Seminário HBV e HCV

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1. HEPATITE B (HBV) E HEPATITE C (HCV)
	A hepatite é uma doença infecciosa causada por um vírus DNA da família Hepdnaviridae, que provoca inflamação das células hepáticas do portador. Sua transmissão é dada pelo contato com sangue ou secreções corporais contaminadas pelo vírus. Transfusões de sangue, relações sexuais sem camisinha e compartilhamento de agulhas, seringas e objetos perfurocortantes são as principais formas de contaminação. Após a infecção, o vírus concentra-se quase que totalmente nas células do fígado, aonde seu DNA fará o hepatócito construir novos vírus. Mães portadoras podem contaminar seus filhos durante a gestação, parto e, em casos raros, amamentação.
	Comumente a hepatite B e a hepatite C possuem um período de incubação, geralmente assintomático, que costuma variar de 30 a 180 dias, na maioria dos casos em que surgem manifestações clinicas estas costumam cessar em aproximadamente seis semanas tornando o paciente imune ao vírus, contudo, em alguns indivíduos surge uma forma cronica da doença.
1.1 HEPATITE B
1.1.1 Diagnóstico 
	O diagnóstico por teste biomolecular da hepatite B é baseado na coleta de sorologias (conforme tabela abaixo). No entanto, deve ser associado a marcadores de lesão de células (AST e ALT) e, mais recentemente, pode ser utilizado o método de PCR (polimerase chain reaction) para detectar a quantidade do vírus circulante no sangue.
1.1.2 Exames Moleculares
- PCR na detecção de HBV
	Utiliza-se o PCR nested que chama-se assim porque melhora a especificidade e a eficiência da reação, já que o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente (copiando até mesmo sequências localizadas fora dela) e depois, utilizando este primeiro produto, é amplificado a real sequência-alvo.
	As amostras de DNA foram submetidas à técnica de PCR “nested”, que utiliza duas reações de amplificação com dois pares de “primers” diferentes. Exemplos de primers externos para DNA viral: MDD2 (5’ GCG AAG CTT GAG GAA TAA AGC CCC GTA AA 3’) e HDM3 (5’ GCG CTG CAG GAG TTG GGG AGG AGA TTA3’) produzem um segmento amplificado viral de 771 pb (pares de base). Exemplos de primers internos para DNA viral: MDN5 (5’ GCG CTG CAG GAG GCT GTA GGC ATA AAT3’) e HDB2 (5’ GCG AAG CTT AGA TCT CTG GATGCT GGA 3’), originam um fragmento de 377 pb, utilizando como DNA molde o segmento ampliado da primeira reação .
	Em ambos os primers, tanto internos como externos, os componentes utilizados são os mesmos, mas em quantidades díspares. No caso dos primers MDD2 e HDM3, inicia-se a PCR com uma solução de 50 ml com 16 miliM (NH4)2SO4, 1,5mM MgCl2, 67mM Tris-HCl (pH 8,8 à 25°C), 200nM dNTP mix, 200pmol de “primers” externos, 1,25 U de enzima Super-Therm DNA polimerase e 10 micro litro de cada diluição viral extraída. Com a solução é programado a ampliação da amostra com 33 ciclos de três etapas em um termociclador (PTC-100): a primeira etapa é caracterizada pela desnaturação do DNA com a elevação da temperatura a 94ºC por minuto e tem duração de 1minuto e 40 segundos; a segunda é definida pela hibridização do primer/anelamento na temperatura de 50ºC e no tempo de 30 segundos e, na última etapa (terceira), a polimerase age na temperatura de 72ºC e com a duração de 30 segundos. 
	Já no caso dos primers internos, começa-se a PCR com uma solução idêntica a primeira, entretanto com um volume de 24ml e com um novo DNA alvo: 2mL do segmento ampliado obtido na primeira reação de PCR. Essa segunda reação, também é dividida em três etapas: a primeira etapa é caracterizada pela desnaturação do DNA com a elevação da temperatura a 94ºC por minuto e tem duração de 45 segundos, seguida de uma extensão de 30s a 94ºC; a segunda é definida pela hibridização do primer/anelamento na temperatura de 50ºC e no tempo de 30 segundos e, na última etapa (terceira), há a polimerização na temperatura de 72ºC e com a duração de 30 segundos. Em vista disso, os produtos finais são analisados por um gel de eletroforese em um gel de agarose 2%, contendo 0,5mg/mL de brometo de etídio. Assim é possível analisar quem possui a sequência do DNA viral da hepatite B. E se ela estiver presente, denota que o indivíduo está infectado.
- PCR qualitativo
	O PCR qualitativo informa ou não a presença de DNA viral. Ele é um teste sensível para a identificação de DNA do HBV e utiliza a enzima transcriptase reversa para catalisar a síntese de DNA complementar. É utilizada para amplificar o DNAc, produzindo quantidades suficientes para serem identificadas no gel de agarose. São utilizados os produtos para a amplificação: Triton X-100, dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, e 5 U de TaqADN polimerase.
	Os primers para a amplificação por PCR são escolhidos a partir de regiões do genoma do HBV que são conservadas entre os diferentes HBV estirpes que flanqueiam o segmento pré-S. Os primers do HBV são: iniciador 176 (5-GCAGGGGTCCTAGGAATCCTGATG; nucleótidos 191-168) e o iniciador 178, que foi biotinilado na extremidade 5 (5-bio GGTCACCATATTCTTGGGAACAA; nucleotídeos 2821-2843). Os primers exteriores de PCR a partir de soro são: o primer 409 (5-CATCCTGCTGCTATGCCTCA; nucleótidos 409-428) e o primer 656 (5-TGAGGCCCACTCCCATAGG; nucleótidos 656-638). Os iniciadores internos foram iniciador 252 (5-ACTCGTGGTGGACTTCTCTC; nucleótidos 252-271) e o iniciador 687 (5-TGGCACTAGTAAACTGAGCCA; nucleotídeos 687-667). A temperatura para a hibridização do primer é em 57 C.
	A PCR é pré- aquecida a 95 C. O programa de PCR inclui uma desnaturação inicial a 95 ° C para 3 minutos e extensão final foi de 72 C durante 3 min. Cada ciclo consistiu de 1 minuto a 95 C, 1 minuto a 72 C. Os números de ciclo para a amplificação são geralmente 35 durante os ensaios. 
- Carga Viral do HBV
	O acompanhamento da carga viral do HBV se tornou uma ferramenta padrão para o manejo clínico da hepatite B crônica desde o início do tratamento até o monitoramento da resposta antiviral durante ele.
	Aplicação: Quantificar o vírus da Hepatite B (HBV) circulante. Previamente ao tratamento, a determinação da carga viral pode ser utilizada como prognóstico de resposta ao tratamento. É importante também no acompanhamento dos pacientes submetidos ao tratamento antiviral e na detecção do nível de replicação viral em pacientes HBsAg positivos com mutação pré-core (HbeAg negativos, Anti-HBe positivos) e com persistência da viremia.
	 Metodologia: O material usado é o plasma (EDTA) ou soro, mas enviar preferencialmente o plasma. O volume da amostra comumente utilizado tem o valor de 2 ml (tubo primário). Após a coleta, deve-se congelar o material e para manter sua estabilidade sugere-se mantê-la à temperatura de -20º C durante 6 meses no máximo. A técnica utilizada é o PCR em Tempo Real (ver página...). A faixa dinâmica de detecção se apresenta entra 50 a 190 UI/ml. Cabe ressaltar que o paciente ao fazer o exame deve informar as medicações previamente utilizadas.
- HBV PCR qualitativo (ver figura 1)
	Aplicação: Detectar a presença do vírus da Hepatite B (HBV) circulante. É utilizado como marcador mais sensível de replicação viral em portadores crônicos, nos casos de positividade isolada para o anti-HBc (anti-HBs e HBsAg negativos) e também para a detecção de alguns mutantes que apresentam importantes modificações no HBsAg e no HBeAg, fazendo com que não sejam detectados pelos métodos imunodiagnósticos. Pode ser usado como marcador de resposta ao tratamento específico.
	Metodologia: O material usado é o plasma (EDTA) ou soro, mas enviar preferencialmente o plasma. O volume da amostra comumente utilizado tem o valor de 2 ml (tubo primário). Não é necessário jejum. Após a coleta, deve-se congelar o material e para manter sua estabilidade sugere-se mantê-la à temperatura de -20º C durante 6 meses no máximo. A técnica utilizada é o PCR (contagem de vírus no sangue. A faixa dinâmica de detecção se apresenta como 50UI/ml. Cabe ressaltar que o paciente ao fazer o exame deve informar as medicações previamente utilizadas.
- HBV PCR quantitativo (ver figura 1)
	Aplicação e metodologia: Disponibilizar a quantificaçãodo DNA-HBV (carga viral) através da técnica Real Time PCR (ver página...), processada no sistema COBAS®AmpliPrep/COBAS® TaqMan. Essa técnica apresenta alta sensibilidade analítica (12 UI/mL), larga faixa de linearidade, baixo risco de contaminação e amplificação inespecífica, grande velocidade de processamento e boa reprodutibilidade interlaboratorial. O PCR quantitativo é necessário na avaliação da indicação terapêutica para pacientes HBeAg não reagentes e no monitoramento da resposta de todos os pacientes tratados. 
- Teste de resistência ao antiviral Lamivudina (ver figura 1)
	É processado pela amplificação do gene da DNA polimerase do HBV, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), com análise por enzima de restrição (RFLP). Indicado para avaliação de falência ao esquema de tratamento com a lamivudina. Necessita-se de uma carga viral superior a 1.000 UI/mL para a sua realização. São pesquisadas as mutações de maior importância: polM552V (rtM204V), que representa a clássica mutação YMDD, polM552I (rtM204I) e polL528M (rtL180M).
- Hepatite B Genótipo Resistência Genotípica
	Aplicação: Teste para identificar o genótipo do Vírus da Hepatite B (A-H) e também para a determinação da resistência aos diversos ativirais, através da detecção de mutações relacionadas à diminuição de susceptibilidade a estes medicamentos.
	Metodologia: O exame assemelha-se aos citados anteriormente, diferindo na técnica que agora é o PCR mais o sequenciamento. O limite inferior de detecção também tem valor distinto, é 200 UI/ml.
1.2 HEPATITE C 
	O HCV é um vírus de RNA de cadeia simples, apresentando um genoma de aproximadamente 10.000 nucleotídeos que codificam 3.000 aminoácidos. Como vírus presente no sangue, o HCV pode ser transmitido através do sangue e de produtos derivados do sangue. A prevalência da infecção por HCV é elevada em pacientes receptores de transplantes de órgãos, de transfusões de sangue ou de fatores de coagulação comerciais, em pacientes com exposição percutânea por abuso de drogas por via intravenosa, e em pacientes submetidos à diálise renal. O tempo médio para desenvolvimento de anticorpos após a infecção pelo vírus da Hepatite C é de 8 a 12 semanas. Durante este período, o paciente encontra-se em infecção aguda, geralmente com grande quantidade de vírus circulante, assintomático, mas capaz de transmiti-lo. A persistência do RNA do HCV por mais de seis meses após a infecção caracteriza a infecção crônica por este vírus.
1.2.1 Diagnóstico
	O diagnóstico por teste biomolecular baseia-se na detecção do RNA do vírus através do PCR, sendo capaz de diagnosticar a infecção durante o período de janela imunológica. Este teste também é de grande utilidade na detecção do RNA do HIV em pacientes imunocomprometidos, já que é independente do estado imunológico do paciente. A detecção e quantificação do RNA do HCV por PCR oferecem uma medida de viremia ativa. Utilizando estes testes, é possível detectar viremia do HCV anterior à soroconversão imunológica, e detectar mudanças na carga viral em pacientes infectados sujeitos à terapia.
1.2.2 Exames moleculares
- Teste Qualitativo 
	Tem maior sensibilidade, pois detecta um menor número de vírus, e, ainda, é mais rápido e barato. Utilizado para diagnóstico e de cada 10 testes, um pode ter um resultado errado, devido a complexidade laboratorial do mesmo e as condições de armazenamento da amostra de sangue. É indicado para diagnóstico do HCV nos casos de:
Pacientes com sorologia positiva ou indeterminada (Elisa); 
Pacientes com antecedentes de uso de drogas endovenosas; 
Profissionais de Saúde após exposição ocupacional; 
Crianças nascidas de mães HCV positivas; 
Pacientes que sofrem hemodiálise; 
Pacientes transfundidos antes de 1992; 
Pacientes com elevação persistente de ALT (Alanina Aminotransferase) acima de uma vez e meia o limite superior de referência nos últimos seis meses; 
Pacientes imunossuprimidos; 
Para avaliação da resposta à terapia e cura em casos de Carga Viral abaixo do limite de detecção. 
	O limite de detecção é determinado pela menor concentração de HCV com taxa de detecção positiva ≥ 95% Foi observado um limite de detecção de 50UI/mL ou 135 cópias/mL para o plasma.
	Em todos os testes qualitativos executados pelo SAE é adicionado o Controle Interno para permitir a identificação de amostras contendo substâncias que interfiram com a amplificação por PCR. 
	PRÉ-TRATAMENTO: Quantitativo e Genotipagem
- Teste Quantitativo Carga Viral 
	O Teste Quantitativo por PCR (Amplicor Monitor - Roche) é um teste de amplificação de ácidos nucléicos in vitro destinado à quantificação do RNA do HCV no plasma humano. Não é utilizado como diagnóstico, e sim para o prognóstico da evolução da doença, na decisão sobre a instituição e duração da terapia antiviral, no monitoramento da terapia antiviral e na resposta virológica sustentada.
	É desnecessário realizar testes quantitativos periodicamente em indivíduos fora do tratamento, pois a carga viral não tem nenhuma relação com a gravidade e progressão da doença, ou com a agressividade do vírus. Deve ser realizado somente antes do inicio do tratamento (com interferon peguilado) e mais um ou no máximo dois, durante o tratamento, para saber se o paciente está respondendo. Sugere-se a utilização do níveis de RNA do HCV de pré-tratamento juntamente com a Genotipagem do HCV para determinar a duração da terapia. O teste quantitativo apresentou limite de detecção de 600UI/mL ou 1620 cópias/mL. A linearidade do teste é presente até 850.000 UI/mL.
	A quantificação do RNA do HCV é efetuada utilizando um padrão que acompanha cada amostra durante o PCR, este padrão compensa os efeitos da inibição e controla o processo de amplificação. O teste foi validado para plasma humano coletado em EDTA, devendo evitar-se heparina como coagulante já que a mesma tem efeitos inibitórios sobre o PCR. 
- Genotipagem
	O HCV possui inúmeros subtipos designados como : 1 a, 1 b, 2 a, 2 b, 3 a, 3 b, 4, 5 e 6. Os subtipos mais comuns nos casos de hepatite C no Brasil são 1, 2 e 3. A impotância de conhecer que subtipo de vírus esta gerando a hepatite reside na terapêutica, haja visto que genótipos 2 ou 3 respondem melhor ao tratamento com interferon convencional e os de genótipo 1 principalmente o subtipo 1 b, devem ser tratados com interferon peguilado. É necessário carga viral superior a 600UI/mL para que este exame possa ser realizado, quantidade inferiores podem não apresentar particular virais suficientes para amplificação.
	O teste somente deve ser realizado quando já esta decidida a necessidade de iniciar o tratamento, pois o resultado de este teste serve para se determinar o tempo de tratamento e a dosagem da ribavirina. O teste não fornece nenhuma informação sobre o prognostico da progressão da doença no organismo.
	A Região 5’ UTR é a mais utilizada em genotipagem do HCV para a sua detecção qualitativa e quantitativa, devido a alta conservação da região permitindo a melhora da sensibilidade, porém tem discrepância para tipos e subtipos, onde utiliza-se a NS5B. Já para diferenciação de subtipos, o mais adequado são as regiões do core, do envelope E1 e a região NS5B, sendo as de maior variabilidade E1 e NS5B e as mais conservadas Core e 5’UTR. 
	Dentro do exames de detecção do HSV descreveremos os não- comerciais e os exames comerciais.
- Genotipagem não comercial
a) RT-PCR (Transcrição reversa) + sequenciamento de nucleotídeos de regiões: fornece de modo mais preciso os diferentes subtipos que podem ser utilizados nos estudos epidemiológicos, porém é necessário utilizar diferentes protocolos até chegar ao passo final, o que demanda muito tempo. Além do mais, não identifica infecção mista.
b) PCR “primers” – Específico: determinação do genótipo se faz através de eletroforese com posterior visualização do tamanho das bandas. Utiliza um único par de primers para cada subtipo e a variabilidade no genoma nos sítios de ligação pode ocasionar uma falha na amplificação ou identificação incorreta.
c)PCR - RFLP: utiliza diferentes enzimas de restrição para diferentes genótipos. Os sítios específicos do produto da RT-PCR são digeridos por diferentes enzimas de restrição. A determinação do genótipo se dá pelo tamanho dos fragmentos após eletroforese. Processo trabalhoso e impreciso, grando parte foi substituída por métodos comerciais que não necessitam de eletroforese
Região 5’UTR: Identifica bem os principais genótipos do vírus, mas tem discrepância para tipos e subtipos
d) Genotipagem do HCV por PCR em tempo real – A técnica de PCR descrita por Kary Mulis e colaboradores (1987) apresentava uma defasagem técnica à técnica descrita por Higushi e colaboradores (1992). Higushi agregava a técnica de original um termociclador, um sistema óptico e uma câmera CCD (“Charged Coupled Device”). Em frente a fonte de luz se agrega um filtro de excitação que seleciona um comprimento de onda específico para cada fluoróforo. A luz emitida pelos fluoróforos da amostra é então selecionada e direcionada à câmera CCD que converte o sinal luminoso em um sinal eletrônico gerando um gráfico da reação. Assim no PCR em tempo real se pode controlar a quantidade do produto formada e o número de ciclos. Além dos componentes tradicionais utilizados na PCR convencional – como tampão Tris-HCl,dNTP, inicadores, Taq DNA polimerase – a PCR e tempo real necessita de um sistema de monitoramento. Esse sistema é composto por corantes fluorescente que se ligam ao produto formado e reportam sua presença por fluorescência. A medida que o produto do PCR aumenta, o sinal percebido aumenta exponencialmente durantes os primeiros ciclos da reação. Logo, o nível de sil é saturado por consumo de alguns componentes do sistema. É importante ressaltar que em um experimento PCR real time todas as curvas-resposta são saturadas no mesmo nível de fluorescência, portanto a quantificação em ponto final, como ocorre na PCR convencional, não é informativa quanto à quantidade inicial de moléculas-alvo presente na amostra e permite apenas resultados qualitativos. 
	Já no PCR em tempo real as curvas-resposta são monitoradas durante a fase exponencial da reação o que reflete a diferença na quantidade inicial de moléculas de DNA. Lembremo-nos de que o PCR em tempo real utiliza exclusivamente fluorescência como método de detecção. Os corantes aplicados à técnica atualmente são do tipo cianinas assimétricas, mas Higuchi e colaboradores utilizaram brometo de etídio , que se torna fluorescente a partir da intercalação no DNA. 
A maioria dos ensaios descritos para a detecção de DNA inicia por sondas de hidrólise de DNA (ou RNA) conhecidas como sondas TaqMan ou sondas 5’ nuclease. Essas sondas são marcadas na extremidade 5’ por um fluoróforo “repórter”, e na extremidade 3’ se une um fluoróforo “quencher”. Por transferência de energia ressonante da fluorescência – FRET, quando o “repórter” é estimulado este estimula “quencher”. Durante a PCR, quando a Taq DNA polimerase estende os inciadores, a sonda hibridizada é clivada devido á atividade 5’ exonuclease da enzima e as moléculas “reportes” e “quencher” são separadas, isso extingue o FRET . A utilização desse tipo de sonda agregue não só maior especificidade quanto maior sensibilidade de detecção quando comparados ao nested-PCR ou Southern Blot. Existem contudo poucos trabalhos utlizando PCR em tempo real para a genotipagem do VHC.
e) Outros métodos de genotipagem na região 5’UTR - Piroseqüenciamento é um método não elétroforético de seqüenciamento do DNA que monitora o pirofosfato (PPi) liberado durante a incorporação dos nucleotídeos. É rápido e acurado, elimina a necessidade de nucleotídeos marcados, mas atende a sequências de no máximo 50 nucleotídeos. Embora não seja acurado para a subtipagem por ser focado na região 5 UTR.Teste de genotipagem através da análise da mobilidade do heteroduplex que se baseia na formação de “mismatches” (quando duas moléculas divergentes de DNA são misturadas, desnaturadas e reaneladas) . Este processo gera homoduplexes e heteroduplexes e vão migrar em velocidades diferentes quando submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida. O “mismatch” reduz a mobilidade dos heteroduplexes , quanto maior a divergência entre as duas sequências maior a redução da mobilidade.
- Genotipagem comercial 
a) Hibridização reversa – Versant HCV genotype Assay/1.0 (Lipa): Baseia-se na hibridização de produtos de PCR biotinilados a sondas imobilizadas específicas para amplificar a região 5’UTR, através da RT-PCR. A detecção é realizada através de uma reação enzimática geradora de coloração púrpura, a qual fornece um resultado de interpretação visual. Há uma nova versão comercial (2.0) que utiliza a região core, que apesar de possuir maior heterogeneidade nucleotídica, não aumentou significativamente a determinção dos subtipos quando comparada à versão 1.0.
b) Sequenciamento da região 5’UTR – TruGene HCV 5 NC genotyping kit: Sequenciamento bidirecional por meio de primers marcados por diferentes fluoróforos, seguido de eletroforese e análise de dados pelo programa de sequenciamento OpenGene DNA. Cada sequenciamento bidirecional é alinhado automaticamente permitindo a determinação do genótipo baseado no percentual de identidade de sequência. Este método sofre da mesma limitação do Versant HCV genotype 1.0. no tocante a escolha da região 5’UTR como alvo da região de PCR, além de envolver etapa de sequenciamento o que demanda elevado tempo de trabalho manual, pessoal qualificado e plataforma tecnológica de alto custo nem sempre disponíveis em laboratórios de análises clínicas.
c) Invader HCV ASR – Este teste é baseado na utilização de uma enzima que cliva estruturas secundárias que são formadas quando o DNA é desnaturado e renaturado rapidamente. A enzima utilizada é a CLEAVASE I e consegue determinar o genótipo do vírus, mas não os subtipos.
d) Abbot HCV ASR – é uma reação em um só passo que utiliza o PCR em tempo real que utiliza sondas e primers específicos para determinação do genótipo do vírus. Não é tão eficiente no genótipo 4 e por isso, menos utilizado.
e) TRUGENE NS5B sequencing assay – o teste incorpora sequencias da região NS5B que são filogeneticamente mais informativas e com isso pode mostrar os subtipos do HCV.
DNA enzima imunoensaio – O teste baseado em DNA enzima imunoensaio (DEIA) . Neste, ensaio sondas marcadas genótipo específicas da região do core são ligadas em poços de placas em microdiluições. Produtos de RT-PCR são hibridizados e detectados com anticopros monoclonais específicos contra a fita dupla de DNA.
f) Ensaios de sorotipagem – Existem vários ensaios para detectar anticorpos genótipos específicos que reaja com epítopos imunodominantes . Estes anticorpos podem diferenciar os genótipos, mas não os subtipos de cada genótipo. Estes testes não são amplamente utlizados, pois não possuem a acurácia dos métodos moleculares.
2. ANEXOS
Figura 1 - Tabela explicativa de 3 exames de biologia molecular: HBV PCR quantitativo, HBV PCR qualitativo e teste de resistência à Lamivudina.
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
HEPCENTRO. Hepatite B. Disponível em: <http://www.hepcentro.com.br/hepatite_b.htm>. Acesso em: 20 março 2013.
NAKATANI, Sueli Massumi. Genotipagem do vírus da Hepatite C por PCR em tempo real com base na análise da região NS5B. 2008. 195 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/premio2009/sueli_massumi.pdf>. Acesso em: 21 março 2013.
DUARTE, Cesar Augusto Barros. Determinação do genótipo e subtipo do vírus da Hepatite C através de microarranjo líquido. 2009. 89 f. Dissertação (Doutorado) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2009. Disponível em: <http://dspace.c3sl.ufpr.br:8080/dspace/bitstream/handle/1884/18866/2815-2195428592tese%25252520de%25252520doutorado%25252520de%25252520Cesar%25252520Augusto%25252520Barros%25252520Duarte%25255B2%25255D%255B1%255D%5B1%5D.pdf?sequence=1>.Acesso em: 21 março 2013. 
GRUPO OTIMISMO DE APOIO A PORTADORES DE HEPATITE C. Os principais testes na hepatite C - Parte 1. Disponível em: <http://hepato.com/p_testes/testes_20040310.html>. Acesso em: 21 março 2013.
DESCONHECIDO. Hepatite C PCR Qualitativo, Quantitativo e Genotipagem. Disponível em: <http://www.labclin-itajuba.com.br/informativos/_hepatitec.pdf>. Acesso em: 24 março 2013. 
HERMES PARDINI. Hepatites: testes moleculares. Disponível em: <http://www3.hermespardini.com.br/pagina/download/358/hepatites.aspx>. Acesso em: 24 março 2013
CENTRO DE GENOMAS. HCV qualitativo. Disponível em: <http://www.centrodegenomas.com.br/m35/hepatites_virais/hcv_qualitativo_em_fluidos_biologicos>. Acesso em: 28 março 2013.
LIAW, YF, TSAI, SL, SHEEN, IS [et al]. Clinical and virological course of chronic hepatitis B virus infection with hepatitis C and D virus markers. 1998
LIAW, YF, TSAI, SL, CHANG, JJ [et al]. Displacement of hepatitis B virus by hepatitis C virus as the cause of continuing chronic hepatitis. Gastroenterology 1994.