Técnicas moleculares utilizadas para diagnóstico

Prévia do material em texto

Técnicas moleculares utilizadas para diagnóstico
 O diagnóstico molecular baseia-se em técnicas consagradas da biologia molecular como a PCR e suas variações visando a investigação de alvos de interesse a partir da análise do material genético, o DNA e o RNA. A PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de uma região específica do DNA de um organismo. Suas aplicações são inúmeras, desde o diagnóstico médico, mapeamento genético, detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, até identificação de bactérias que causam doenças em piscicultura. 
 No geral, podemos dizer que as técnicas da biologia molecular focam na obtenção, identificação e caracterização do material genético quer seja de um paciente ou de um agente infeccioso que esteja lhe causando uma infecção ou doença.Dentre elas, podemos destacar: 
· PCR – Reação em cadeia da polimerase
 Essa metodologia é amplamente utilizada para replicar um fragmento de material genético que desejamos estudar. Ou seja, com sua aplicação podemos obter milhares de cópias deste fragmento de interesse, possibilitando limitar-se a sua detecção, no caso da pesquisa de determinado agente infeccioso, por exemplo.
Essa pesquisa pode ser ampliada para sua quantificação e, em casos mais específicos, seguir para a técnica de sequenciamento para identificar variantes genéticas que causem refratariedade a determinado tratamento, como ocorre no caso da pesquisa do HIV.
Além disso, quando o foco da pesquisa são mutações em determinados genes do paciente, podemos simplesmente detecta-la em uma reação de PCR como depois caracterizá-la por meio do seu sequenciamento.
Esta técnica mimetiza o ciclo celular de divisão celular ou a transcrição da informação genética contida no DNA em seu produto, como em uma proteína, por exemplo.
Porém, de forma controlada e exponencial, podemos gerar milhares de cópias desta região de interesse utilizando uma enzima (DNA polimerase), a amostra de DNA é submetida a ciclos específicos de temperatura e combinado aos reagentes necessários, é possível realizar a sua cópia.
A eletroforese em gel ainda é utilizada após o PCR para verificar a presença de material genético estudado, onde o produto do PCR é aplicado em géis de agarose ou acrilamida em uma cuba e submetido a uma corrente elétrica, o material ao migrar pelo gel separa os fragmentos de DNA e RNA ou proteínas conforme seu peso molecular.
· PCR em tempo real
 A PCR em tempo real (Real Time Quantitative PCR) é uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente.
O resultado é visualizado em tempo real durante a amplificação da sequência de interesse, com capacidade ainda de gerar resultados quantitativos com maior precisão.
· PCR digital
-Já a PCR digital é a terceira geração das técnicas de PCR, que permite uma quantificação absoluta, altamente sensível de ácidos nucleicos sem a necessidade de curva padrão ou controles endógenos.
-Em uma das estratégias do sistema de PCR Digital, a amostra é dividida em milhares de partículas (gotas) que após a amplificação, estas gotas contendo a sequência alvo são detectadas por fluorescência e classificadas como positivas e gotas sem fluorescência são negativas.
-A PCR digital melhora a sensibilidade da qPCR e permite a detecção de eventos raros, tais como: mutações de um único nucleótido numa população de sequências de tipo selvagem além de ser útil na biópsia liquida, detecção de patógenos, expressão gênica e ainda análise de CNV (variação no número de cópias).
· Sequenciamento Sanger
- Na técnica de sequenciamento, o material que foi amplificado previamente no PCR, é submetido a aparelhos que têm a capacidade de identificar, de forma sequencial, as bases nitrogenadas (“letras do DNA”) que compõem o fragmento em análise.Isto permite identificar a alteração de uma única base que pode levar a uma mutação com consequente perda de função da proteína a ser codificada, o que por sua vez pode desencadear uma doença.
· Sequenciadores de nova geração (NGS)
- Atualmente, existem técnicas que permitem o sequenciamento de DNA em larga escala, é o chamado sequenciamento NGS (Next Generation Sequencing).
- Essa tecnologia permite a análise de múltiplos genes em uma única reação e é amplamente utilizada, hoje em dia, nos painéis genéticos, servindo para pesquisa de determinada doença e revelando suas características individuais, determinar o prognóstico e auxiliar no direcionamento da terapia mais efetiva.
· Southern Blot
- Menos utilizada atualmente, devido ao uso de metodologias mais sensíveis e práticas, o Southern Blot permite identificar se determinada sequência de DNA está presente em uma amostra.
- A técnica consiste, basicamente, em uma eletroforese em gel seguida de transferência para uma membrana, fixada por exposição térmica ou radiológica e revelada pelo uso de sondas com sequencia conhecida e marcadas com fluorófilos ou rádio isótopos.
· Northern Blot
- Seu princípio é semelhante ao anterior, com a principal diferença de ser utilizada para identificação e a quantificação de RNA mensageiro, que é o responsável por enviar as informações do DNA até a síntese de proteínas nas células.
· Western Blot
- Já no Western Blot, a análise e identificação é dirigida às proteínas, esse método mescla os princípios das técnicas Southern Blot e Northern Blot. 
· Clonagem molecular
- Utilizada, principalmente, em pesquisas e produção de imunobiológicos, esta técnica visa introduzir sequências específicas no DNA de uma célula e utilizar o mecanismo celular como base para a sua clonagem.Primeiramente, é necessária a presença de um sítio de clonagem conhecido que, juntamente a uma enzima específica, permite fragmentar o DNA em regiões de interesse.Utilizando a técnica de PCR, é possível replicar esses fragmentos obtidos inicialmente, obtendo-se, assim, grandes quantidades dele.
 A partir dos anos 1950, com a descoberta da estrutura do DNA (ácido desoxirribonucleico), surgiu uma nova ciência, a biologia molecular, que se revelou uma ferramenta útil no diagnóstico de doenças infecciosas. Nos últimos anos, ela vem se tornando mais conhecida dos pacientes e ganhando destaque nos laboratórios clínicos, sendo usada tanto para o diagnóstico quanto para a prevenção de doenças. Os exames realizados por biologia molecular funcionam basicamente pela amplificação do DNA do material a ser estudado, o que torna possível detectar quantidades mínimas de um vírus por meio da sua amplificação. Uma das suas grandes vantagens está em tornar os exames realizados por técnicas convencionais mais específicos.
 Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. As técnicas moleculares de diagnóstico se baseiam na detecção e na análise de sequências de genomas e os produtos da expressão de genes, permitindo uma detalhada e precisa caracterização e diferenciação de microrganismos nem sempre possível com técnicas de diagnóstico as sorológicas ou de isolamento do agente infeccioso.
· O diagnóstico molecular pode ser realizado com diversos objetivos, sendo os principais:
· Identificação de mutações relacionadas a leucemia, como por exemplo a identificação da translocação BCR-ABL, que é característica da Leucemia Mieloide Crônica (LMC);
· Mutações características de doenças hematológicas, como a hemocromatose hereditária, policitemia vera, trombocitemia essencial e trombofilias, por exemplo.
· Alterações moleculares que indiquem a ocorrência de câncer, como o câncer colorretal, pulmonar, mama e cerebral, por exemplo;
· Diagnóstico de doenças infecciosas, como hepatites, uretrites, toxoplasmose, leishmaniose, etc, além da identificação do vírus HPV.
 
 O diagnóstico molecular, apesar de ser considerado caro quando comparado com outras técnicas diagnósticas, é mais preciso, pois é capaz de informar qual a alteraçãorelacionada com determinada doença e o grau de influência dessa alteração no organismo, auxiliando, assim o tratamento da pessoa.Além de ser usado para o diagnóstico de diversas doenças, as técnicas moleculares também são utilizadas para avaliar a resposta ao tratamento, principalmente em pessoas com câncer, sendo um dos métodos mais eficazes para indicar evolução da doença e recaída.
 
 O diagnóstico molecular pode ser realizado com qualquer amostra, sendo solicitado pelo médico aquela que pode melhor fornecer informações sobre o estado do paciente, podendo ser urina, saliva ou, na maioria da vezes, sangue. Não é necessário jejum ou qualquer outro preparo para a realização do exame. A amostra é coletada e encaminhada ao laboratório juntamente com a orientação do médico informando o exame ou tipo de pesquisa que deverá ser feita. A técnica molecular realizada depende do exame solicitado e envolve uma série de procedimentos precisos que tem como objetivo final identificar a presença ou ausência da alteração solicitada pelo médico. Normalmente só é utilizada uma pequena quantidade de amostra enviada, sendo o resto armazenado para que, caso haja necessidade, o exame seja repetido.
Alunas: Laiana, Larissa, Sarah e Nildimara.
Turma19 A