisas médicas e biológicas. 
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As algas utilizam
luz como energia, dióxido de carbono, água e íons inorgânicos solúveis. São fotoautotróficos.
	Ao contrário dos meios para bactérias e fungos, existem poucos meios prontos para algas.
	
	Preparar um meio definido para algas marinhas pode ser muito trabalhoso, pois muitos sais contidos na água do mar poderão ser necessários.
Maré vermelha.
Algas que produzem toxinas. 
Algas unicelulares 
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Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio)
Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros.
	Ex. meio ágar verde brilhante enterobactérias.
Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista.
	Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas.
Meios seletivos/diferenciais:
 	Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta.
Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie sem inibir as demais. 
	Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte de carbono.
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Lowenstein-Jensen (Albumina, Lecitina (Ovo), Glicerol, Asparagina, 
Sais Minerais e Verde Malaquita (agente inibidor) 
Middlebrook (agar e caldo) (sais específicos, vitaminas, cofatores, acido oléico, 
albumina, catalase, glicerol, asparagina)  cresce menos contaminantes que o 
contendo ovo.
Mycobacterium tuberculosis 
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Como determinar uma composição inicial para um meio de cultivo:
Composição elementar média (% do peso seco)
Passo 1: utilizar dados da composição elementar
Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de N, ou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N) 1,8g em 10g 
1,8g N em 10g de (NH4)2SO4 
1,3g N em x
Obs.: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem 	 introduzir o excesso de um deles.
Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos)
Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C)
Fração para energia e manutenção (45%): 
YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose
Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1
.... E assim por diante.
Passo 2: otimização
MEIOS DE CULTURA
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Temperatura
oxigênio 
pH
Pressão atmosférica, hidrostática e osmótica
Radiação eletromagnética
Condições ambientais 
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Sistema para cultivo de anaeróbios
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Sistema para cultivo de aeróbios
Equipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura
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Ao contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá,
Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto em todas as condições de pH.
Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos.
	- Necessário a adição de um tampão ao meio.
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Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se.
Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.
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Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células 
Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão
	
Varia de minutos até dias
Depende muito das condições ambientais
Escherichia Coli - 20 minutos
Pisolithus microcarpus – 2,5 dias
fungo
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A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana
O crescimento de microrganismos apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.
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Gráf1
		2
		4
		8
		16
		32
		64
		128
		256
		512
		1024
		2048
		4096
		8192
minutos
células
Plan1
		
		
		
		
		
		20		2
		40		4
		60		8
		80		16
		100		32
		120		64
		140		128
		160		256
		180		512
		200		1024
		220		2048
		240		4096
		260		8192
Plan1
		
minutos
células
Plan2
		
Plan3
		
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Fase Lag
		Período de adaptação da cultura
Mudança de meio, preparação do complexo enzimático
Reparação das células com danos.
2) Fase exponencial
 		Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.
A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as velocidades de crescimento são bastante variáveis:
	 - Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos
		- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores
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3) Fase estacionária: 
		Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial não pode ocorrer indefinidamente.
Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.
		Divisão = morte → crescimento líquido nulo
Ainda pode ocorrer: catabolismo e produção de metabólitos secundários
4) Fase de morte (declínio):
A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte.
		- A morte celular é acompanhada da lise celular
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Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:
	1) Peso seco total das próprias células – filtração, secagem e pesagem
	2) Peso de algum componente celular – extração, secagem e pesagem
	3) Variação no número de células
	 a) contagem de células totais
	 b) contagem de células viáveis
a) Contagem de células totais (contagem microscópica direta)
	Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)
	Ex.: Câmara de Neubauer
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Vantagens: método rápido e fácil
Desvantagens 
Não distingue as células vivas das mortas
Pode-se omitir células pequenas
Células móveis precisam ser imobilizadas
Entre outras.
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 b) Contagem de células viáveis:
	Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.
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Razões:
Erros devido à junção de células na colônia
Restrições podem fazer células viáveis não originarem colônias
São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis.
É contada a placa com 30 a 300 colônias
Diluição das suspensões celulares
	Amostras concentradas precisam ser diluídas
	
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	Turbidimetria
	As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio
	Pode ser medida com um espectrofotômetro
 O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão
 - Turbidez X quantidade de células
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Contagem eletrônica