Resumo de Genética II P2 (Profs Carol e Daniel)

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Resumo de Genética – P2 4º semestre
Transgênicos
A criação de organismos transgênicos proporcionou um grande desenvolvimento no ramo da agricultura. Empresas multinacionais investiram muito na produção de plantas com características que lhe conferem vantagens, especialmente maior resistência a pragas e maior valor nutricional.
Células-tronco
• Células que não envelhecem – não passam pelas reações químicas que uma célula normal passa.
• Células-tronco são capazes de originar os diferentes tipos de células do organismo, por ainda não terem sofrido diferenciação. A célula-tronco mais típica do organismo é o zigoto: a partir dela, por divisões, são formados todos os tipos de células. Por apresentar essa propriedade, o zigoto é chamado de totipotente.
Diferenciação celular: estágios do desenvolvimento em que sofrem divisão e adquirem forma e função definitivas.
CT Embrionárias (pluripotentes): após a fecundação, o zigoto se divide por mitoses sucessivas até o estágio de mórula, com 16 a 32 células chamadas blastômeros. Os blastômeros se afastam uns dos outros, permitindo a formação de uma cavidade interna, sendo chamada de blastocisto. Nele, a massa celular interna originará o embrião. As células da parede do blastocisto implantam-se no útero, iniciando a formação da placenta. Tanto as células da mórula como as da massa celular interna são CT com alto potencial de diferenciação. Essas células também são encontradas em adultos.
Mórula: totipotentes (originam inclusive a placenta)
Massa celular interna: pluripotentes (forma apenas os tipos celulares)
CT Adultas (multipotentes): no sangue, a medula óssea vermelha contém células hematopoiéticas da linhagem linfoide (que se diferenciam em linfócitos) e células da linhagem mieloide (dão origem aos demais leucócitos e hemácias). 
Camada germinativa: mitoses ocorrem na camada mais basal da epiderme.
Ex. de CT adultas: linhagem mieloide, linfoide e células da camada germinativa. 
Teratoma: tumores com vários tipos de tecidos que crescem de forma desorganizada.
Ectoderme – pele + anexos; sist. nervoso
CélulaEndoderme – sist. Respiratório; sist. Digestório
Mesoderme – músc; sist. Excretório; Ap reprodutor; sangue; gordura
Desenvolvimento:
1º ao 4º) Zigoto + blastômero - totipotentes
5º) Embrião forma o blastocisto + massa celular interna do blastocisto – pluripotentes
6º) Células remanescentes (células que restaram nas 3 camadas primárias) – multipotente
Quiescência → como se a célula hibernasse, mas podendo reativar-se.
Pluripotente: consegue gerar todos os tecidos, só que não conseguem produzir tec. externos. Vira qualquer órgão.
Multipotente: é limitada, pois só forma os órgãos responsáveis por cada camada (ectoderme, mesoderme e endoderme). Não forma teratoma, mas gera rejeição. É usada na cura para leucemia.
Problemas com a CT Embrionária
CTE → Blastocisto
CTEg → TE germinativo
CTEt → Teratoma 
Citômero = técnica que separa CT das demais.
Terapia Celular
1º) Coleta da medula óssea
2º) Isolamento da fração mononuclear
3º) Administração aos pacientes
Clones e Clonagem
Clones: cópias geneticamente idênticas, obtidas de um indivíduo inicial.
Todos os organismos que têm reprodução assexuada, como as hidras e as esponjas, formam clones. Na espécie humana, os gêmeos idênticos (que provêm de um único zigoto) são clones. 
O termo clone tem sido usado para designar não somente organismos, mas também células ou moléculas de DNA obtidas de uma amostra original.
A ovelha Dolly
A grande novidade em relação à ovelha Dolly foi o fato de conseguir um clone pelo enxerto de núcleos de células adultas – portanto, já diferenciadas – em ovócitos de ovelha. O trabalho iniciou-se com a cultura de células das glândulas mamárias de ovelhas da raça finn-dorset e com a remoção dos núcleos de ovócitos de ovelhas da raça scotish blackface. A fusão das células aos ovócitos, por estímulo elétrico, resultou em 247 embriões (blastocistos), que foram transferidos para 13 mães de aluguel da raça scotish b. Apenas uma mãe gerou uma ovelha, que foi batizada de Dolly, clone da finn-d., doadora da gl. mamária. Assim, o que parecia impossível aconteceu: um clone a partir do núcleo de uma célula de um animal adulto, já diferenciada. Apesar de ser um clone, Dolly não era um clone idêntico, pois sua mitocôndria veio da 2ª ovelha.
Clonagem Reprodutora: são formados indivíduos geneticamente idênticos ao doador. 
Ex: ovelha Dolly
Clonagem Terapêutica: leva à obtenção de células-tronco geneticamente idênticas às do paciente, portanto, sem o risco de rejeição. 
Em um óvulo anucleado, deve-se enxertar um núcleo da célula (já diferenciada) do paciente. Assim, é formado um “zigoto”, que pode ser cultivado até a fase do blastocisto. Pode-se, então, retirar células-tronco da massa celular interna que, em meio de cultura, diferenciaram-se até o resultado desejado, sendo em seguida utilizadas no paciente. 
Clonagem natural: erro no ato do desenvolvimento de uma célula totipotente.
Diagnóstico Genético Pré-implantacional – PGD
Objetivos principais: Auxílio a casais com risco genético reprodutivo.
– Doenças cromossômicas (Translocações) 
– Doenças gênicas (Fibrose cística, hemofilia, FRAXA, Adenoleucodistrofia etc) 
Diagnóstico:
- Hibridização in situ fluorescente (FISH) 
- Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Microssatélites = são pequenos segmentos de DNA formados por grupos de 1 à 6 nucleotídeos que se repetem seguidamente, distribuindo-se de forma aleatória ao longo do genoma e que não apresentam função codificadora. 
Haplótipo: conjunto de valores dos microssatélites.
Haplótipo alterado: alelo que carrega alteração.
Técnicas em Biologia Molecular
Técnicas Diagnósticas II
PCR (Reação em cadeia da polimerase) 
• A PCR é empregada para amplificar uma região única de DNA em um genoma complexo. 
• Para isso são necessários 2 “primers” – 1 sense + 1 antisense - que delimitarão o fragmento resultante.
• Desenho dos “primers” regula a especificidade da amplificação. 
• Normalmente oligonucleotídeos de 20-24 bases são suficientes para selecionar um fragmento único. 
Reagentes necessários: 
• DNA MOLDE 
• INICIADORES (PRIMERS) 
• dATP , dTTP, dCTP e dGTP 
• TAMPÃO 
• DNA POLIMERASE I
Sequenciamento automático
É baseado na incorporação de desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) a uma cadeia de DNA em crescimento, tendo como molde o DNA de interesse. Quando os ddNTPs são adicionados, a extensão da cadeia é interrompida pois esses didesoxinucleotídeos não apresentam um grupo hidroxila (OH) 3’ necessário para a ligação do próximo desoxinucleotídeo (dNTP). Como esses ddNTPs são marcados, podem ser detectados e a seqüência dos nucleotídeos identificada.
O sequenciamento automático utiliza sequenciadores com eletroforese vertical em placa (ABI377 Applied Biosystem) ou eletroforese em capilar (ABI3100 Applied Biosystem), onde os próprios ddNTPs (Didesoxinucleotídeos) possuem marcação com fluorescência, ao contrário do método manual, em que estes apresentam marcação radioativa. Para a geração de fragmentos durante a reação de sequenciamento, os dNTPs são adicionados à nova fita e no momento da adição de um ddNTP, a extensão da cadeia é interrompida e consequentemente marcada com o último didesoxinucleotídeo incorporado. No final de vários ciclos tem-se várias cadeias de DNA de diferentes tamanhos terminadas com diferentes ddNTPs que posteriormente serão identificados (lidos em sequenciador automático). A reação de sequenciamento ocorre em termociclador e é caracterizada por várias etapas ou ciclos em diferentes temperaturas, repetidos por várias vezes por um determinado período de tempo.
Suas etapas são:
1- Desnaturação - É a primeira etapa da reação de sequenciamento na qual a molécula de DNA é separada em fita simples. Para ocorrer a desnaturação eleva-se a temperatura a 96ºC durante 2 minutos.
2- Anelamento - Caracterizadapela utilização de um único primer que irá se anelar à fita de DNA na região complementar à sua seqüência. Para ocorrer ao anelamento diminui-se a temperatura para 50ºC durante 15 segundos.
3- Extensão - Após o anelamento do primer, ocorre a extensão do fragmento através da inserção dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) pela Taq DNA Polimerase. Como os ddNTPs estão em concentrações muito menores que os dNTPs, a sua inserção na cadeia é menos frequente. Essa etapa ocorre a 60ºC durante 4 minutos. Quando os ddNTPs são inseridos no lugar dos dNTPs, a extensão pára. Após a reação de sequenciamento, os produtos são purificados para a remoção dos nucleotídeos não incorporados e demais reagentes, para não interferir na leitura quando submetidos ao sequenciador automático. Logo após a purificação os produtos são submetidos ao sequenciador automático, cujo princípio é o da eletroforese. Os fragmentos marcados com fluorescência migram ordenadamente no interior dos capilares e à medida que são excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda que são detectados por um fotomultiplicador. Em seguida essa informação é transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida, os dados possam ser recuperados em formato de eletroferograma ou de texto (fasta), seguindo-se da análise de bioinformática.
Técnicas Diagnósticas III
MLPA – Multiplex ligation dependent probe amplification 
Amplificação de Múltiplas Sondas Dependente de Ligação. 
• Quantificação relativa de ~50 sequências genômicas em um experimento único, baseada em PCR. 
• Detecção de deleções, duplicações e mutações de ponto conhecidas. 
• Etapas: Desnaturação do DNA, Hibridização a sondas, Ligação das sondas, Amplificação por PCR utilizando um par de primers universal.
Separação e Visualização dos produtos de amplificação: 
Reação → Leitura em aparelho de eletroforese capilar → Identificação dos fragmentos → Normalização dos dados e comparação com controles
Vantagens do método: custo relativamente baixo, simplicidade, rapidez e sensibilidade.
Técnicas Diagnósticas IIV
Array-CGH
 
• Desenvolvida inicialmente para estudo de tumores sólidos 
• Avaliação global do genoma 
• Detecção de perdas e ganhos de segmentos cromossômicos 
• Limitação: Baixa resolução (3 - 10 Mb) 
• Como surgiu? Necessidade de investigar o genoma todo em um único experimento com resolução maior que a técnica de cariótipo
• Evolução da Citogenética 
• Bandamento G (4-10Mb) 
• FISH (5-500kb) 
• Hibridização Genômica Comparativa utilizando microarrays 
• Detecção de alterações mais específicas 
• Custo elevado