Introdução e técnicas

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Histologia e Técnicas Histológicas
Organização do corpo do ser vivo
 
Célula – Tecidos – Órgãos – Sistemas - Organismo
Histologia
Parte da Ciência que estuda os tecidos e como eles se organizam para constituir os órgãos.
Histologia histos = tecido e logos = estudo (Mayer, 1819).
Tecido: “Conjunto de células semelhantes e associadas intimamente, adaptadas para funções específicas”.
Histologia
Os tecidos são constituídos por células e matriz extracelular (MEC) que estão intimamente correlacionados.
Os órgãos são quase sempre formados por uma associação precisa de vários tecidos.
Histologia
Tipos de tecidos fundamentais:
Tecido epitelial
Tecido conjuntivo
Tecido nervoso
Tecido muscular
*
Principais características dos quatro tecidos fundamentais
Tecido epitelial
Tecido conjuntivo frouxo
Tecido nervoso
Tecido muscular
Técnica Histológica
Conjunto de processos a que se submetem os tecidos a fim de que possam ser observados significativa e adequadamente permitindo o diagnóstico histológico ou patológico. 
Preparação do tecido para exame microscópico
Fixação
Desidratação
Diafanização
Inclusão/Embebição
Secções ao micrótomo/criostato
Coloração
Observação ao microscópio *
* Em alguns casos de amostras congeladas ou a fresco 
MICRÓTOMO
MICROSCÓPIO DE LUZ
PRINCÍPIO
Montagem de cortes histológicos permanentes
Primeira etapa – Coleta de material
Animais de pequeno porte como ratos, coelhos, sapos, cães e gatos são usados como cobaias para obtenção das peças histológicas através de biópsia ou necropsia.
Biópsia: Retira-se fragmento do animal vivo (punções).
Necropsia: retirada do órgão com o animal morto.
OBS: Fragmento espessura ideal de 4 – 6 mm para boa fixação.
Segunda etapa - Fixação
Tratamento da peça histológica a fim de que possamos observar ao microscópio os componentes teciduais, com a morfologia e a composição química semelhantes às existentes no ser vivo.
Visa impedir a destruição das células por suas próprias enzimas (autólise) ou por ação bacteriana e também endurecer os tecidos tornando-os mais resistentes e favoráveis às etapas subsequentes da técnica histológica.
É feito imediatamente após a retirada do material.
Fixação
Fixadores são substâncias químicas que mantêm a integridade do tecido após a morte, sem alterações da estrutura celular.
A escolha do fixador é de suma importância, pois dele vai depender os estudos que se quer fazer como também das técnicas a serem aplicadas.
Os fixadores mais utilizados em histologia são: formol 10%, formalina tamponada, glutaraldeído, etc
Para fixação de tecido ósseo deve-se realizar a descalcificação – retirada dos sais com ácidos.
Terceira etapa - Desidratação
Visa retirar a água do interior da célula a fim de permitir a impregnação da peça com parafina.
Para isto, a peça é submetida a banhos sucessivos em alcoóis de teor crescente (ex.: 70%, 80%, 90% e 100%).
Quarta etapa - Diafanização ou Clareamento
Infiltração dos tecidos por um solvente da parafina e ao mesmo tempo desalcolizante.
Xilol é o solvente mais usado e retira toda água e álcool do material para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. O tecido torna-se semi-translúcido, quase transparente. Utiliza-se 10 a 20 vezes o volume da peça. 
Outros agentes clareadores: toluol, clorofórmio, benzol, entre outros.
Quinta etapa - Impregnação ou Inclusão
Elimina xilol.
Os tecidos são submetidos a banhos de parafina a 60°C, no interior de uma estufa. Em estado líquido, a parafina penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza.
Retira-se a peça da estufa e a coloca em temperatura ambiente para solidificar.
A inclusão pode também ser feita com celoidina, gelatina ou resorcina epóxi, sendo estas últimas usadas para microscopia eletrônica.
Sexta etapa - Microtomia
Corte do material em micrótomo, aparelho que possui navalha de aço. A espessura dos cortes geralmente varia de 5 a 10 um (micrômetros) 
 (1 um = 0,001 mm). 
Mais utilizada de 4 a 6 micrômetros.
É imprescindível para que haja transparência do tecido e assim uma boa visualização.
Sétima etapa – Colagem do corte na lâmina
Os cortes provenientes da microtomia são “enrugados”. Para desfazer estas rugas, são esticados num banho de água e gelatina a 58°C, e “pescados” com uma lâmina. 
Leva-se então, à estufa a 37°C, por 2 horas, para que se dê a colagem do corte à lâmina, pela coagulação da gelatina contida na água quente.
Oitava etapa - Coloração
Tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros.
O mecanismo das colorações está relacionado a dois fatores:
Os corantes;
Os elementos a corar.
Coloração
Corantes são compostos químicos com determinados radicais ácidos ou básicos que possuem cor, e apresentam afinidade de combinação com estruturas básicas ou ácidas dos tecidos.
Os corantes podem ser:
 naturais ou sintéticos;
Coloração
corante básico - se liga aos radicais ácidos dos tecidos. Ex: hematoxilina de cor roxa cora o núcleo das células.
corante ácido - tem afinidade por radicais básicos dos tecidos. Ex: eosina de cor rosa cora o citoplasma.
Coloração
Os componentes que se combinam com corantes ácidos são chamados acidófilos e os componentes que se combinam com corantes básicos são chamados basófilos.
As colorações possuem algo em particular que as diferenciam umas das outras. Algumas são vantajosas para certos elementos e desvantajosas para outros.
Nona etapa - Desidratação
Retira a água, quando os corantes utilizados forem soluções aquosas, a fim de permitir perfeita visualização dos tecidos, pois a água possui índice de refração diferente do vidro.
Montagem
Consiste na colagem da lamínula sobre o corte, com bálsamo do Canadá, que é solúvel em xilol e insolúvel em água. 
A lamínula impede que haja hidratação do corte pela umidade do ar ambiente, permitindo então que estas lâminas se mantenham estáveis por tempo indefinido. 
Após a montagem, levam-se as lâminas à estufa, para secagem do bálsamo do Canadá.
HISTOLOGIA
Definição: É o estudo dos tecidos que compõe o organismo e o modo como eles se organizam para constituir os órgãos!
TECIDOS: - células
				 - matriz extracelular
Preparação do tecido para exame microscópico
Fixação
Desidratação
Diafanização
Inclusão/Embebição
Secções ao micrótomo/criostato
Coloração
Observação ao microscópio *
* Em alguns casos de amostras congeladas ou a fresco 
embebição
MICROSCOPIA DE LUZ (ÓPTICA)
Meios de inclusão: parafina, paraplastr ou histosecr; resina
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
Meios de inclusão: resina (epon, spurr), araldite
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Varredura da superfície do tecido ou injeção de resina plástica nos vasos sangüíneos, para observação da microvascularização
MICROSCOPIA CONFOCAL
Varredura a laser
OVÁRIO - Parafina, H&E, 10X
PLACENTA DE BÚFALA, HISTORESINA, AZUL DE TOLUIDINA
INTESTINO, PAS, PARAFINA
INTESTINO
TRICROMO DE MALLORY, PARAFINA
CORDÃO UMBILICAL
TRICROMO DE GOMORI
IMUNOISTOQUÍMICA PARA DETECTAR APOPTOSE
 PLACENTA DE BÚFALOS
MICROSCÓPIO CONFOCAL
CROMOSSOMOS - CONFOCAL
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO
PRINCÍPIO
MITOCÔNDRIA, TEM
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA OU REFLEXÃO
PRINCÍPIO
SUPERFÍCIE DA LÍNGUA, SEM
Células com mesma forma e função = tecidos